李雪寶 王琦 鄢波

摘 要：? 為探究纖枝短月蘚LEA2基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)特征，該研究以纖枝短月蘚為材料，首次利用PCR克隆技術(shù)得到纖枝短月蘚BeLEA2基因序列，并對(duì)該基因進(jìn)行分析。結(jié)果表明：（1）該基因序列中含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，其開放閱讀框（ORF）為 456 bp，編碼151個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量為16 515.96 Da。（2）將纖枝短月蘚與其他植物L(fēng)EA2基因氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示纖枝短月蘚與小立碗蘚的親緣關(guān)系最近。（3）利用HiTail-PCR技術(shù)克隆獲得1 072 bp的BeLEA2啟動(dòng)子序列，用PlantCARE在線工具對(duì)該啟動(dòng)子的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明該啟動(dòng)子除了含有核心啟動(dòng)子元件TATA-box和CAAT-box外，還含有ABRE、MYB、MYC、MYB結(jié)合位點(diǎn)（MBS）等其他順式元件。（4）實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，BeLEA2基因在纖枝短月蘚不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中都有表達(dá)，且對(duì)脫水脅迫有響應(yīng)。以上結(jié)果為進(jìn)一步探究LEA2基因在苔蘚植物中的功能及作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 纖枝短月蘚， LEA2基因， 啟動(dòng)子， 脫水脅迫， 表達(dá)

中圖分類號(hào)：? Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2022）02-0277-09

Cloning and expression analysis of? BeLEA2 gene from Brachymenium exile

LI Xuebao1，3， WANG Qi2， YAN Bo1，3*

（ 1. College of Landscape Architecture and Horticulture Sciences， Southwest Forestry University， Kunming， 650224; 2. College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610065;

3. Southwest Research Center for Landscape Architecture

Engineering， State Forestry and

Grassland Administration， Kunming 650224 ）

Abstract：? The purpose of this study was to explore the structural and expression characteristics of LEA2 genes from Brachymenium exile. BeLEA2 gene was firstly isolated and analyzed by polymerase chain reaction （PCR）. The results were as follows： （1） Gene structure analysis showed that BeLEA2 gene contained 2 exons and 1 intron and contained an open reading frame （ORF） of 456 bp encoding a protein of 151 amino acids， and its molecular mass was predicted to be 16 515.96 Da. （2） The phylogenetic analysis of LEA2 with other LEA2 in different plants revealed that BeLEA2 from B. exile and LEA2 from Physcomitrella patens belonged to the same branch of evolutionary distance. （3） The promoter sequence of the BeLEA2 gene of? 1 072 bp was isolated from Brachymenium exile by high-efficiency hermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction （HiTail-PCR） and analyzed by PlantCARE， the results showed that it had TATA-box， CAAT-box， ABRE， MYB， MYC， MYB binding site and other cis-acting elements. （4） Quantitative real-time PCR analysis indicated that BeLEA2 expressed in different stages and tissues of B. exile， and BeLEA2 responded to dehydration stress. These results lay a foundation for further study on the function of LEA2 gene in bryophytes.

Key words： Brachymenium exile， LEA2 gene， promoter， dehydration stress， expression

水分是植物體生長(zhǎng)所必需的重要組成部分，缺水會(huì)干擾植物正常的生理活動(dòng)，而干旱、高溫、鹽堿等逆境都會(huì)使植物體細(xì)胞大量失水（潘瑞熾， 2012）。同時(shí)我國(guó)也是世界上鹽堿地面積最多的國(guó)家之一，干旱和荒漠化問(wèn)題非常嚴(yán)重（張建鋒等， 2002）。到2014年底，我國(guó)土地荒漠化面積約為26 115.93萬(wàn)hm2，約占我國(guó)國(guó)土面積的27.20%（屠志方等， 2016）。鹽堿和干旱不僅減緩了我國(guó)林業(yè)的高速發(fā)展，同時(shí)也會(huì)給我國(guó)的生態(tài)環(huán)境造成很大的破壞。因此，進(jìn)行耐鹽/耐干旱的研究非常重要。

纖枝短月蘚（Brachymenium exile）屬于真蘚科短月蘚屬（黎興江， 2006），生長(zhǎng)在裸露的巖壁和極端干旱的環(huán)境中，具有較強(qiáng)的耐干旱能力。苔蘚植物中存在抗氧化防御系統(tǒng)，可以有效地應(yīng)對(duì)外界的干旱脅迫，在面對(duì)一些極端的外界環(huán)境時(shí)可以表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗逆性（張萍等， 2005）。通過(guò)研究植物的抗逆型基因，探究植物的耐鹽/耐旱機(jī)理，培養(yǎng)耐鹽/耐旱作物或林木對(duì)保持我國(guó)農(nóng)業(yè)生態(tài)的可持續(xù)發(fā)展，改善我國(guó)生態(tài)環(huán)境具有極大的作用。

LEA蛋白（late embryogenisis abundant proteins），即胚胎發(fā)育后期豐富蛋白，是植物胚胎發(fā)育后期種子中大量積累的一類蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于棉花胚胎發(fā)育后期的子葉中（Dure et al.， 1981）。隨后，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、小麥（Triticum aestivum）、番茄（Solanum lycopersicum）、水稻（Oryza sativa）和油菜（Brassica napus）等植物中也同樣發(fā)現(xiàn)了LEA蛋白的存在（Wang et al.， 2006;Hundertmark & Hincha， 2008;Cao & Li， 2015;Yu et al.， 2016;Bhattacharya et al.， 2019）。盡管LEA蛋白在植物界中具有較為廣泛的分布，但它并不是植物界所特有的一類蛋白，在真菌、細(xì)菌和某些無(wú)脊椎動(dòng)物中也同樣存在LEA蛋白（Tunnacliffe et al.， 2005; Shinozaki & Yamaguchi-Shinozaki， 2006; Hand et al.， 2007）。

到目前為止，已從多種不同植物中分離出LEA基因的啟動(dòng)子序列，分析結(jié)果表明LEA基因的啟動(dòng)子中具有不止一種壓力響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，表明LEA 基因與干旱等非生物脅迫的調(diào)控密切相關(guān)（Huang et al.， 2016; I·brahime et al.， 2019; Nagaraju et al.， 2019）。通過(guò)分析LEA基因結(jié)構(gòu)得出，其內(nèi)含子數(shù)目的差異較小，同時(shí)內(nèi)含子數(shù)目通常不多于3個(gè)，基因結(jié)構(gòu)的保守性較高（Huang et al.， 2016; Wu et al.， 2018）。

本研究對(duì)纖枝短月蘚BeLEA2啟動(dòng)子基因進(jìn)行了分離，將纖枝短月蘚與其他植物L(fēng)EA2基因氨基酸序列加以比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹;對(duì)纖枝短月蘚進(jìn)行脫水脅迫處理，并對(duì)LEA2基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，以期為 LEA2基因的表達(dá)特性及其功能研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

研究所需纖枝短月蘚采于昆明市郊區(qū)，保存于西南林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。清洗后進(jìn)行DNA的提取，用于BeLEA2基因和啟動(dòng)子的克隆。

分別選取兩組長(zhǎng)勢(shì)相同且良好的纖枝短月蘚，分別選取有性世代和無(wú)性世代的配子體部分和孢子體部分。一組采用新鮮植株不予以處理，另一組洗凈后，給予脫水脅迫2 h處理，進(jìn)行RNA的提取，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于表達(dá)分析。

1.2 纖枝短月蘚BeLEA2基因的克隆

采用 TIANGEN公司的小量植物（葉）總DNA抽提試劑盒來(lái)提取纖枝短月蘚的基因組DNA，采用OMEGA公司的總RNA提取試劑盒提取纖枝短月蘚的總RNA，選用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（全式金），將上一步所得的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果（未公布），設(shè)計(jì)出該基因特異性引物L(fēng)EA2-F：ATGGCGGGGTTGT

TGAACAAAG;LEA2-R：TTAGAAGATGTCGGACAGT

GTG。分別以cDNA和DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為2×Taq PCR Master Mix 20 μL：正向引物 1 μL、反向引物1 μL、ddH2O 16 μL、DNA模板2 μL。PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性，95 ℃，3 min;變性，95 ℃，15 s，退火，60 ℃，30 s，延伸，72 ℃，90 s，35個(gè)循環(huán);延伸，72 ℃， 10 min;4 ℃保存。PCR產(chǎn)物回收后，將其連接到克隆載體PMD18-T中，送生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 纖枝短月蘚BeLEA2基因啟動(dòng)子的克隆

將纖枝短月蘚的DNA作為模板，依照BeLEA2基因DNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)出三輪的特異性引物：LEA2-1R：CGAAGACGGTAGGTGATCTCG;LEA2-2R：ACGAT

GGACTCCAGTCCGGCCGTTGTGGATCATGACGTTACT

C;LEA2-3R：GGTGACGTTCCCGATGTCCAC。參照Liu & Chen（2007）的辦法，使用HiTail-PCR方法進(jìn)行啟動(dòng)子的擴(kuò)增分離。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用ExPASy-ProtParam分析氨基酸的理化性質(zhì);使用在線軟件GSDS 2.0分析基因的結(jié)構(gòu)信息;利用NetPhos 3.1 Server軟件預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn);利用NetOGlyc 1.1 Server軟件預(yù)測(cè)O-糖基化位點(diǎn);利用NetNGlyc 1.0 Server 預(yù)測(cè)N-糖基化位點(diǎn)（徐志文等，2019）;利用Prot Scale軟件得到蛋白質(zhì)親疏水性圖;利用SOPMA軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析;利用Swiss-Model通過(guò)同源建模建立三級(jí)模型;利用DNAMAN 6.0軟件獲得多序列結(jié)構(gòu)域比對(duì)圖;利用MEGA X軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹;利用PlantCARE軟件分析基因的啟動(dòng)子區(qū)域中所包括的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

根據(jù)所獲得的BeLEA2基因的序列，設(shè)計(jì)熒光定量專用引物，L2-F：GCGACAGGGAGATTACCTCC、L2-R：GTCGTAGTCGATATCCCAGTC。內(nèi)參基因?yàn)锳ctin基因，設(shè)計(jì)引物A-F：CTGTACGGCAACATCGTGCTG，A-R：CCAGACACTGTACTTCCTCTC，以cDNA為模板，按照TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ說(shuō)明書進(jìn)行操作，反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex Taq 10 μL：ROX Reference Dye 0.4 μL、正向引物 0.8 μL、反向引物0.8 μL、ddH2O 6 μL、cDNA模板2 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性，95 ℃，30 s;變性，95 ℃，5 s，退火，60 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)，使用2-△△Ct 法計(jì)算BeLEA2基因的相對(duì)變量值。

2 結(jié)果與分析

2.1 BeLEA2基因的克隆與結(jié)構(gòu)分析

以纖枝短月蘚cDNA為模板，結(jié)合引物L(fēng)EA2-F和LEA2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序得到456 bp的序列。以DNA為模板，結(jié)合引物L(fēng)EA2-F和LEA2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序得到1 168 bp的序列，得到兩條序列的長(zhǎng)度不一致，表明序列中有內(nèi)含子。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組序列分析表明，該基因包含82 bp 5’UTR和266 bp 3’UTR，其開放閱讀框長(zhǎng)度為456 bp，編碼151個(gè)氨基酸（圖1）。其基因組序列全長(zhǎng)長(zhǎng)度為1 168 bp，同時(shí)含有1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子（圖2）。經(jīng)Pfam分析得出，LEA2蛋白在45～140氨基酸位點(diǎn)含有LEA2結(jié)構(gòu)域，表明該基因?qū)儆贚EA2家族，將該基因命名為BeLEA2。

2.2 BeLEA2基因的生物信息學(xué)分析

使用ProtParam軟件預(yù)測(cè)BeLEA2編碼蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為16 515.96 Da，理論等電點(diǎn)為5.74，分子式為C732H1179N197O224S6。BeLEA2所編碼蛋白的氨基酸組成中，亮氨酸含量最高，占到了總氨基酸的9.9%;其次為纈氨酸和天冬氨酸，分別占總氨基酸的8.6%和9.3%。脂肪系數(shù)為101.32，平均親水性為-0.071，是親水蛋白（圖3）;不穩(wěn)定指數(shù)為17.01，屬于穩(wěn)定性蛋白。

預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)BeLEA2蛋白發(fā)生磷酸化修飾的位點(diǎn)共有10個(gè)，其中絲氨酸的磷酸化位點(diǎn)和蘇氨酸的磷酸化位點(diǎn)各4個(gè)，而酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)最少，為2個(gè)。BeLEA2蛋白中不含有發(fā)生O-糖基化和N-糖基化的位點(diǎn)。

使用SOPMA軟件預(yù)測(cè)BeLEA2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲（Random coil）、β轉(zhuǎn)角（Beta turn）、延伸鏈（Extended strand）和α螺旋（Alpha helix）構(gòu)成。其中：無(wú)規(guī)則卷曲最多，占氨基酸序列的45.03%;其次為延伸鏈和α螺旋，分別占29.80%和21.19%;β轉(zhuǎn)角最少（3.97%）。通過(guò)Swiss-Model對(duì)纖枝短月蘚BeLEA2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，以擬南芥LEA14蛋白為模板進(jìn)行同源建模，預(yù)測(cè)的BeLEA2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)中含有1個(gè)α螺旋和10個(gè)β折疊。

2.3 BeLEA2基因的啟動(dòng)子元件

以纖枝短月蘚DNA為模板，通過(guò)HiTail-PCR擴(kuò)增BeLEA2基因啟動(dòng)子序列，得到了1 072 bp的BeLEA2基因啟動(dòng)子序列。

通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子元件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示BeLEA2基因啟動(dòng)子具有典型的CAAT-box和TATA-box元件。在BeLEA2基因啟動(dòng)子區(qū)含大量非生物脅迫響應(yīng)順式作用元件， 主要包括茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（methyl jasmonate response element，CGTCA-motif）;

脫落酸響應(yīng)元件（abscisic acid responsive element，ABRE）;還含有光響應(yīng)作用元件Sp1和與分生組織有聯(lián)系的作用元件CAT-box;與啟動(dòng)子響應(yīng)調(diào)控或活性有關(guān)的元件CCAAT-box;MYB結(jié)合位點(diǎn)（MYB binding site，MBS）;MYC和MYB元件，這兩類元件都是轉(zhuǎn)錄因子作用元件，都和ABA或干旱誘導(dǎo)的表達(dá)調(diào)控有聯(lián)系;除此之外，還含有G-box、F-box、A-box、I-box、TCT-motif、TCCC-motif、TGACG-motif、CCGTCC-motif、GATA-motif、GT1-motif等元件，其中ABRE元件含量較高。說(shuō)明BeLEA2的轉(zhuǎn)錄將受到這些元件的影響和調(diào)控。

2.4 BeLEA2氨基酸序列比對(duì)分析

將BeLEA2編碼的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastp對(duì)比，結(jié)果表明其與小立碗蘚（Physcomitrella patens，XP_024360796.1）、海棗（Phoenix dactylifera，XP_008795021.1）、花旗松（Pseudotsuga menziesii，CAA10047.1）、玉米（Zea mays，NP_001142311.1）、甘蔗（Saccharum officinarum，ACT53873.1）、北美云杉（Picea sitchensis，ADM74314.1）、菠蘿（Ananas comosus，OAY80542.1）、高粱（Sorghum bicolor，XP_002441588.1）、黍（Panicum miliaceum，RLN27694.1）、木槿（Hibiscus syriacus，KAE8699781.1）、阿月渾子（Pistacia vera，XP_031249202.1）、月季（Rosa chinensis，XP_024175981.1）的LEA2蛋白同源，并且它們之間的相似性較高。利用DNAMAN 6.0軟件將LEA2和其他物種的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果顯示，BeLEA2蛋白與其他物種LEA2蛋白具有高度的相似性，總體表現(xiàn)為C端較保守，N端保守性較差（圖4）。

2.5 LEA2蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用MEGA X軟件的近鄰相接法構(gòu)建纖枝短月蘚LEA2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)一步探究BeLEA2蛋白與其他物種的LEA2蛋白的進(jìn)化關(guān)系。由圖5可知，整個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹分為2個(gè)大的分支，纖枝短月蘚首先與小立碗蘚聚為一支，其進(jìn)化關(guān)系最為接近;裸子植物與苔蘚植物聚在一支，其親緣關(guān)系比較接近;而單子葉植物和雙子葉植物的LEA2蛋白同屬于兩個(gè)不同的分支，同時(shí)與纖枝短月蘚有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。

2.6 BeLEA2基因?qū)崟r(shí)熒光定量分析

實(shí)時(shí)熒光定量分析的結(jié)果表明，在未作處理的條件下，BeLEA2基因在纖枝短月蘚不同的發(fā)育時(shí)期和部位中都有表達(dá)，特別是在有性世代的配子體中表達(dá)量最多， 其次是無(wú)性世代的配子體，無(wú)性世代的孢子體最低，差異極顯著（圖6）。為了分析BeLEA2是否受到脫水脅迫的誘導(dǎo)，本研究將纖枝短月蘚植株各部位都進(jìn)行了2 h的自然脫水處理。在脫水脅迫條件下，BeLEA2基因在有性世代的配子體中表達(dá)量最高，其次是無(wú)性世代的孢子體，無(wú)性世代的配子體最低，差異極顯著（圖7）。分析結(jié)果證明，不管是正常條件還是脫水脅迫處理，BeLEA2蛋白都在有性世代時(shí)期表達(dá)量最高，表明BeLEA2基因可能在有性世代的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有關(guān)鍵作用。

在脫水脅迫下，有性世代時(shí)期的配子體表達(dá)量降低（圖8），差異顯著;而無(wú)性世代時(shí)期的配子體表達(dá)量增加，約為正常植株的5.4倍（圖9），差異顯著;無(wú)性世代時(shí)期的孢子體表達(dá)量有所上升，約為正常植株的98倍（圖10），差異極為顯著。表明BeLEA2基因可能參與干旱脅迫的響應(yīng)基因，這與啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果一致，揭示BeLEA2蛋白在脫水條件下可能對(duì)孢子體的發(fā)育具有重要作用。

3 討論與結(jié)論

苔蘚植物是一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的小型綠色植物，一直以來(lái)都以其特殊的生理結(jié)構(gòu)在植物體的進(jìn)化研究方面占據(jù)著重要地位。苔蘚植物在世界各地均有著廣泛的分布，在潮濕陰暗的地區(qū)尤為常見，在高溫、干旱等惡劣環(huán)境中仍能夠正常存活。目前，我國(guó)土地荒漠化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，由于地理特征、氣候環(huán)境因素等影響，極易發(fā)生干旱、高溫等極端天氣，極大影響了植物的正常生長(zhǎng)，甚至造成植物大面積枯萎、死亡。但在某些植物中存在著大量的抗逆機(jī)制，在植物面臨脅迫時(shí)，可以通過(guò)一些功能性蛋白直接參與脅迫響應(yīng)（Campo et al.， 2014）。而LEA蛋白就屬于此類功能性蛋白。根據(jù)相關(guān)研究和資料表明，LEA基因與干旱等非生物脅迫的調(diào)控密切相關(guān)（Hundertmark & Hincha， 2008; Magwanga et al.， 2017; Muvunyi et al.， 2018; I·brahime et al.， 2019）。

水稻 （Oryza sativa） 幼苗中，OsLEA19a基因在受到干旱脅迫下會(huì)大量表達(dá)（胡廷章等，2011）;小麥 （Triticum aestivum） 中的TaLEA5基因只有在干旱脅迫時(shí)才會(huì)表達(dá)（劉露露等，2014）;將大豆 （Glycine max）LEA基因轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 （Escherichia coli）中，在高鹽脅迫下的存活率大幅度提高（Lan et al.， 2005）。綜上所述，LEA基因參與了植物體干旱、高鹽等脅迫的響應(yīng)，這與本研究結(jié)果保持一致。

通過(guò)分析可知，BeLEA2基因ORF序列為456 bp，編碼151個(gè)氨基酸，根據(jù)Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)于LEA蛋白家族的分類，該基因?qū)儆贚EA2家族。纖枝短月蘚BeLEA2基因啟動(dòng)子中不僅含有CAAT-box和TATA-box等基本的元件，同時(shí)還有和壓力響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，例如，逆境激素ABA的主要調(diào)控元件（ABRE、MYC和MYB）以及MYB的結(jié)合位點(diǎn)和茉莉酸甲酯響應(yīng)元件等元件。推測(cè)BeLEA2基因可能會(huì)受這些非生物脅迫的調(diào)控（Yamaguchi-Shinozaki & Shinozaki， 2005; Du et al.， 2013; Huang et al.， 2016;李莎莎等，2018; Nagaraju et al.， 2019）。這說(shuō)明BeLEA2在纖枝短月蘚的抗逆性中有非常重要的作用，具有深入研究的價(jià)值。

從纖枝短月蘚LEA2建立的系統(tǒng)發(fā)育樹分析可以得出：LEA2基因在不同的分類單元中都可以明顯地區(qū)分開，傳統(tǒng)分類的系統(tǒng)進(jìn)化樹和基于LEA2構(gòu)建的結(jié)果一致。值得關(guān)注的是，苔蘚植物L(fēng)EA2基因與裸子植物L(fēng)EA2基因的系統(tǒng)位置較為接近，這是否反映了它們的LEA2基因很可能具有相近的共同祖先，還需更多的研究資料查證。

實(shí)時(shí)熒光定量分析表明，不管是未經(jīng)處理還是經(jīng)脫水脅迫處理，BeLEA2基因在不同時(shí)期及不同部位中皆有表達(dá)，且在有性世代時(shí)期表達(dá)量最高，揭示BeLEA2基因可能在有性世代的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用。脫水脅迫后，BeLEA2基因表達(dá)量變化差異明顯，在有性世代發(fā)育時(shí)期的表達(dá)下降，而在無(wú)性世代發(fā)育時(shí)期表達(dá)上升，揭示了該基因在纖枝短月蘚不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期對(duì)脫水脅迫的響應(yīng)機(jī)制可能不同。

本研究首次從纖枝短月蘚中克隆分析了BeLEA2基因，并進(jìn)行了初步表達(dá)分析，結(jié)果顯示纖枝短月蘚中BeLEA2基因在脫水脅迫時(shí)有較高的表達(dá)，表明BeLEA2基因參與了纖枝短月蘚脫水脅迫的響應(yīng)。本研究對(duì)深入了解LEA2基因在苔蘚植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的功能，分析LEA2蛋白植物抗逆的分子機(jī)制以及深入探究苔蘚植物的抗逆機(jī)制具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）

收稿日期：? 2020-07-22

基金項(xiàng)目：? 國(guó)家自然科學(xué)基金（31160177）;云南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃項(xiàng)目 [Supported by National Natural Science Foundation of China（31160177）; Project for Innovative Research Team （in Science and Technology） in Colleges and Universities of Yunnan Province]。

第一作者： 李雪寶（1994-），碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)，（E-mail）421043791@qq.com。

*通信作者：? 鄢波，博士，教授，主要從事植物分子生物方向研究工作，（E-mail）yanbodr@aliyun.com。

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