徐鴻毅，陳 鑫，田佳榕，廖暉淇，張 鑫，李 欣，席園園，張昌軍,4

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，十堰 442000；2.湖北省生殖醫(yī)學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，十堰 442000；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)藥研究院，十堰 442000；4.湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，十堰 442000)

在人類輔助生殖助孕技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)中，獲得高質(zhì)量的胚胎對患者最終獲得成功妊娠非常重要。卵子質(zhì)量是影響配子受精和胚胎質(zhì)量的重要因素。目前卵子形態(tài)學(xué)特征是有效評價卵子質(zhì)量和預(yù)測胚胎發(fā)育潛能的指標(biāo)。透明帶是卵子重要組成部分，同時也是反應(yīng)卵子質(zhì)量的指標(biāo)之一，其形態(tài)或結(jié)構(gòu)異常改變影響著卵子的發(fā)育、受精及后期胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局[1]。本研究中的卵子透明帶形態(tài)學(xué)異常，是卵子異常中具有特征性的一種，表現(xiàn)為致密透亮，呈“蠟樣”變性，卵周間隙小，第一極體不明顯等。本文旨在探討所致透明帶異常的可能原因以及其對后期受精和胚胎結(jié)局的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象 回顧分析2015年1月至2018年12月在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行輔助助孕患者共478例，其中均為特征性的致密透亮“蠟樣”透明帶卵子共114例,排除透明帶顏色異常，部分透明帶異常及其他類型的異常。再根據(jù)透明帶表面不同形態(tài)分兩組：透明帶表面毛刺狀組：表面呈毛刺狀，其他表現(xiàn)部分卵周間隙小，第一極體不明顯；透明帶表面光滑組：表面光滑，其他表現(xiàn)卵周間隙小或無，第一極體不明顯，卵子部分外周顆粒細(xì)胞和放射冠缺如。見圖1。相同條件下同一天取卵中同一方案隨機(jī)選取透明帶的形態(tài)正常組364例,且均為選擇D3胚胎移植。所有患者平均年齡(30.02±4.12)歲，不孕年限(4.18±2.24)年，不孕原因包括為輸卵管性不孕254例,排卵障礙82例，子宮內(nèi)膜異位癥22例,多囊卵巢綜合征32例，原因不明19例，男性因素86例，混合型因素17例。3組不孕原因的比例均無顯著差異，男女雙方染色體均正常。本研究符合《赫爾辛基宣言》原則。

圖1 兩種異常形態(tài)透明帶卵子

1.2 超促排卵及卵泡監(jiān)測 本中心主要方案為長效降調(diào)節(jié)方案和高孕激素狀態(tài)下促排卵(PPOS)方案。長效降調(diào)節(jié)方案：月經(jīng)第3天行B超及血清抗苗勒管激素(AMH)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌激素(E2)、孕激素(P)檢查，予長效達(dá)菲林(德國輝凌公司產(chǎn))3.75mg肌注，35天后行B超及血清性激素檢查，當(dāng)E2<50pg/mL，LH<5mIU/mL，F(xiàn)SH<5mIU/mL，P<1ng/mL，則開始啟動外源性重組促性腺激素(Gn)(rFSH，默克雪蘭諾，德國)75～300IU/d或人絕經(jīng)期促性腺激素(hMG，珠海麗珠)。卵泡直徑達(dá)到16mm，開始每日行B超及血清FSH、LH、E2、P檢查，當(dāng)至少3個優(yōu)勢卵泡直徑達(dá)到20mm，注射HCG 10000IU(HCG，珠海麗珠)，34～36h后陰道超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵。PPOS方案：月經(jīng)第2～3天行B超及血清FSH、LH、E2、P檢查，開始口服安宮黃體酮片10mg/d，同時給予Gn 75～225IU/d，當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)到18～20mm，停用Gn和安宮黃體酮，同時注射達(dá)菲林(或達(dá)必佳)0.1～0.2mg，加HCG 2000IU，36～37h取卵。

1.3 卵子收集及體外受精 患者穿刺獲得卵冠丘復(fù)合物(OCCCs),在體式顯微鏡下收集并識別卵子，OCCCs孵育2～4h，將優(yōu)化后精子加至OCCCs所在培養(yǎng)滴中，精子濃度為5000～10000條/卵。精、卵共孵育4～5h,剝除卵周顆粒細(xì)胞。觀察到的明顯第一極體或極體扁平或極體內(nèi)嵌狀態(tài)均視為成熟卵。常規(guī)授精精卵孵育4～6h，若所有卵子都沒有第二極體則采用補救性胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)，過夜觀察原核情況，如觀察到兩原核(PN)則認(rèn)為受精成功。獲卵率=獲卵數(shù)/HCG日直徑大于14mm的卵泡數(shù)。MII卵率=成熟卵率/卵子總數(shù)；IVF 2PN率=2PN數(shù)/卵子總數(shù)；ICSI 2PN率=2PN數(shù)/成熟卵數(shù)。

1.4 胚胎培養(yǎng)及妊娠判斷 取卵后的第3天進(jìn)行胚胎形態(tài)學(xué)評分，胚胎評判標(biāo)準(zhǔn)：I級：卵裂球大小均勻，碎片<10%；II級：卵裂球大小均勻或略不均勻，碎片10%～20%；III級：卵裂球大小明顯不均勻，碎片20%～50%；IV級：卵裂球大小嚴(yán)重不均勻，碎片在50%以上。I～I(xiàn)II級胚胎均為可用胚胎，長效降調(diào)節(jié)方案采用新鮮胚胎移植，PPOS方案采用凍融胚胎移植，移植時應(yīng)優(yōu)先選擇評分高的胚胎，胚胎移植后第14天，進(jìn)行血清HCG檢測，數(shù)值大于5IU/L為生化妊娠，第4周B超檢查有胎心搏動即可確認(rèn)為臨床妊娠。卵裂率=2PN卵裂數(shù)/2PN數(shù)；優(yōu)質(zhì)胚胎率=來源2PN優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/來源2PN卵裂胚胎數(shù)；可用胚胎率=可用胚胎數(shù)/卵裂胚胎數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般情況 共納入患者478例，其中卵子正常組(對照組)364例，共獲得卵子3150個，其中成熟卵子2945個;透明帶表面毛刺狀65例，共獲得卵子430個，成熟卵子368個;表面光滑的卵子49例，共獲得卵子270個，成熟卵子199個。異常透明帶組的平均年齡、體質(zhì)量指數(shù)、原發(fā)和繼發(fā)不孕比例、基礎(chǔ)內(nèi)分泌、AMH，HCG日P、LH水平，Gn劑量和天數(shù)，促排卵方案，與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05)。表面光滑的異常透明帶組的不孕年限、扳機(jī)日E2水平低于其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 臨床特征比較

2.2 患者取卵、受精、胚胎情況 卵子正常組的獲卵率最高，透明帶表面光滑組獲卵率最低，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；正常組的獲卵數(shù)顯著高于其兩組(P<0.01)，其中表面毛刺狀比光滑透明帶獲卵數(shù)略高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05)；3組補救ICSI率相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)；正常卵子組的正常受精率、異常受精率、卵裂率與透明帶表面光滑組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；正常卵子組的優(yōu)質(zhì)胚胎率最高，卵子表面光滑組最低，3組組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。正常卵子組的平均移植胚胎數(shù)較其他兩組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 取卵、受精和胚胎質(zhì)量比較

2.3 患者妊娠結(jié)局 正常卵子組的生化妊娠率最高，卵子表面光滑組最低，3組組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；正常卵子組的臨床妊娠率最高，卵子表面光滑組最低，3組組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；正常卵子組種植率最高，與透明帶表面光滑組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，透明帶表面毛刺狀組與透明帶表面光滑組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05)。見表3。

表3 妊娠結(jié)局分析

3 討 論

研究報道，人類IVF中卵子透明帶異常發(fā)生率2%～5%[2]。在臨床工作中，通?？捎^察到不同類型的透明帶異常現(xiàn)象，如透明帶不規(guī)則，暗色或棕色透明帶，雙透明帶等。透明帶由多種糖蛋白構(gòu)成，主要是ZP1、ZP2、ZP3、ZP4四種蛋白，其中透明帶的任一種蛋白缺失,都可能導(dǎo)致透明帶結(jié)構(gòu)和形態(tài)的異常,甚至影響卵子發(fā)育、精子的頂體反應(yīng)，導(dǎo)致受精失敗[3-4]。ZP蛋白異常也可能直接反映卵母細(xì)胞成熟缺陷[5]。研究報道，ZP2敲除的小鼠中，卵泡早期ZP1和ZP3蛋白是可以被合成，并相互交聯(lián)組裝為一層更薄的透明帶，但卵子不能受精[6]。同時透明帶成分和超微結(jié)構(gòu)異常也可導(dǎo)致卵子不受精[7]。本文中異常透明帶卵子與正常卵子在鏡下觀察透明帶形態(tài)上致密透亮，似“蠟樣”變性，表面呈放射狀或光滑狀，并表現(xiàn)卵子成熟率低、不受精現(xiàn)象，而透明帶表面光滑組卵子變性更嚴(yán)重，均出現(xiàn)不受精，可能與透明帶結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變有關(guān)。2012年報道[8]了3例患者卵子透明帶形狀不規(guī)則、質(zhì)地呈膠凍狀,類似于本研究中的卵子形態(tài)，通過透明帶糖蛋白的免疫熒光染色，考慮ZP3存在缺陷的可能，但在透明帶試驗中表現(xiàn)出正常的精子結(jié)合能力，因此并不認(rèn)為該種透明帶的異常是由于基因的遺傳改變所致。

卵母細(xì)胞的微絨毛與透明帶相互滲透,形成縫隙連接,從而使壁層顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、卵母細(xì)胞共同形成一個結(jié)構(gòu)上和功能上的合胞體，卵子通過微絨毛與穿過透明帶的卵泡細(xì)胞微絨毛形成連接而進(jìn)行物質(zhì)交換,為正常卵子的發(fā)育、成熟以及透明帶提供營養(yǎng)物質(zhì)和調(diào)節(jié)信號[9]。本研究中放射冠顆粒細(xì)胞缺如，多數(shù)透明帶薄，密度較高,可能不利于卵泡細(xì)胞微絨毛經(jīng)過透明帶到達(dá)卵黃膜表面,從而影響卵子的發(fā)育。雌激素的產(chǎn)生是LH和卵泡膜細(xì)胞LH受體結(jié)合后，使膽固醇合成睪酮和雄烯二酮。FSH和顆粒細(xì)胞上FSH受體結(jié)合，激活芳香化酶，將進(jìn)入到顆粒細(xì)胞內(nèi)的睪酮和雄烯二酮轉(zhuǎn)化為雌激素E2和E1,再進(jìn)入血液循環(huán)和卵泡液中。本研究結(jié)果顯示，透明帶表面光滑組患者取卵手術(shù)獲卵率和HCG日雌激素較其他兩組低，可能是由于卵子周圍顆粒細(xì)胞缺如，失去與卵子正常連接，表面光滑透明帶組表現(xiàn)更為嚴(yán)重，有的甚至近似裸化卵子，因此可能導(dǎo)致在取卵抽吸過程中卵子丟失。另一方面由于部分顆粒細(xì)胞缺失，與透明帶失去正常連接，可能影響顆粒細(xì)胞的正常功能，導(dǎo)致無足夠的雌激素分泌。本研究正常組和異常透明帶組的患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)及各類不孕原因比例并無統(tǒng)計學(xué)意義，但異常組的AMH偏低，且較其他兩組不孕時間長。表明不孕患者卵巢功能可能受到某種因素長期刺激，使卵巢內(nèi)環(huán)境或卵巢功能改變，導(dǎo)致透明帶變性。類似于本研究中的卵子，有研究認(rèn)為[10]，透明帶異常與促排卵方案關(guān)系不大，患者更換方案后仍出現(xiàn)異常類似現(xiàn)象，表明可能與遺傳基因有關(guān)。

不同的透明帶異常情況可能導(dǎo)致不同的結(jié)局。文獻(xiàn)報道，顏色異常卵子，如暗色透明帶，可能降低受精率、種植率和妊娠率[11]。透明帶形態(tài)異常與IVF胚胎植入率、臨床妊娠率、出生率等降低有關(guān)[12]。本文中的異常透明帶卵母細(xì)胞在IVF中并不多見，除了共同的特征透明帶致密透亮、卵周間隙小外，一種透明帶表層呈毛刺狀，部分卵周間隙較小，另一種表面較光滑，幾乎所有卵子間隙極小，第一極體不明顯呈扁平或鑲嵌狀。Esfandiari等[13]報道了1例類似的透明帶形狀異常女性通過ICSI治療獲得成功受精、胚胎發(fā)育和妊娠。因此建議不要丟棄具有極端形態(tài)異常的卵母細(xì)胞，因為ICSI可克服受精和卵裂的障礙。2013年國內(nèi)外同時報道了一種類似的透亮致密的卵子[14-15]，取卵較困難，低受精能力，只有通過ICSI改善其受精，但不能改善其妊娠結(jié)局。

2014年報道的窄卵周隙卵子[16]，主要表現(xiàn)為卵母細(xì)胞周圍顆粒細(xì)胞較少，近似裸卵，卵母細(xì)胞透明帶玻璃樣，極體扁平或不可見，ICSI時易破膜，無抵抗，注射后與正常卵母細(xì)胞相比，無皺褶產(chǎn)生，但幾乎沒有卵子退化，這與本研究中卵子一致。結(jié)果顯示，卵子低成熟率，多數(shù)常規(guī)不受精和低妊娠率。2015年報道的透明帶呈鋸齒狀[17]，卵子成熟度低，妊娠率低，但I(xiàn)CSI后正常受精率沒有區(qū)別。以上報道與本研究結(jié)果一致，但沒有區(qū)分透明帶表面的形態(tài)。本研究結(jié)果顯示，兩組異常卵子低成熟率、高受精障礙率、低妊娠率，其中透明帶表面光滑組結(jié)局更差，所有卵子均不能受精，盡管行補救性ICSI后受精情況有所改善，但胚胎質(zhì)量和臨床妊娠仍不盡如意。本研究中，透明帶異常的兩組共15例嬰兒出生，隨訪過程中暫未發(fā)現(xiàn)身體結(jié)構(gòu)、功能或代謝異常等出生缺陷，與正常組相比并無差異。初步表明透明帶異常患者一旦獲得妊娠，對子代健康并無明顯影響。但樣本量小，隨訪年限短，需進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行遠(yuǎn)期隨訪。

總之，在IVF中“蠟樣”透明帶的卵子發(fā)育較差，形成的胚胎質(zhì)量較差，最終導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)胚胎率和妊娠率過低。這類的卵子、胚胎質(zhì)量較差，較難形成囊胚，故建議選擇卵裂期胚胎進(jìn)行移植。因“蠟樣”透明帶的卵子常規(guī)IVF后精卵不結(jié)合，表面呈毛刺狀的卵子采用ICSI助孕可以有效改善卵母細(xì)胞受精，使部分患者獲得妊娠，但是表面光滑、無卵周間隙、極體不明顯的卵子采用ICSI后并不能改善其胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局。本研究由于倫理限制，其形成原因和機(jī)制需進(jìn)一步研究；且病例數(shù)量有限，時間跨度較長，需增加樣本量或多中心對照研究。