張軍偉

(焦作市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 焦作 454000)

急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一種起源于淋巴細(xì)胞的B系或T系細(xì)胞在骨髓內(nèi)異常增生的惡性腫瘤性疾病，其主要病理表現(xiàn)為大量異常增生的原始細(xì)胞在骨髓內(nèi)聚集，抑制骨髓的正常造血功能，伴隨侵及腦膜、淋巴結(jié)、性腺、肝等骨髓外組織[1-2]。ALL在兒童的發(fā)病率較高，兒童患者約占80%[3]。ALL患者的病死率較高，根據(jù)患者預(yù)后評(píng)估情況進(jìn)行分層治療可極大程度地改善ALL患者的預(yù)后[4]。ALL患者在免疫表型、細(xì)胞和分子遺傳學(xué)、形態(tài)學(xué)等方面存在極大差異。隨著檢測(cè)技術(shù)的迅速發(fā)展，ALL的預(yù)后影響因素被不斷發(fā)現(xiàn)，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，細(xì)胞和分子遺傳學(xué)與ALL患者的預(yù)后密切相關(guān)[5]，但具體影響機(jī)制尚未完全明確。本研究旨在探討成人與兒童ALL患者的免疫表型、染色體和分子遺傳學(xué)異常情況，分析各年齡段患者的免疫表型、染色體和分子遺傳學(xué)異常情況與預(yù)后的關(guān)系，為分層治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2014年1月至2015年1月焦作市第二人民醫(yī)院血液內(nèi)科收治的ALL患者為研究對(duì)象。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫表型、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)檢查確診為ALL，符合成人或兒童ALL診斷標(biāo)準(zhǔn)[6-7]；(2)均為初次診斷患者；(3)患者入組前均未接受化學(xué)治療；(4)行免疫表型、染色體和分子遺傳學(xué)檢測(cè)后根據(jù)患者年齡、病情及家屬意愿給予患者個(gè)體化相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)心、肝、腎等重要器官嚴(yán)重功能障礙；(2)患有其他血液系統(tǒng)疾??；(3)患者拒絕參與或因其他原因中途退出本研究。本研究共納入ALL患者139例，按年齡將患者分為兒童組(≤14歲)和成人組(>14歲)。兒童組57例，男31例，女26例；年齡1～14(7.56±3.58)歲；骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)-免疫學(xué)-細(xì)胞遺傳學(xué)-分子生物學(xué)分型(即MICM分型)危險(xiǎn)分級(jí)[8]：低危10例，標(biāo)危41例，高危6例。成人組82例，男48例，女34例；年齡16～58(35.69±6.93)歲；MICM分型危險(xiǎn)分級(jí)：標(biāo)危66例，高危16例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者和(或)家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2 資料采集(1)免疫表型：取患者肝素抗凝骨髓2 mL，常規(guī)分離單個(gè)核細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)和熒光法進(jìn)行免疫表型分析，單克隆抗體包括CD38、CD56、CD20、CD34、CD33、CD17、CD2、CD7、CD22、CD79、CD19、CD10、髓系抗原(myeloid antigen,MyAg)、人白細(xì)胞DR抗原(human leukocyte antigen DR，HLA-DR)等，陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：髓系抗原陽(yáng)性細(xì)胞≥20%，淋系抗原陽(yáng)性細(xì)胞≥30%，干細(xì)胞抗原陽(yáng)性及非系列特異性≥20%。(2)染色體核型：抽取患者骨髓3 mL，肝素抗凝，采用直接法和24～48 h培養(yǎng)法檢測(cè)染色體核型。(3)分子遺傳學(xué)特征：采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測(cè)15種ALL常見(jiàn)融合基因：BCR/ABL、SIL/TAL1、MLL/AFX、MLL/AF1P、MLL/AF4、MLL/AF6、MLL/EML、TEL/AML1、dupMLL、TEL/PDGFR、TEL/ABL、E2A/PBX1、HOX11、E2A/HLP。(4)臨床隨訪情況：所有患者隨訪5 a，記錄患者完全緩解(complete remission,CR)、復(fù)發(fā)、總生存期(overall survival,OS)、中位OS等。OS為從納入研究開(kāi)始，至因任何原因引起死亡的時(shí)間。CR：(1)外周血無(wú)原始細(xì)胞，無(wú)髓外白血病；(2)骨髓三系造血恢復(fù)，原始細(xì)胞<5%；(3)外周血中性粒細(xì)胞絕對(duì)值(absolute neutrophil count，ANC)>1.0×109L-1，外周血血小板(platelet，PLT)計(jì)數(shù)>100×109L-1；(4)4周內(nèi)無(wú)復(fù)發(fā)[6]。復(fù)發(fā)是指已取得CR的患者外周血或骨髓又出現(xiàn)原始細(xì)胞(比例>5%)，或出現(xiàn)髓外疾病[6]。

2 結(jié)果

2.1 免疫表型檢查結(jié)果分析結(jié)果見(jiàn)表1和表2。139例ALL患者均進(jìn)行免疫表型檢查，其中急性B淋巴細(xì)胞白血病(B-line acute lymphoblastic leukemia，B-ALL)患者115例(82.74%)，急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-line acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)患者18例(12.96%)，非T非B細(xì)胞型急性淋巴細(xì)胞白血病(null acute lymphoblastic leukemia,N-ALL)患者3例(2.15%)，T/B雙表達(dá)急性淋巴細(xì)胞白血病(急性混合型)患者3例(2.15%)。115例B-ALL患者中，含有脯氨酸合成途徑必需的基因B(pro-B)型16例，普通B細(xì)胞(com-B)型71例，前B細(xì)胞(pre-B)型28例。成人組患者中B-ALL 分型占79.27%(65/82)，T-ALL分型占14.63%(12/82)，N-ALL分型占2.44%(2/82)，急性混合型ALL占3.66%(3/82)；兒童組患者中B-ALL分型占87.72%(50/57)，T-ALL 分型占10.53%(6/57)，N-ALL分型占 1.75%(1/57)，急性混合型ALL占0.00%(0/57)；成人組與兒童組患者免疫表型比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.886，P>0.05)。髓系抗原表達(dá)以CD13陽(yáng)性(43.61%)最常見(jiàn)，其次為CD15(16.54%)、CD33(9.02%)、CD117(7.51%)。T-ALL患者的干/祖細(xì)胞標(biāo)志CD34、HLA-DR陽(yáng)性率顯著低于B-ALL患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.103、4.925，P<0.05)。Kaplan-Meier 分析顯示，pro-B型患者的中位OS未達(dá)到，com-B、pre-B型、T-ALL患者的中位OS分別為41、45、22個(gè)月；log-rank檢驗(yàn)顯示，T-ALL患者的中位OS顯著短于com-B型、pre-B型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 成人組和兒童組ALL患者免疫表型比較

表2 B-ALL和T-ALL患者免疫表型特征分析

2.2 ALL患者染色體核型分析結(jié)果見(jiàn)表3和表4。139例ALL患者均進(jìn)行染色體核型分析，其中正常核型72例(51.80%)，異常核型67例(48.20%)。異常核型患者中，包括t(9;22)核型20例(14.39%)，超二倍體核型14例(10.07%)，亞二倍體核型10例(7.19%)，t(1;19)核型9例(6.47%)，t(8;14)核型6例(4.32%)，11q-核型4例(2.88%)，其他核型4例(2.88%)。成人組患者中正常核型34例(41.46%)，異常核型48例(58.54%)；兒童組患者中正常核型38例(66.67%)，異常核型19例(33.33%)；兒童組患者異常核型比例顯著低于成人組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.554，P<0.05)。兒童組和成人組t(9;22)核型患者分別占3.51%(2/57)、21.95%(18/82)，兒童組t(9;22)核型患者比例顯著低于成人組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.284，P<0.05)。兒童組和成人組t(8;14)核型患者分別占0.00%(0/57)、7.37%(6/82)，兒童組t(8;14)核型患者比例顯著低于成人組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.358，P<0.05)。Kaplan-Meier分析顯示，正常核型患者的中位OS未達(dá)到，t(9;22)、亞二倍體、復(fù)雜核型及其他類型的核型異?；颊叩闹形籓S顯著低于正常核型患者(P<0.05)。單因素Cox分析顯示，t(9;22)核型異?；颊咚劳鲲L(fēng)險(xiǎn)是正常核型患者的4.008倍，其他核型異常患者死亡風(fēng)險(xiǎn)是正常核型的2.658倍。

表3 兒童組和成人組ALL患者染色體核型分析

表4 不同染色體核型ALL患者死亡風(fēng)險(xiǎn)分析

2.3 ALL患者分子遺傳學(xué)特征分析139例ALL患者均進(jìn)行分子生物學(xué)檢查，未檢出融合基因者93例(66.90%)，檢出融合基因者46例(33.10%)。46例檢出融合基因患者中，BCR/ABL融合基因20例(43.48%)，混合型融合基因9例(19.57%)，MLL重排融合基因6例(13.04%)，AML/TML融合基因5例(10.87%)，PBX1/E2A融合基因4例(8.70%)，E2A/HLF融合基因1例(2.17%)，EVI1融合基因1例(2.17%)。兒童組檢出融合基因者13例(22.81%)，包括BCR/ABL融合基因2例，混合型融合基因5例，MLL重排融合基因2例，AML/TML融合基因1例，PBX1/E2A融合基因1例，E2A/HLF融合基因1例，EVI1融合基因1例；成人組檢出融合基因者33例(40.24%)，包括BCR/ABL融合基因18例，混合型融合基因4例，MLL重排融合基因4例，AML/TML融合基因4例，PBX1/E2A融合基因3例；兒童組患者融合基因檢出率顯著低于成人組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.617，P<0.05)。Kaplan-Meier分析顯示(圖1)，未檢出融合基因患者的中位OS未達(dá)到，BCR/ABL融合基因患者的中位OS為14.25個(gè)月，未檢出融合基因患者的中位OS顯著高于BCR/ABL融合基因患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 不同分子遺傳學(xué)特征ALL患者的生存曲線

2.4 兒童組與成人組患者的預(yù)后比較兒童組和成人組患者的CR率分別為98.25%(56/57)、82.93%(68/82)，兒童組患者的CR率顯著高于成人組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=48.145，P<0.05)。82例成人患者中，低危、標(biāo)危、高?；颊叩腃R率分別為0.00%(0/0)、87.88%(58/66)、62.50%(10/16)；標(biāo)?；颊逤R率顯著高于高?；颊?，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.858，P<0.05)。57例兒童患者中，低危、標(biāo)危、高?；純旱腃R率分別為100.00%(10/10)、100.00%(41/41)、83.33%(5/6)；高?；純旱腃R率顯著低于標(biāo)?；純海町愑薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.981，P<0.05)；高?；純旱腃R率低于低危患兒，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.778，P>0.05)；標(biāo)危與低?；純旱腃R率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.000，P>0.05)。兒童組和成人組CR患者的復(fù)發(fā)率分別為21.43%(12/56)、72.06%(49/68)，兒童組CR患者的復(fù)發(fā)率顯著低于成人組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.496，P<0.05)。

68例CR成人患者中，低危、標(biāo)危、高?；颊叩膹?fù)發(fā)率分別為0.00%(0/0)、74.14%(43/58)、60.00%(6/10)；標(biāo)危成人CR患者的復(fù)發(fā)率高于高危成人患者，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.846，P>0.05)。56例CR患兒中，低危、標(biāo)危、高?；純旱膹?fù)發(fā)率分別為10.00%(1/10)、19.51%(8/41)、60.00%(3/5)；高危CR患兒的復(fù)發(fā)率顯著高于低危和標(biāo)危患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.261、4.015，P<0.05)；標(biāo)危CR患兒的復(fù)發(fā)率高于低?；純?，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.500，P>0.05)。

Kaplan-Meier分析顯示(圖2)，兒童組和成人組患者的OS分別為(36.26±5.69)、(18.85±4.69)個(gè)月，兒童組患者的OS顯著長(zhǎng)于成人組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.709，P<0.05)。標(biāo)危、高危成人患者的OS分別為(19.00±4.16)、(13.00±3.59)個(gè)月；高危成人患者的OS顯著短于標(biāo)危患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.304，P<0.05)。低危、標(biāo)危、高?；純旱腛S分別為(43.56±4.15)、(38.16±3.28)、(19.10±2.58)個(gè)月；低?；純旱腛S顯著長(zhǎng)于標(biāo)?；純海町愑薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.531，P<0.05)；低危和標(biāo)?；純旱腛S顯著長(zhǎng)于高危患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.556、13.585，P<0.05)。

圖2 兒童與成人ALL患者的生存曲線

3 討論

ALL根據(jù)免疫表型可分為B型和T型，其中B型ALL分為pro-B型、com-B型、pre-B型 3種類型。SANDDHYA等[12]研究表明，免疫表型與ALL臨床治療效果及患者生命周期存在一定相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，T-ALL中的干/祖細(xì)胞標(biāo)志CD34、HLA-DR陽(yáng)性率明顯低于B-ALL，log-rank檢驗(yàn)顯示，T-ALL患者的中位OS顯著短于com-B型、pre-B型患者，提示ALL患者生物學(xué)特征差異較大，不同免疫表型患者的治療效果也不盡相同，因此，根據(jù)ALL患者的生物學(xué)特征制訂治療方案，對(duì)改善患者生活質(zhì)量、延長(zhǎng)患者生存期等具有重要意義，這與VALLACHA等[13]的研究結(jié)果一致。

在分子生物學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)中，不同基因突變及染色體核型異常在成人和兒童ALL患者中的發(fā)生率差異較大，同時(shí)具有不同的意義。染色體數(shù)量超過(guò)46條即為超二倍體異常，常見(jiàn)于pre-B型ALL患者。存在超二倍體的ALL成人患者預(yù)后較差，5 a 總生存率僅約30%[14]；而存在超二倍體的ALL兒童患者預(yù)后較好，5 a 總生存率高達(dá)100%[15]。t(9;22)在ALL成人患者中較為常見(jiàn)，發(fā)病率為12%～30%，而在兒童患者中出現(xiàn)相對(duì)較少[16]。本研究結(jié)果顯示，兒童組患者異常核型比例顯著低于成人組，兒童組t(9;22)核型患者比例顯著低于成人組。Kaplan-Meier分析顯示，t(9;22)核型患者的中位OS為11個(gè)月，正常核型患者中位OS未達(dá)到，亞二倍體、復(fù)雜核型及其他類型的核型異常的中位OS均短于核型正?；颊?，與國(guó)際權(quán)威的臨床COX風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果的論點(diǎn)一致[17]。

盡管目前造血干細(xì)胞移植技術(shù)迅速發(fā)展，多種新型酪氨酸激酶抑制劑問(wèn)世，BCR/ABL患者復(fù)發(fā)率仍處于較高水平，而復(fù)發(fā)的BCR/ABL患者預(yù)后更差[18]。因此，早期檢測(cè)融合基因?qū)︻A(yù)測(cè)患者的臨床療效及預(yù)后具有一定幫助。本研究結(jié)果顯示，兒童組患者融合基因檢出率顯著低于成人組，提示ALL患者融合基因發(fā)生率與年齡存在一定聯(lián)系，檢查患者的分子遺傳學(xué)特征對(duì)評(píng)估患者的預(yù)后及制定針對(duì)性治療方案具有一定幫助，這與鄧?yán)蚱嫉萚19]研究結(jié)果一致。MICM分型標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)免疫表型、融合基因及染色體改變等進(jìn)行危險(xiǎn)度分級(jí)。本研究根據(jù)MICM預(yù)后分層將患者分組，發(fā)現(xiàn)高危成人患者的OS顯著短于標(biāo)危患者，低?；純旱腛S顯著長(zhǎng)于標(biāo)?；純海臀：蜆?biāo)?；純旱腛S顯著長(zhǎng)于高?；純?；進(jìn)一步說(shuō)明免疫表型、染色體及分子遺傳特征影響ALL患者的預(yù)后，MICM預(yù)后分層在評(píng)估ALL預(yù)后方面具有一定的價(jià)值。

綜上所述，相較于成人ALL患者，兒童ALL的預(yù)后情況較好；ALL成人患者核型異常和分子遺傳學(xué)異常發(fā)生率高于兒童患者，核型正?；颊哳A(yù)后較好，早期進(jìn)行MICM預(yù)后分層對(duì)評(píng)估ALL患者的預(yù)后具有重要意義。