清熱化瘀方對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響及機(jī)制*

秦紅玲 農(nóng)必華 盧健鋒 林榮清 李曉瓊 楊璧璘 胡躍強(qiáng)

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

缺血性腦卒中(Cerebral ischemic stroke，CIS)是多因素所致的腦組織血液供應(yīng)障礙性疾病。目前早期恢復(fù)血液供應(yīng)是急性CIS治療的目標(biāo)，但它進(jìn)一步加重了由于缺血再灌注(Ischemia/reperfusion, I/R)引起的神經(jīng)元損傷[1]。氧化應(yīng)激是腦I / R損傷的主要機(jī)制，開發(fā)具有抗氧化作用的神經(jīng)保護(hù)劑是治療CIS的有效策略。清熱化瘀方是本課題組研制的中藥復(fù)方，主要用于治療腦梗死[2]，具有解毒、化痰祛瘀之功效。前期研究證實(shí)，清熱化瘀方可顯著降低神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，其可能通過激活Keap1/Nrf2內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，進(jìn)而改善大鼠腦I/R損傷[3-4]。MicroRNA(miRNA)是調(diào)控人類約20%～30%基因表達(dá)的關(guān)鍵因子[5]，并在腦I/R損傷的進(jìn)程中起調(diào)控作用[6]。本研究采用TargetScan預(yù)測，結(jié)果顯示Keap1是miR-18a-3p的潛在靶標(biāo)；預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-18a-3p在清熱化瘀方治療I/R大鼠腦組織中存在差異表達(dá)，提示清熱化瘀方改善腦I/R損傷的機(jī)制可能與miR-18a-3p和Keap1/Nrf2通路有關(guān)。因此，本研究旨在深入探討清熱化瘀方對(duì)I/R大鼠腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響及作用機(jī)制，為清熱化瘀方的臨床應(yīng)用提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK2016-0002。清熱化瘀方(水牛角30 g、丹參15 g、赤芍15 g、地龍10 g、石菖蒲10 g、川芎10 g、郁金10 g、酒大黃6 g、天竺黃10 g，共9味中藥)單味中藥濃縮顆粒劑，由江陰天江藥業(yè)有限公司制備(批號(hào)：0904099)。293T細(xì)胞(SCSP-502)購于中科院上海細(xì)胞庫，DMEM(Invitrogen, 11960044)，F(xiàn)BS(Gibco)，pmirGLO載體(Promega, Madison, WI)，Lipofectamine 2000(Invitrogen)，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)(Promega)，Keap1用網(wǎng)站預(yù)測(http://www.targetscan.org)與miR-18a-3p結(jié)合序列，miR-18a-3p mimics與mimics-NC均由廣州銳博公司合成。Keap1抗體(ab139729)、Nrf2抗體(ab92946)、NOX-2抗體(ab129068)、NOX-4抗體(ab154244)、HO-1抗體(ab68477)、SOD2抗體(ab13533)、山羊抗兔HRP-IgG(ab6721)、β-actin(ab8227)、H3(ab1791)均為abcam產(chǎn)品，總RNA提取試劑盒(R6834)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)，miScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen)，Realtime PCR試劑盒(RR820A)，ROS檢測試劑盒為酶聯(lián)生物產(chǎn)品。細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒為碧云天產(chǎn)品(P0027)。氯化三苯基四氮唑(TCC)染色液(北京鼎國，批號(hào)：16S08342)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 32只SD大鼠，250～300 g，16～20周齡，于SPF條件下飼養(yǎng)，分為正常組、假手術(shù)組、模型組、清熱化瘀方組，每組8只。除正常組外，其余各組均采用線栓法進(jìn)行處理。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理要求，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意。

1.2.2 動(dòng)物模型建立 采用大鼠大腦中動(dòng)脈梗阻(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，參照Longa[7]線栓法進(jìn)行，再灌注后規(guī)定時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物。假手術(shù)組：以假手術(shù)代替I/R，線栓只插入頸內(nèi)動(dòng)脈9 mm，不栓塞大腦中動(dòng)脈。模型組和清熱化瘀方組線栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈17～21 mm阻斷血流，缺血2 h，制備腦缺血模型，缺血后去除線栓再灌注24 h。清熱化瘀方組灌胃清熱化瘀方劑，灌胃液體量為每次1.4 mL/100 g大鼠，其濃度及等效劑量按體表面積折算，2次/d。正常組、假手術(shù)組、模型組均灌胃等體積生理鹽水。各組均正常飼養(yǎng)，自由飲水，4天后處死取缺血灶周圍腦組織進(jìn)行檢測。模型制備后，用4%多聚甲醛灌注后，斷頭處死，取大腦組織，由前至后冠狀切面，約200 μm左右厚度，每個(gè)大腦切5個(gè)層面，放入2% TTC溶液中染色，通過TTC染色法以觀察腦梗死區(qū)域的分布情況，以驗(yàn)證模型制備成功。

1.2.3 RT-qPCR法測定miR-18a-3p、Keap-1、Nox-2、Nox-4、HO-1和SOD2的表達(dá) 用RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，按操作說明書進(jìn)行。PCR程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)。引物由華大基因合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 Western blot檢測Keap-1、Nox-2、Nox-4、HO-1、SOD2蛋白表達(dá)及Nrf2核轉(zhuǎn)位 裂解組織提取蛋白，BCA法蛋白定量，蛋白變性后取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，以含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉2 h，分別孵育一抗Keap-1、Nrf2、Nox-2、Nox-4、HO-1和SOD2， 4℃孵育過夜，TBST振搖洗膜10 min×4次，孵育相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記二抗，室溫1 h，TBST振搖洗膜10 min×4次。ECL底物化學(xué)發(fā)光顯色后機(jī)器掃描存盤，以Image軟件進(jìn)行條帶分析。其中Nrf2蛋白表達(dá)量以組蛋白H3作為內(nèi)參，其余蛋白表達(dá)量均以β-actin作為內(nèi)參。

Nrf2蛋白采用細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒提取，具體方法為將10倍體積的胞質(zhì)蛋白抽提試劑A裂解液加入腦組織中，震蕩5 s，加入1/2體積試劑B，震蕩5 s，冰浴1 min。4℃、13000×g離心5 min，所得上清為胞質(zhì)蛋白。再往沉淀加入2倍體積的含細(xì)胞核提取試劑，震蕩30 s，冰浴30 min，期間每隔1～2 min渦旋 30 s，13000×g離心5 min，上清為胞核蛋白。

1.2.5 Elisa法檢測腦組織ROS表達(dá) 按ROS Elisa檢測試劑盒說明要求制備腦組織勻漿，1000×g離心10 min取上清，并用標(biāo)本稀釋液按1∶1稀釋待用。平衡試劑盒至室溫并充分混勻，制備標(biāo)準(zhǔn)品。取出加樣板條，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔。標(biāo)準(zhǔn)孔加相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，樣品孔加入50 μL稀釋好的待檢樣品。立即加入50 μL的生物素標(biāo)記的抗體，用封板膜封板，輕輕震蕩混勻，于37℃恒溫箱孵育1 h。棄反應(yīng)液，吸水紙上拍干，每孔加入300 μL震蕩洗滌液30 s，棄液拍干，重復(fù)洗滌3次，拍干。每孔加入80 μL的親和鏈霉素-HRP，封板，輕輕震蕩混勻，于37℃恒溫箱孵育30 min，再次按要求洗滌3次。每孔加入底物A、B各50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光孵育10 min，每孔立即加入50 μL終止液，立即用酶標(biāo)儀于450 nm波長處讀取各孔OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，并按方程計(jì)算各樣本中ROS的含量。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測 293T細(xì)胞按說明書要求用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。將Keap1基因的3 ′UTR WT(WT-Keap1 3′UTR)及其突變體(MUT -Keap1 3 ′UTR)構(gòu)建到pmirGLO載體中，該載體的熒光素酶luc2作為主要報(bào)告基因，熒光素酶hRluc-neo為對(duì)照?qǐng)?bào)告基因，不含任何外源片段的pmirGLO載體作為空載對(duì)照。根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書要求，將miR-18a-3p mimics與mimics-NC 分別與熒光素報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，分別為WT-Keap1組、MUT-Keap1組和Vector組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)12 h，用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性，以海參熒光素酶hRluc-neo的活性作為對(duì)照?qǐng)?bào)告基因。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 模型組大鼠腦組織TTC染色 選取再灌注24 h后的模型組大鼠腦組織行TTC染色，模型制備成功的腦組織中，正常腦組織呈玫瑰紅色，缺血損傷的腦組織呈蒼白色，可見明顯的梗死灶，見圖1。

圖1 模型大鼠腦組織TTC染色切片

2.2 清熱化瘀方對(duì)大鼠腦組織Nox-2、Nox-4表達(dá)及ROS生成的影響 采用Western blot、RT-qPCR和ELISA分別檢測大鼠腦組織Nox-2、Nox-4的表達(dá)、ROS生成量，結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組缺血灶腦組織中Nox-2、Nox-4 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著升高，ROS的生成量顯著升高(均P<0.05)；與模型組相比，清熱化瘀方組Nox-2、Nox-4 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著降低，ROS產(chǎn)生量顯著降低(均P<0.05)；假手術(shù)組與正常組的檢測結(jié)果相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組Nox-2、Nox-4和ROS檢測結(jié)果(n=8)

2.3 清熱化瘀方對(duì)大鼠腦組織Keap1、SOD2、HO-1表達(dá)及Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響 采用Western blot和RT-qPCR法檢測各組大鼠腦組織Keap1、SOD2、HO-1表達(dá)和Nrf2核轉(zhuǎn)位。結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組Keap1 mRNA及蛋白表達(dá)顯著升高，SOD2、HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)及Nrf2核轉(zhuǎn)位顯著降低(均P<0.05)；與模型組相比，清熱化瘀方組Keap1 mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低，而SOD2、HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)及Nrf2核轉(zhuǎn)位顯著增加(均P<0.05)；假手術(shù)組與正常組的檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組Keap1、SOD2、HO-1和Nrf2的檢測結(jié)果(n=8)

2.4 清熱化瘀方對(duì)大鼠腦組織miR-18a-3p表達(dá)的影響 采用RT-qPCR法檢測各組大鼠腦組織中miR-18a-3p表達(dá)。結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組miR-18a-3p的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，清熱化瘀方組miR-18a-3p的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。假手術(shù)組與正常組的檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組miR-18a-3p檢測結(jié)果(n=8)

2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-18a-3p與Keap1結(jié)合 使用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢驗(yàn)miR-18a-3p與Keap1的相互作用，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照相比，過表達(dá)miR-18a-3p能顯著至弱WT-Keap1組熒光活性(P<0.05)，而MUT-Keap1組熒光活性無明顯抑制作用(P>0.05)，miR-18a-3p可與野生型Keap1 3′UTR直接結(jié)合，見圖5。

圖5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果(n=3)

3 討論

CIS的治療方法是早期恢復(fù)血流再灌注，進(jìn)行血流重建術(shù)，保證血氧供應(yīng)，但當(dāng)腦缺血超過一定時(shí)間后，缺血再灌注使神經(jīng)元產(chǎn)生一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步加重腦組織損傷，即腦I/R損傷。故神經(jīng)保護(hù)藥物在腦I/R損傷治療研究中備受關(guān)注。近年來，中醫(yī)藥以其多靶點(diǎn)、多途徑等優(yōu)勢已成為中風(fēng)疾病治療研究中的熱點(diǎn)[8]。中風(fēng)病的主要病機(jī)為毒損腦絡(luò)，痰瘀阻滯，氣血逆亂，而痰毒、瘀毒、熱毒往往交織為患，故“清熱解毒，化瘀通絡(luò)”是其有效治法。本研究研制的清熱化瘀方具有解毒、化痰祛瘀之功效，是治療中風(fēng)病的有效方劑。前期大量研究表明，該方可通過抗氧化、抗炎和抗凋亡等多種途徑改善缺血性腦損傷，對(duì)腦I/R損傷具有顯著的保護(hù)作用[9]，表明清熱化瘀方作為神經(jīng)保護(hù)劑在臨床應(yīng)用中具有一定的價(jià)值。因此，深入探討清熱化瘀方對(duì)腦I/R損傷的保護(hù)效應(yīng)具有重要的意義。

腦I/R損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，其機(jī)制包括能量衰竭、細(xì)胞內(nèi)Ca2+的積累、氧化應(yīng)激、炎癥[10]和細(xì)胞凋亡等[11]。氧化應(yīng)激在CIS腦損傷過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]。急性缺血性中風(fēng)后，ROS的迅速增加會(huì)迅速壓倒抗氧化防御，造成腦組織損傷；這些ROS可損傷細(xì)胞大分子，誘導(dǎo)神經(jīng)元自噬、凋亡和壞死等；此外，血流的快速恢復(fù)增加了組織氧合水平，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生的第二次爆發(fā)，從而導(dǎo)致再灌注損傷，進(jìn)一步加重腦組織損傷[13]。NADPH氧化酶的非吞噬細(xì)胞氧化酶(NOX)家族是腦缺血氧化應(yīng)激中產(chǎn)生ROS的主要體系。當(dāng)大腦受到氧化應(yīng)激時(shí)，NOX家族被激活，使電子從NADPH轉(zhuǎn)移到氧分子中，從而產(chǎn)生大量的ROS[14]。Nox-2、Nox-4主要分布于腦組織中，是NOX家族介導(dǎo)腦損傷的關(guān)鍵亞型。既往研究發(fā)現(xiàn)，Nox4-/-小鼠在局灶性MCAO模型中，梗死體積、氧化應(yīng)激、血腦屏障破壞和神經(jīng)元凋亡均顯著減少[15]。此外，Nox-2誘導(dǎo)ROS生成增多可進(jìn)一步促進(jìn)腦I/R大鼠的炎癥反應(yīng)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于正常組，模型組缺血腦組織中ROS的生成量顯著升高，但清熱化瘀方治療腦I/R大鼠后，可明顯降低腦缺血組織中ROS含量，表明腦I/R造成了嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷，而清熱化瘀方有助于改善腦I/R引起的氧化應(yīng)激損傷，其可通過抑制Nox-2和Nox-4的表達(dá)和ROS生成，從而抑制腦I/R所致的氧化應(yīng)激損傷。

Keap1/Nrf2是生物體的內(nèi)源性抗氧化通路。Keap1是Nrf2的天然抑制劑，正常生理狀態(tài)下兩者結(jié)合，誘導(dǎo)Nrf2泛素化并隨后被26S蛋白酶體降解，從而阻止Nrf2的核轉(zhuǎn)位及其與ARE序列的結(jié)合(Nrf2激活)，維持其活性的穩(wěn)定；當(dāng)細(xì)胞受到ROS刺激后，Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，Nrf2激活，從而促進(jìn)下游含ARE序列的抗氧化劑基因的轉(zhuǎn)錄，例如HO-1、SOD等，進(jìn)而在腦I/R損傷中發(fā)揮抗氧化作用[17]。HO-1可催化血紅素氧化生成游離鐵、膽綠素和CO，阻止游離血紅素參與氧化反應(yīng)，發(fā)揮抗氧化、抗炎以及抑制細(xì)胞凋亡等作用[18]。SOD是機(jī)體重要的抗氧化酶，可通過歧化反應(yīng)清除氧自由基并阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。根據(jù)結(jié)合金屬離子種類，SOD分為SOD1、SOD2和SOD3。SOD2(Mn-SOD)存在于線粒體內(nèi)，參與保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，在腦I/R損傷中起著神經(jīng)保護(hù)作用[19-20]。大量研究證實(shí)，Nrf2的缺失或下降會(huì)加劇腦I/R大鼠的腦梗塞和神經(jīng)功能缺損，并降低下游抗氧化酶的表達(dá)[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于正常組，腦I/R大鼠損傷后，其腦缺血組織的Keap1表達(dá)升高，Nrf2核轉(zhuǎn)位及HO-1和SOD2的表達(dá)顯著降低，但清熱化瘀方可明顯促進(jìn)腦I/R損傷組織中Nrf2核轉(zhuǎn)位及HO-1和SOD2的表達(dá)，抑制Keap1表達(dá)，表明腦I/R損傷減弱了機(jī)體的抗氧化防御機(jī)制，而清熱化瘀方可顯著增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化劑防御的能力，且可通過抑制Keap1表達(dá)，激活Nrf2信號(hào)通路，具有顯著的抗氧化效應(yīng)，進(jìn)一步說明激活Nrf2介導(dǎo)的抗氧化機(jī)制可抑制腦I/R損傷。

miRNA是一種短鏈的非編碼單鏈RNA，通過與目標(biāo)mRNA的3′UTR結(jié)合來抑制基因表達(dá)。近年來越來越多的研究證實(shí)，miRNA的異常表達(dá)與CIS的發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后均有密切聯(lián)系。干擾miR-129-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了金錢草提取物對(duì)I/R大鼠腦損傷的保護(hù)作用[23]，表明miRNA在藥物改善腦I/R損傷中起關(guān)鍵作用。另外，miR-34b可通過直接靶向抑制Keap1蛋白水平，增加Nrf2和HO-1的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)腦I/R大鼠誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮保護(hù)作用[24]，表明Keap1/Nrf2在腦I/R損傷中的抗氧化機(jī)制可能受miRNA的調(diào)控。人參皂苷Rg1可通過抑制miR-144的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)miR-144下游靶標(biāo)Nrf2的轉(zhuǎn)錄水平，從而減輕I/R后的氧化應(yīng)激損傷[25]，進(jìn)一步提示神經(jīng)保護(hù)劑在腦I/R損傷中的抗氧化效應(yīng)與miRNA有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，TargetScan預(yù)測結(jié)果顯示，Keap1是miR-18a-3p的潛在靶標(biāo)，經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果證實(shí)，miR-18a-3p靶向Keap1基因的3′UTR；并且，miR-18a-3p在腦I/R大鼠模型腦組織中的表達(dá)顯著低于正常大鼠，而清熱化瘀方治療腦I/R大鼠后，可顯著上調(diào)miR-18a-3p的表達(dá)，表明miR-18a-3p參與了腦I/R損傷機(jī)制，且清熱化瘀方對(duì)腦I/R的抗氧化作用機(jī)制與miR-18a-3p密切有關(guān)。

4 結(jié)論

清熱化瘀方是治療腦I/R損傷的有效方劑，可有效抑制腦I/R大鼠腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，其機(jī)制可能與促進(jìn)缺血腦組織miR-18a-3p表達(dá)，進(jìn)而抑制Keap1表達(dá)，促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位有關(guān)，這進(jìn)一步表明清熱化瘀方作為神經(jīng)保護(hù)劑在臨床應(yīng)用方面具有較高的價(jià)值。腦I/R損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，涉及多種機(jī)制與多條信號(hào)通路，且清熱化瘀方也具有多種效用，故清熱化瘀方改善腦I/R損傷的效應(yīng)與機(jī)制仍需要深入探討。