茶葉基質(zhì)對(duì)膽堿酯酶活性干擾水平的研究進(jìn)展

鄭芹芹 金莉莉 吳正浩 陳紅平 郝振霞 魯成銀

摘要：基于酶抑制法的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、易操作、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在基質(zhì)成分較為簡(jiǎn)單的蔬菜、水果樣品的質(zhì)量安全快速篩查和監(jiān)管中發(fā)揮了重要作用。然而，在對(duì)茶葉樣品的檢測(cè)中，該方法的速測(cè)結(jié)果普遍呈強(qiáng)（假）陽(yáng)性，且檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際農(nóng)藥含量水平無(wú)關(guān)，嚴(yán)重阻礙了其在茶葉樣品檢測(cè)中的應(yīng)用。明確茶葉樣品中基質(zhì)對(duì)膽堿酯酶干擾的來(lái)源、水平與機(jī)理是解決這一難題的理論基礎(chǔ)。文章綜述了茶葉基質(zhì)成分對(duì)膽堿酯酶活性干擾水平的研究進(jìn)展，同時(shí)包含了近年來(lái)茶葉功能性成分通過(guò)抑制膽堿酯酶活性在阿爾茨海默癥（AD）治療中應(yīng)用的研究?jī)?nèi)容。

關(guān)鍵詞：酶抑制法;茶葉;基質(zhì)干擾;膽堿酯酶;農(nóng)藥殘留;快速檢測(cè)

Research Progress on the Interference Level of

Tea Matrix on Cholinesterase Activity

ZHENG Qinqin1， JIN Lili2， WU Zhenghao1，3， CHEN Hongping1，4， HAO Zhenxia1，4*， LU Chengyin1，4*

1. Tea Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310008， China;

2. Changzhou Industrial and Consumer Goods Inspection Co.， Ltd.， Changzhou 213000， China;

3. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081; 4. Quality and Safety

Risk Assessment Laboratory of Tea Products， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Hangzhou 310008， China

Abstract： The rapid detection of pesticide residues based on enzyme inhibition assay presents the merits of simplicity， rapidity， easy-operation and low cost. It has played an important role in screening and supervision of the quality and safety of vegetable and fruit samples. However， when applied on tea sample detections， false positive results are easily obtained and the results have nothing to do with the actual pesticide residue level， which prevents the application in real samples. Identification of the source， level and mechanism of matrix interferences with cholinesterase in the tea samples is the theoretical basis for solving this problem. This article reviewed the research progress of tea matrix components on the interference of cholinesterase activity， as well as recent researches on the application of tea functional components in the treatment of Alzheimer's disease （AD） through inhibiting cholinesterase activity.

Keywords： enzyme inhibition assay， tea， matrix interference， cholinesterase， pesticide residues， rapid detection

茶葉被譽(yù)為“世界三大飲料”之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)和健康價(jià)值。近年來(lái)，茶葉中的農(nóng)藥殘留問(wèn)題引起越來(lái)越多的關(guān)注。對(duì)消費(fèi)者而言，盡管茶葉例行監(jiān)測(cè)的平均合格率已達(dá)到98%[1]，但2%的不合格率依然是痛點(diǎn)問(wèn)題;在企業(yè)層面，由于常規(guī)儀器檢測(cè)無(wú)法及時(shí)動(dòng)態(tài)追蹤茶鮮葉的農(nóng)藥殘留水平[2]，導(dǎo)致對(duì)生產(chǎn)原料的監(jiān)控困難，產(chǎn)品質(zhì)量難以有效保證。農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)對(duì)于保障茶葉質(zhì)量安全及茶產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展有著重要意義。酶抑制法是目前為止發(fā)展最為成熟、應(yīng)用最為廣泛的農(nóng)殘速測(cè)技術(shù)，其利用有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶（以乙酰膽堿酯酶AChE和丁酰膽堿酯酶BChE為主）的抑制作用進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，當(dāng)樣品中不含有這兩類農(nóng)藥成分時(shí)，膽堿酯酶可以正常催化、水解底物生成一定量的產(chǎn)物，顯現(xiàn)出顏色信號(hào)[3]或電化學(xué)信號(hào)[4];而當(dāng)待測(cè)樣品中含有農(nóng)藥時(shí)，膽堿酯酶活性受到農(nóng)藥的抑制而難以正常催化、水解底物，致使相應(yīng)的檢測(cè)信號(hào)減弱甚至消失。酶抑制法通過(guò)直觀的信號(hào)變化即可判斷樣品中的農(nóng)藥殘留水平，由此減少了常規(guī)農(nóng)殘檢測(cè)方法中對(duì)儀器、場(chǎng)地和專業(yè)檢測(cè)人員的硬性需求，展現(xiàn)出了較強(qiáng)的靈活性和巨大的應(yīng)用潛力，檢測(cè)時(shí)間和成本大幅降低[5]，該方法在蔬菜、水果等簡(jiǎn)單基質(zhì)樣品中已廣泛應(yīng)用[6-8]。

隨著研究深入，酶抑制法也被嘗試應(yīng)用于茶葉樣品的速測(cè)中。但茶葉中含有較多生物活性成分，如茶多酚、咖啡堿等[9]，具有抗氧化、抑菌抑酶等生理活性[10-12]，對(duì)酶反應(yīng)干擾嚴(yán)重，檢測(cè)結(jié)果可靠性差[13-14]。因此，探究茶葉速測(cè)中基質(zhì)干擾的具體來(lái)源及干擾機(jī)制是解決茶葉基質(zhì)對(duì)酶抑制法速測(cè)產(chǎn)生干擾問(wèn)題、實(shí)現(xiàn)可靠速測(cè)的研究基礎(chǔ)。本文綜述了不同茶葉基質(zhì)成分對(duì)膽堿酶活性干擾的研究進(jìn)展，以期為酶抑制法對(duì)茶葉樣品的抗干擾速測(cè)研究提供理論參考，進(jìn)一步為酶抑制法速測(cè)在復(fù)雜基質(zhì)樣品中的應(yīng)用提供研究思路。

1? 茶葉樣品在酶抑制法農(nóng)藥殘留速測(cè)中的基質(zhì)干擾

茶葉樣品在基于酶抑制法的農(nóng)殘速測(cè)中的假陽(yáng)性現(xiàn)象近年來(lái)引起研究者的關(guān)注。趙超群[13]采用酶抑制法對(duì)比了茶鮮葉和成品茶的農(nóng)殘速測(cè)檢測(cè)效果，結(jié)果顯示茶鮮葉和成品茶的檢測(cè)中均存在明顯假陽(yáng)性，并且茶鮮葉中敵敵畏、敵百蟲(chóng)的檢出限（分別為0.07 mg/kg、0.32 mg/kg）低于成品茶（分別為0.28 mg/kg、1.26 mg/kg）。金莉莉[14]探究了不同茶葉基質(zhì)成分對(duì)酶檢測(cè)體系的具體影響，結(jié)果顯示咖啡堿和（-）-表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）對(duì)AChE活性呈現(xiàn)出明顯的抑制作用，從原理上證實(shí)了這兩種茶葉基質(zhì)成分均會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)假陽(yáng)性。

為了減少基質(zhì)成分對(duì)酶反應(yīng)體系的干擾，提高酶抑制法在茶葉中檢測(cè)的準(zhǔn)確度，有研究者在將現(xiàn)有酶抑制法用于茶葉樣品中的農(nóng)殘速測(cè)時(shí)，增加了溶劑置換、酸堿調(diào)節(jié)、脫色處理等較為繁復(fù)的樣品前處理步驟[15-18]。在《茶中有機(jī)磷及氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留量的簡(jiǎn)易檢驗(yàn)方法? 酶抑制法》（GB/T 18625—2002）速測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中[15]，茶葉樣品也需經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑提取、緩沖液復(fù)溶及提取液氧化、還原等步驟后才可以展開(kāi)酶反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。黃敏[16]設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)的茶葉中農(nóng)藥殘留酶抑制速測(cè)卡，采用酸度調(diào)節(jié)劑使茶葉提取液pH值調(diào)節(jié)至4～5范圍內(nèi)，再用小柱層析后將收集到的濾液進(jìn)行測(cè)試。針對(duì)茶葉色素的干擾，李彥杰[18]在基于單酯酶比色陣列系統(tǒng)檢測(cè)茶葉農(nóng)藥殘留的研究中提出了要對(duì)茶葉進(jìn)行脫色處理。額外的前處理操作，在改善茶葉樣品檢測(cè)基質(zhì)干擾的同時(shí)，也大大增加了操作的復(fù)雜性和專業(yè)程度，提高了方法及產(chǎn)品的使用門檻，無(wú)形中背離了快速檢測(cè)的初衷。

目前，茶葉基質(zhì)干擾是阻礙酶抑制法農(nóng)殘速測(cè)技術(shù)有效應(yīng)用于茶葉檢測(cè)的主要因素，探究茶葉中對(duì)酶反應(yīng)干擾的具體基質(zhì)成分及干擾原理對(duì)進(jìn)一步解決酶抑制法農(nóng)殘速測(cè)應(yīng)用中茶葉基質(zhì)的干擾問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)可靠速測(cè)具有重要指導(dǎo)意義。

2? 茶葉基質(zhì)成分與膽堿酯酶的相互作用

膽堿酯酶主要分為AChE和BChE。其中AChE主要存在于動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)中，通過(guò)水解乙酰膽堿來(lái)終止神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)突觸后膜的興奮作用，保證神經(jīng)信號(hào)在生物體內(nèi)的正常傳遞。有機(jī)磷（OP）和氨基甲酸酯（CM）類殺蟲(chóng)劑通過(guò)抑制昆蟲(chóng)體內(nèi)的AChE活性造成神經(jīng)毒性，實(shí)現(xiàn)殺蟲(chóng)的目的。因而通過(guò)測(cè)定樣品對(duì)膽堿酯酶的活性抑制程度，可以快速篩查樣品中的農(nóng)藥水平。AChE是目前市面上絕大多數(shù)酶抑制法農(nóng)殘速測(cè)中所采用的生物酶，對(duì)其活性抑制水平的準(zhǔn)確測(cè)定是該速測(cè)方法的關(guān)鍵。

目前關(guān)于茶葉基質(zhì)對(duì)酶抑制法基質(zhì)干擾的直接研究較少，文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，茶葉中所含的多種活性成分均可通過(guò)抑制AChE活性、降低神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的分解來(lái)治療阿爾茲海默癥（AD），因而科學(xué)家們進(jìn)行了大量關(guān)于茶葉中活性成分與膽堿酯酶相互作用的研究，這些研究結(jié)果在解決AD治療難題的同時(shí)，也為我們探究茶葉基質(zhì)對(duì)酶抑制法檢測(cè)干擾的原因提供了可靠數(shù)據(jù)[19-20]。

2.1? 茶多酚對(duì)膽堿酯酶活性的影響

茶多酚是一類存在于茶樹(shù)中的多元酚混合物，占茶葉干物質(zhì)質(zhì)量的18%～36%，是茶葉中重要的生物活性成分[9]。茶葉中的多酚類物質(zhì)包括兒茶素、黃酮和黃酮醇類、花色素類、酚酸及縮酚酸類等，前3類化合物均具有2-苯基苯并吡喃的基本結(jié)構(gòu)，統(tǒng)稱為類黃酮化合物[21]。

茶多酚對(duì)膽堿酯酶表現(xiàn)出顯著的抑制作用，且抑制水平與茶多酚濃度呈正相關(guān)。Kim等[22]發(fā)現(xiàn)茶多酚對(duì)失憶小鼠大腦中AChE活性具有明顯的抑制作用，且茶多酚濃度越高，其對(duì)酶活性的抑制率也越大，酶活性被抑制一半時(shí)所需底物濃度（IC50）為248 μg/mL。Chung等[23]研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚對(duì)人體神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中AChE的活性具有相似的抑制效果。

進(jìn)一步研究中，研究者們運(yùn)用Ellman方法篩選出對(duì)膽堿酯酶有抑制作用的具體多酚類化合物，同時(shí)進(jìn)一步結(jié)合分子對(duì)接模擬實(shí)驗(yàn)、酶動(dòng)力學(xué)、熒光滴定法等手段，從茶多酚類物質(zhì)與酶的結(jié)合能值（Ea）、米氏常數(shù)（Km）、親和力等角度研究茶多酚對(duì)膽堿酯酶的影響，證實(shí)了不同的多酚成分對(duì)膽堿酯酶的抑制作用。

2.1.1? 兒茶素對(duì)酶活性的影響

兒茶素類物質(zhì)是茶多酚的主體成分，占茶多酚總量的70%～80%，是茶葉的主要功能性成分[9]。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)的不同，茶葉中的兒茶素類化合物可以分為多種類型。其中EGCG、（-）-表沒(méi)食子兒茶素（EGC）、（-）-表兒茶素-沒(méi)食子酸酯（ECG）和（-）-表兒茶素（EC）為含量最高的4種兒茶素，分別約占兒茶素總量的59%、19%、13.6%和6.4%[24]。

在典型兒茶素對(duì)膽堿酯酶抑制作用的研究中，酯型兒茶素（如EGCG、ECG等）對(duì)AChE的抑制作用高于非酯型兒茶素（如EGC、EC等），其中EGCG呈現(xiàn)出最明顯的抑制作用[25]。Meng等[26]基于Ellman方法篩查了13種茶葉成分對(duì)酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)EGCG和ECG（來(lái)源于白毛茶）可明顯抑制AChE活性，相應(yīng)IC50值分別為0.124 μmol/L和0.102 μmol/L。Ali等[27]利用AutoDock 4.2軟件進(jìn)行了分子模擬實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為4種兒茶素單體（EGCG、EGC、ECG、C）均可抑制AChE 和BChE的活性。其中，EGCG與AChE、BChE結(jié)合所需的能量值最低（分別為-60.49 kJ/mol和-55.67 kJ/mol），ECG與兩種酶的結(jié)合能值（分別為-59.77 kJ/mol和-50.15 kJ/mol）水平與EGCG相當(dāng)，表明EGCG和ECG抑制兩種酶活性的能力相近。Srividhya等[28]將EGCG與AChE進(jìn)行分子對(duì)接計(jì)算，發(fā)現(xiàn)兩者的結(jié)合自由能僅為28.17 kJ/mol，表明EGCG易與AChE結(jié)合，能夠明顯抑制AChE的活性。據(jù)Salazar等[29]報(bào)道，EGCG對(duì)人體紅細(xì)胞膜上AChE活性的抑制作用較強(qiáng)，其IC50值為18.5 μmol/L。同時(shí)，酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)顯示EGCG與AChE反應(yīng)的Km值最低為3.707，與實(shí)驗(yàn)所測(cè)的IC50水平相符合。

除上述幾種主要的兒茶素成分外，其他兒茶素成分對(duì)膽堿酯酶活性也具有一定的抑制作用。Mazumder等[30]通過(guò)計(jì)算模擬分子對(duì)接的方法研究了（+）-C、EC、EGC、EGCG 4種兒茶素分別與AChE、BChE的結(jié)合能力，并綜合MolDoc和氫鍵兩種效果評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)除EGCG表現(xiàn)為最強(qiáng)抑制效果外，其余3種兒茶素對(duì)AChE和BChE也有較強(qiáng)的抑制能力。Wang等[31]發(fā)現(xiàn)紫娟茶中3種羥基肉桂酰化的新型兒茶素（HCCs）對(duì)AChE具有較強(qiáng)的抑制作用，這3種新型兒茶素為表兒茶素3-O-咖啡酸酯（ECC）、表沒(méi)食子兒茶素3-O-P-對(duì)香豆酸酯和表沒(méi)食子兒茶素-3-O-阿魏酸酯，其抑制AChE的IC50值分別為2.49 μmol/L、11.41 μmol/L、62.26 μmol/L;分子模擬結(jié)果顯示，ECC具有最低的結(jié)合常數(shù)（Ki）和結(jié)合能（Ea），抑制能力在這3種兒茶素中最強(qiáng)。

綜合以上文獻(xiàn)報(bào)道，酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定數(shù)據(jù)和分子對(duì)接模擬計(jì)算結(jié)果均顯示，EGCG是兒茶素類物質(zhì)中最強(qiáng)的膽堿酯酶抑制劑，其抑制酶活性的IC50值在0.124～18.5 μmol/L之間[26，29]（表1）;同時(shí)，EGCG也是茶葉中含量最高的兒茶素成分。所以，在酶抑制法測(cè)定茶葉中農(nóng)藥殘留的研究和應(yīng)用中，應(yīng)首先考慮EGCG的干擾作用。此外，ECG（IC50=0.102 μmol/L）[26]對(duì)酶活性的影響也需納入研究中，其他兒茶素類由于在茶葉中含量較少，抑制酶的能力相對(duì)較弱，在酶抑制法干擾研究中可作為次要考察因素。

2.1.2? 黃酮及黃酮苷類對(duì)酶活性的影響

茶葉中的黃酮及黃酮苷類物質(zhì)按化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為黃酮、黃酮醇和黃酮苷3類。黃酮在干茶中的含量約為0.7 mg/g，主要包括芹菜素和木犀草素[32];黃酮醇在干茶中的含量約為4 mg/g，主要有槲皮素（含量最高可達(dá)2.1 mg/g）、山奈素和楊梅素[32];黃酮苷類物質(zhì)（由黃酮醇與糖結(jié)合形成）約占茶葉干重的0.8%[33]，主要有槲皮苷、山奈苷、蘆丁等，其中槲皮苷含量最高[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，黃酮及其苷類物質(zhì)對(duì)膽堿酯酶表現(xiàn)出不同程度的活性抑制作用，其中槲皮素是黃酮類物質(zhì)中最有效的膽堿酯酶抑制劑。Orhan等[34]通過(guò)Ellman方法測(cè)定目標(biāo)物對(duì)酶的抑制率數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)槲皮素在1 mg/mL質(zhì)量濃度下對(duì)AChE和BChE的抑制率分別為76.2%和46.8%。與膽堿酯酶標(biāo)準(zhǔn)抑制劑加蘭他敏在相同濃度下對(duì)兩種酶的作用效果（抑制率分別為99.8%和80.3%）相比較，認(rèn)為槲皮素是AChE的有效抑制劑。另外，該研究中用同樣的方法測(cè)定膽堿酯酶活性變化，發(fā)現(xiàn)茶葉中其他黃酮類物質(zhì)對(duì)兩種酶均無(wú)抑制作用。Ademosun等[35]在體外研究中觀察到槲皮素和蘆丁對(duì)AChE、BChE活性均顯示出濃度相關(guān)的抑制作用?；贓llman方法的改良分光光度法測(cè)定酶活性，研究了槲皮素和蘆丁分別對(duì)AChE和BChE活性的影響水平，槲皮素對(duì)兩種酶抑制的IC50值分別為0.181 mmol/L、0.203 mmol/L，蘆丁的相應(yīng)IC50值分別為0.219 mmol/L、0.288 mmol/L，兩者對(duì)AChE和BChE活性均有明顯的抑制作用，且槲皮素的酶抑制作用稍高于蘆丁。Khan等[36]研究了4種黃酮類物質(zhì)分別對(duì)AChE、BChE活性的影響，槲皮素抑制兩種酶的IC50值分別為353.86 μmol/L、420.76 μmol/L，與前述報(bào)道結(jié)果相當(dāng);但蘆丁對(duì)兩種酶無(wú)明顯抑制作用（在高濃度下對(duì)酶的抑制率低于50%）;酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究顯示槲皮素對(duì)兩種酶均表現(xiàn)出競(jìng)爭(zhēng)性的抑制作用，槲皮素在AChE和BChE活性位點(diǎn)的對(duì)接計(jì)算中顯示出較低的對(duì)接能值（-268.48 kJ/mol、

-281.92 kJ/mol）和結(jié)合能值（-1.59 kJ/mol、

-1.98 kJ/mol），此結(jié)果與酶活性測(cè)定結(jié)果相吻合。

黃酮類物質(zhì)對(duì)酶的抑制作用與分子結(jié)構(gòu)中的羥基數(shù)量有關(guān)，研究者們將分子對(duì)接結(jié)果與其結(jié)構(gòu)相聯(lián)系，總結(jié)了可能的構(gòu)效關(guān)系。Katalini?等[37]使用分子對(duì)接模擬軟件計(jì)算確定8種黃酮類化合物對(duì)BChE存在可逆抑制作用，抑制能力由大到小順序?yàn)楦吡冀兀?.9 μmol/L）、芹菜素（37.4 μmol/L）、山奈素（43.1 μmol/L）、槲皮素（68.0 μmol/L）、楊梅素（71.0 μmol/L）、漆黃素（90.0 μmol/L）、木犀草素（166.1 μmol/L）、蘆丁（501.2 μmol/L），由此推測(cè)類黃酮物質(zhì)分子中側(cè)苯基環(huán)上的-OH數(shù)量越少對(duì)BChE抑制作用越強(qiáng)。Xie等[38]用Ellman方法測(cè)定黃酮類物質(zhì)抑制酶活性的水平，并通過(guò)熒光滴定法測(cè)定其與酶結(jié)合的親和力，從分子結(jié)構(gòu)角度解釋了其對(duì)AChE的活性抑制能力。如表2所示，漆黃素5'（A環(huán)）位置上的羥基化使其抑制AChE活性作用增大了20.4倍，山奈素3'（B環(huán)）位置的羥基化使其對(duì)酶活性的抑制作用增大了6.3倍。黃酮類化合物A環(huán)和B環(huán)中的羥基增加了其與AChE的親和力，使得其對(duì)AChE活性的抑制作用增強(qiáng)。

整體看來(lái)，雖然不同實(shí)驗(yàn)方法所得出的黃酮及其苷類對(duì)膽堿酯酶的抑制作用不同，槲皮素對(duì)AChE和BChE的抑制作用最強(qiáng)，IC50值分別為0.181～15.7 mmol/L和0.203～0.421 mmol/L。從構(gòu)效關(guān)系上看，黃酮及其苷類物質(zhì)B環(huán)上的羥基對(duì)其抑制AChE和BChE活性影響效果相反，以山奈素和槲皮素為例（山奈素比槲皮素在B環(huán)少1個(gè)羥基），山奈素對(duì)AChE抑制能力低于槲皮素，而對(duì)BChE抑制能力高于槲皮素[38]。

綜合以上研究報(bào)道，在酶抑制法應(yīng)用于茶葉中農(nóng)殘速測(cè)的研究中，黃酮類物質(zhì)對(duì)結(jié)果的干擾情況應(yīng)根據(jù)具體的酶反應(yīng)體系加以判斷;考慮到槲皮素是茶葉中含量最高的黃酮醇，可以選擇受槲皮素影響小的酶體系，或者優(yōu)先考慮選擇性去除槲皮素成分以降低基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。當(dāng)綜合考慮茶葉中的實(shí)際含量時(shí)，黃酮類物質(zhì)對(duì)酶活性的影響應(yīng)遠(yuǎn)小于兒茶素類成分。

2.1.3? 酚酸和縮酚酸類對(duì)酶活性的影響

酚酸屬于芳香族化合物，其分子中含有羧基和羥基，兩分子的酚酸通過(guò)羧基與羧基之間的相互作用縮合形成縮酚酸[9]。茶葉中的酚酸類含量較少，主要包括沒(méi)食子酸（含量0.5%～4.0%）、鞣花酸（含量0.1%～3.2%）、綠原酸（含量0.1%～0.4%）、咖啡酸和對(duì)香豆酸（含量均不超過(guò)0.02%），這5種酚酸類物質(zhì)的總量在0.8%～5.0%之間[39]。酚酸類化合物具有茶多酚物質(zhì)共有的生理功能，對(duì)茶葉品質(zhì)也有重要的影響，如沒(méi)食子酸可以參與兒茶素的氧化而形成茶黃素類物質(zhì)[40]。

有研究報(bào)道指出，沒(méi)食子酸可以中度抑制AChE的水解活性，IC50值為2.99 μmol/mL，其熱水解產(chǎn)物鄰苯三酚表現(xiàn)出更強(qiáng)的酶抑制作用，IC50值為0.18 μmol/mL，是沒(méi)食子酸的抑制能力的16倍[25]。Akomolafe等[41]篩選了3種酚酸類物質(zhì)，研究其對(duì)膽堿酯酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸對(duì)AChE幾乎無(wú)抑制作用，在1 mg/mL質(zhì)量濃度下對(duì)BChE有中度抑制作用，抑制率為48.8%;綠原酸和咖啡酸對(duì)AChE和BChE均無(wú)抑制作用;作者以咖啡酸飼喂大鼠后，測(cè)定大鼠大腦勻漿和大腦皮層中的AChE活性，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)咖啡酸單獨(dú)給藥對(duì)酶的活性無(wú)影響（與對(duì)照組相比）。

沒(méi)食子酸是茶葉中含量最高的酚酸類物質(zhì)，且目前的研究中，只有它表現(xiàn)出了對(duì)AChE和BChE活性的抑制作用。因此，在茶葉快速檢測(cè)中只需排除沒(méi)食子酸單一酚酸類干擾物質(zhì)的影響。另外，酚酸類物質(zhì)在茶葉中總體含量較低，而且整體對(duì)酶的抑制活性不明顯，也可忽略其對(duì)檢測(cè)體系中的酶干擾作用。

2.2? 咖啡堿對(duì)酶活性的影響

咖啡堿又名1，3，7-三甲基黃嘌呤，屬于嘌呤堿（即由1個(gè)嘧啶環(huán)和1個(gè)咪唑環(huán)稠合而成），是茶葉中含量最高的生物堿類化合物，占茶葉干重的2%～4%[9]。咖啡堿呈苦味，是影響茶葉滋味的重要理化成分之一，多存在于茶樹(shù)的幼嫩芽葉中，其含量常被人們作為評(píng)判真假茶葉的重要指標(biāo)之一[42]。

Fabiani等[43]研究發(fā)現(xiàn)紅茶的甲醇提取物對(duì)AChE活性抑制的IC50值可達(dá)0.043 mg/mL，后用二氯甲烷萃取提取物，經(jīng)色譜分離后組分3對(duì)酶活性的抑制作用最強(qiáng)，經(jīng)鑒定該組分為咖啡堿。Okello等[25]試驗(yàn)測(cè)定咖啡堿體外抑制AChE（電鰻提取）的IC50為0.25 μmol/ml。Akomolafe等[41]給大鼠飼喂50 mg/kg咖啡堿，7 d后大鼠腦勻漿和大腦皮層中AChE活性分別被抑制16%、13%。

除了通過(guò)測(cè)定咖啡堿的膽堿酯酶活性抑制水平外，研究者們對(duì)咖啡堿的抑制機(jī)理也進(jìn)行了探索，但不同實(shí)驗(yàn)室所得出的結(jié)論具有較大差異。Pohanka等[44]根據(jù)Dixon圖判斷咖啡堿是AChE和BChE的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，其對(duì)AChE的Ki值是BChE近8萬(wàn)分之一（對(duì)兩種酶的Ki分別為：175 μmol/L ± 9 μmol/L、13.9 mol/L ± 7.4 mol/L）;分子對(duì)接計(jì)算顯示咖啡堿對(duì)AChE具有較低的結(jié)合能（?28.05 kJ/mol），因而咖啡堿可以有效抑制AChE的活性。Stoytcheva等[45]將牛紅細(xì)胞中AChE固定在電化學(xué)生物傳感器上，采用電化學(xué)方法分析抑制劑對(duì)酶的影響，其結(jié)果顯示咖啡堿是AChE的有效競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，Ki為0.75 μmol/L，約是標(biāo)準(zhǔn)抑制劑加蘭它敏的2倍。

咖啡堿是AChE的有效抑制劑，但對(duì)BChE幾乎無(wú)抑制作用。因而，在酶抑制法應(yīng)用中可以通過(guò)酶源的篩選排除或降低檢測(cè)樣品中咖啡堿的基質(zhì)干擾。另外，目前已有的文獻(xiàn)報(bào)道中咖啡堿對(duì)AChE的抑制機(jī)理并無(wú)一致的結(jié)論，需要進(jìn)一步研究探索。

2.3? 茶葉提取物對(duì)酶活性的影響

茶葉提取物一般是由茶葉經(jīng)過(guò)提取、過(guò)濾、濃縮、萃取、干燥、粉碎、過(guò)篩等制備工序而獲得，主要成分包括茶多酚（EGCG、ECG、EC等）、少量的咖啡堿和沒(méi)食子酸等[46]。

不同種類的茶葉提取物對(duì)膽堿酯酶均具有一定的抑制作用并呈現(xiàn)出濃度依賴性的抑制關(guān)系。Min等[47]通過(guò)Ellman方法實(shí)驗(yàn)測(cè)定，明確綠茶提取物（GTE）是酶的潛在抑制劑，在質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時(shí)，其對(duì)固定化AChE的抑制率為54.6%。Mathiyazahan等[48]用基于ELISA方法測(cè)定大鼠的海馬體和大腦皮層中AChE活性，與AlCl3處理的大鼠相比，紅茶提取物（BTE）聯(lián)合給藥顯著且劑量依賴性地抑制AChE活性。當(dāng)實(shí)驗(yàn)組大鼠飲水中BTE添加量為3%時(shí)，大鼠海馬體和大腦皮層中AChE活性最低。Okello等[25]采用Ellman比色法在96平底孔板上測(cè)定酶活性，結(jié)果顯示GTE和白茶提取物（WTE）對(duì)AChE均有濃度相關(guān)的抑制作用，兩者在實(shí)驗(yàn)最高質(zhì)量濃度28.4 μg /mL時(shí)對(duì)AChE抑制率分別為80.4%、85.7%，IC50值分別為8.06 μg / mL和7.20 μg / mL。作者指出，GTE 和WTE本身含有相似水平的EGCG、ECG、可可堿和咖啡堿，但同時(shí)GTE含有較高水平的黃酮醇衍生物而WTE含有較高水平的葡萄糖衍生物。但它們化學(xué)成分的差異部分并沒(méi)有顯著影響其對(duì)AChE抑制。Okello等[49]還發(fā)現(xiàn)GTE和BTE對(duì)AChE和BChE活性的抑制效果與濃度水平正相關(guān)，且同濃度下抑制水平幾乎相同，具體表現(xiàn)在兩者對(duì)AChE和BChE抑制的IC50值相近。劉德等[50]研究了6種茶葉提取物對(duì)AChE的抑制作用，認(rèn)為綠茶、紅茶、烏龍茶、白茶等4種茶葉提取物對(duì)AChE的抑制率存在顯著差異，結(jié)論與Okello等的研究結(jié)果不同。推測(cè)這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果的差異可能由茶葉提取中所用溶劑不同，造成了實(shí)際獲得的提取物成分組成具有較大差異。

3? 總結(jié)與展望

基質(zhì)干擾是目前茶葉樣品農(nóng)藥殘留速測(cè)中存在的主要問(wèn)題，基質(zhì)成分對(duì)膽堿酯酶活性的影響是造成這一問(wèn)題的最重要的原因之一。茶多酚、咖啡堿等茶葉功能性成分與膽堿酯酶的相互作用在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有比較深入的研究，值得在茶葉速測(cè)方法的研究中加以借鑒和應(yīng)用。

茶葉基質(zhì)成分組成復(fù)雜，茶多酚、生物堿等不同基質(zhì)對(duì)膽堿酯酶活性具有不同的影響水平。其中，含量高且種類多的是多酚類物質(zhì)。EGCG是茶葉多酚類物質(zhì)的典型代表，其對(duì)膽堿酯酶（AChE、BChE）均具有顯著的抑制作用。以咖啡堿為代表的生物堿類成分含量水平雖不及茶多酚，但是膽堿酯酶對(duì)其響應(yīng)非常靈敏?？Х葔A能夠有效抑制AChE的活性，而幾乎對(duì)BChE無(wú)影響，且其抑制AChE活性的機(jī)理目前文獻(xiàn)中尚無(wú)一致結(jié)論。因而，在解決茶葉樣品酶抑制法農(nóng)殘速測(cè)中的基質(zhì)干擾問(wèn)題時(shí)，首先應(yīng)考慮降低茶多酚（特別是EGCG）和咖啡堿的干擾作用，可在前處理中利用特定吸附劑選擇性去除這兩類基質(zhì)成分。同時(shí)，也可考慮選擇BChE體系檢測(cè)以減少咖啡堿對(duì)檢測(cè)體系的干擾。另外，已有研究中明確了茶葉基質(zhì)與膽堿酯酶的分子結(jié)合位點(diǎn)，在具體的結(jié)合位點(diǎn)對(duì)酶進(jìn)行一定的修飾，改變結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基結(jié)構(gòu)，也是抗干擾檢測(cè)可嘗試的研究思路之一。

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