何蓓 章慶國(guó)

【提要】 小耳畸形是我國(guó)第二多見的先天性顱面部疾病，主要表現(xiàn)為耳廓發(fā)育不全，部分患者同時(shí)合并外耳道狹窄或閉鎖、中耳畸形。多年來(lái)，耳廓再造因其復(fù)雜性和精細(xì)性一直是整形外科面臨的巨大挑戰(zhàn)。自體肋軟骨移植和Medpor 支架植入是目前臨床最常用的兩種手術(shù)方式，但依舊存在各自的局限性。近年來(lái)，以組織工程和3D 打印技術(shù)為核心的耳廓構(gòu)建模式取得了一定的研究成果，給未來(lái)小耳畸形的治療提供了新的可能。

先天性小耳畸形是胚胎在耳廓發(fā)育期間受到遺傳或外界因素影響最終出現(xiàn)外耳表現(xiàn)異常的疾病，常伴有外耳道狹窄或閉鎖、中耳畸形和（或）頜面畸形，除了影響外觀和功能外，也給患兒心理健康造成負(fù)面影響。手術(shù)是治療小耳畸形的最佳手段，目前耳廓再造的手術(shù)方法主要是自體肋軟骨移植和Medpor 支架植入，但現(xiàn)有材料和方法可能造成各種并發(fā)癥。隨著組織工程和3D 打印技術(shù)在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛研究和運(yùn)用，有望構(gòu)建出符合天然耳廓組織學(xué)、功能和形態(tài)的新型耳廓支架，為小耳畸形的治療提供新的選擇，以克服目前常用支架的不足。本文就耳廓再造中利用的主要材料，以及近年來(lái)以組織工程、3D 打印技術(shù)為基礎(chǔ)進(jìn)行的耳廓構(gòu)建研究進(jìn)行綜述。

1 自體肋軟骨和Medpor 支架

自體肋軟骨具有來(lái)源豐富、組織相容性良好、耐壓性強(qiáng)、無(wú)排斥反應(yīng)等眾多優(yōu)點(diǎn)，是目前國(guó)內(nèi)外耳廓再造手術(shù)的首選支架材料，主要通過手工雕刻成形后進(jìn)行一期或多期植入。但該方法存在諸多不足，最顯著的為供區(qū)相關(guān)并發(fā)癥，最常見是供區(qū)疼痛，及其導(dǎo)致的呼吸變慢變淺，從而引起術(shù)后肺不張、肺部感染等[1]；另外還有供區(qū)瘢痕、氣胸、胸廓畸形等[2-3]。目前，患兒的手術(shù)年齡受自體肋軟骨發(fā)育情況限制[4]，且術(shù)中支架雕刻難度大，手術(shù)效果很大程度依賴于醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)與技術(shù)[5]。

1983 年，Berghaus 等[6]首次報(bào)道將多孔高密度聚乙烯運(yùn)用在耳再造手術(shù)中。1984 年，Medopr 被正式批準(zhǔn)可植入人體。Medpor 支架開放且互相交通的孔隙結(jié)構(gòu)有利于修復(fù)部位的組織和血管向內(nèi)生長(zhǎng)，具有良好的組織相容性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[7]。該材料經(jīng)過加熱后具有優(yōu)良的塑形性，已被廣泛用于鼻整形、眼眶整形、口腔頜面重建和顱骨重塑[8-9]。Medpor 耳支架分為“C”形耳輪和“Y”形耳基兩部分，組裝好的支架可以通過顳淺筋膜瓣伴皮片移植Ⅰ期完成耳再造，或通過耳后皮膚擴(kuò)張并或不并筋膜瓣覆蓋Ⅱ期完成再造手術(shù)[10]。該支架的使用使手術(shù)不受自體肋軟骨發(fā)育限制，手術(shù)平均年齡也可被適當(dāng)提前[11]。該支架內(nèi)部快速血管化保證了較強(qiáng)的抗感染能力，本身的惰性也增強(qiáng)了抗菌性。近年來(lái)，將該材料運(yùn)用在擴(kuò)張器期間耳后皮膚出現(xiàn)破潰感染[12]、燒傷性瘢痕耳[13]、部分耳廓缺損的修復(fù)[14]中也取得了不錯(cuò)的效果。雖然多年臨床實(shí)踐證明其排斥反應(yīng)和遠(yuǎn)期吸收率都很低，但是該材料物理性質(zhì)過硬、應(yīng)力性能較差，支架外露導(dǎo)致感染的風(fēng)險(xiǎn)較大，往往需重新植皮修復(fù)。目前建議只有當(dāng)肋軟骨鈣化嚴(yán)重或極不愿意使用自體肋軟骨的情況下考慮使用Medpor 支架[15]。

2 組織工程耳廓構(gòu)建

利用組織工程重建耳廓的理想情況是將具有成軟骨能力的種子細(xì)胞和支架材料結(jié)合，構(gòu)建出具有特定形態(tài)、組織及功能的人耳狀軟骨，植入體內(nèi)修復(fù)缺陷[16]。耳組織工程的核心在于支架材料和種子細(xì)胞的選擇。目前常用的支架材料根據(jù)來(lái)源可分為天然生物材料和人工合成材料，前者如膠原、透明質(zhì)酸、藻酸鹽、殼聚糖等，后者如聚羥基乙酸（Poly-glycolic acid，PGA）、聚乳酸（Poly-lactic acid，PLA）、聚己內(nèi)酯（Poly-caprolactone，PCL）、聚氨酯（Polyurethane，PUR）等[17-19]。種子細(xì)胞需要具備取材方便、增殖分化能力強(qiáng)、與支架材料組織相容性良好以及生物安全等特點(diǎn)，軟骨細(xì)胞和干細(xì)胞是耳組織工程研究中的主要細(xì)胞來(lái)源[20]。

2.1 軟骨細(xì)胞-支架構(gòu)建體

Zhao、Pomerantseva 等[21-22]分別嘗試將綿羊耳軟骨細(xì)胞接種在Ⅰ型膠原支架，前者觀察到了豐富的Ⅱ型膠原、彈力纖維等軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分生成，并提出在植入體內(nèi)之前有一個(gè)較長(zhǎng)的體外動(dòng)態(tài)培養(yǎng)時(shí)間更有利于預(yù)測(cè)支架的最終尺寸；而后者構(gòu)成的耳形支架也獲得了綿羊自體內(nèi)培養(yǎng)的成功。種植了兔耳軟骨細(xì)胞的PLA 支架、多孔PUR 人耳形支架[23-24]都在低免疫活性動(dòng)物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了成熟軟骨組織的再生，并保持了完整的耳廓形狀、良好的機(jī)械性能和熱學(xué)穩(wěn)定性。在對(duì)聚氨酯耳支架的進(jìn)一步探索中發(fā)現(xiàn)，規(guī)則的孔徑分布、合適的孔徑大小和高孔隙率是提高細(xì)胞增殖率，膠原和血管組織填充的關(guān)鍵因素[25]。NaKao 等[26]將人殘耳軟骨細(xì)胞接種在納米纖維PGA 支架上，得到了與正常耳軟骨細(xì)胞來(lái)源幾乎無(wú)異的軟骨組織。劉戈等[27]驗(yàn)證了人殘耳軟骨細(xì)胞聯(lián)合非降解PUR 支架用于修復(fù)耳廓組織缺損的可行性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)體內(nèi)環(huán)境比體外更利于軟骨組織生成。

天然材料雖具有良好的生物相容性、可吸收性，但機(jī)械強(qiáng)度差、降解速度不穩(wěn)定[28]。人工合成材料可以通過化學(xué)和物理變性而改變其生物和材料特性，具有較強(qiáng)的可塑性和機(jī)械性[29]，但其生物相容性大多不如天然生物材料，且降解產(chǎn)生的酸性物質(zhì)會(huì)改變細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的微環(huán)境。Cao 等[30]使用牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和PGA/PLA 材料構(gòu)成的3D 耳廓，在無(wú)胸腺小鼠體內(nèi)成功構(gòu)建了人耳形態(tài)組織工程軟骨，為組織工程耳廓的構(gòu)建提供了新思路，各類復(fù)合材料也成為主要的支架研究對(duì)象，旨在克服單一材料的缺陷[31]。García-López[32]在殼聚糖-聚乙烯醇-表氯醇水凝膠支架上接種豬耳軟骨細(xì)胞后也觀察到了耳軟骨類似組織形成。2018 年，Zhou 等[33]報(bào)道將患者自體殘耳軟骨細(xì)胞接種在3D 打印的PCL/PGA/PLA 耳形支架上，在人體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了組織工程耳廓軟骨組織的再生，象征著組織工程耳廓由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)向臨床轉(zhuǎn)化的重大進(jìn)展。Lee 等[34]將兔耳軟骨細(xì)胞分別接種在PLGA 支架、PLGA-Medpor 支架，結(jié)果發(fā)現(xiàn)后者可以產(chǎn)生更多成熟的軟骨組織，并具有更強(qiáng)的抗壓、抗皮膚張力能力。Medpor 的存在提供了良好的軟骨微環(huán)境并提高了支架的機(jī)械性能，而可生物降解的PLGA 和工程組織軟骨的包裹，又克服了Medpor 材質(zhì)過硬導(dǎo)致的暴露、感染問題。

軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)是一種理想的軟骨特異性仿生和低炎癥反應(yīng)天然生物材料。Jia 等[35]制備了牛肩胛軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)與明膠交聯(lián)劑1∶1、總成分濃度為2%的混合懸液，引入PCL內(nèi)芯，結(jié)合3D 打印、鑄造成型和冷凍干燥技術(shù)，成功設(shè)計(jì)出了具有合適機(jī)械強(qiáng)度的三維立體耳廓，結(jié)合山羊耳軟骨細(xì)胞后可在裸鼠體內(nèi)再生成軟骨樣組織，并且保持良好彈性和精確人耳形結(jié)構(gòu)。Bhattacharya 等[36]通過戊二醛交聯(lián)結(jié)合γ 輻射的新型脫細(xì)胞方法獲得了一種理想的無(wú)抗原活性的山羊脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)，并首次用于小耳畸形患者的耳廓重建，為脫細(xì)胞基質(zhì)在人耳狀軟骨再生中的應(yīng)用和臨床轉(zhuǎn)化提供了重要的支持。

但是，軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中隨著傳代數(shù)的遞增，往往會(huì)出現(xiàn)快速去分化，這可能與參與維持軟骨細(xì)胞表型的DNA 甲基化和miRNA 異常表達(dá)有關(guān)[37]。即便在目前已成功的臨床病例中，使用的都是體外傳代擴(kuò)增至2～3 代的自體殘耳軟骨細(xì)胞，而構(gòu)建正常耳廓軟骨細(xì)胞數(shù)量需求巨大，雖然采用添加生長(zhǎng)因子[38-40]、多層立體培養(yǎng)[41]、旋轉(zhuǎn)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)[42]等方式，均被證實(shí)可有效地誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖、保持?jǐn)U增后細(xì)胞表型穩(wěn)定，以及促進(jìn)軟骨組織形成，但是相應(yīng)地增加了技術(shù)難度和操作的繁瑣程度。

2.2 干細(xì)胞-支架構(gòu)建體

干細(xì)胞具有廣泛的分化潛能和更強(qiáng)的群體倍增能力。目前，軟骨組織工程常用的種子細(xì)胞有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow stem cells，BMSCs）和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）。BMSCs 被認(rèn)為比ADSCs 具有更高的軟骨形成潛能，在含有相同或不含有生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)條件下，前者能產(chǎn)生更多的Ⅱ型膠原和蛋白聚糖[43]。但是，ADSCs 來(lái)源廣泛，獲取方便[44]。Tang 等[45]通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BMSCs 聯(lián)合脫細(xì)胞外基質(zhì)支架無(wú)論是否添加外源性生長(zhǎng)因子都可以生成含量豐富的軟骨基質(zhì)，形成軟骨組織，克服了傳統(tǒng)添加外源性生長(zhǎng)因子、基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在誘導(dǎo)干細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞分化過程中可能出現(xiàn)的軟骨骨化，甚至導(dǎo)致病原體污染等問題[46]。含有ADSCs 與離體小腸黏膜下層共培養(yǎng)物的耳狀支架在裸鼠體內(nèi)長(zhǎng)期保持了其復(fù)雜結(jié)構(gòu)及良好的生物力學(xué)性能，這為提高組織工程耳廓的形態(tài)和力學(xué)穩(wěn)定提供了新的思路[47-48]。另外，Mahboudi 等[49]在聚左乳酸-聚乙烯醇納米纖維支架上成功誘導(dǎo)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，提供了一種可能用于耳廓組織工程的新型組合。Kim 等[25]構(gòu)建了負(fù)載扁桃體來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的3D 打印多孔聚氨酯支架和Medpor 支架，發(fā)現(xiàn)在體外隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，多孔聚氨酯材料比Medopr 具有更強(qiáng)的細(xì)胞增殖率，而在動(dòng)物體內(nèi)前者生成了更明顯的膠原纖維和血管，支架的力學(xué)性能也與耳廓軟骨相似，有望成為一種新的支架替代選擇。

2.3 干細(xì)胞-軟骨細(xì)胞-支架構(gòu)建體

干細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)也是目前熱門的研究方向，軟骨細(xì)胞分泌系列生長(zhǎng)因子可以模擬天然軟骨微環(huán)境，誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化[50]，其分泌的甲狀旁腺激素（PTH）也具有抑制干細(xì)胞成骨分化的能力[51]，干細(xì)胞的存在又減輕了軟骨細(xì)胞數(shù)量需求的負(fù)擔(dān)。1∶1 混合培養(yǎng)豬軟骨細(xì)胞與豬ADSCs 高彈性冷凍凝膠（明膠/軟骨素-6-硫酸鹽/透明質(zhì)酸/殼聚糖）三維支架[52]和1∶1 混合培養(yǎng)人耳軟骨細(xì)胞與人BMSCs 的膠原水凝膠人耳狀支架[29]，兩者均觀察到了與天然軟骨相似的健康軟骨組織形成。Sterodimas 等[53]首次在具有免疫活性的動(dòng)物體內(nèi)植入絲素蛋白/海藻酸鹽—軟骨間充質(zhì)干細(xì)胞/兔耳軟骨細(xì)胞3D 耳形支架，成功再生細(xì)胞外基質(zhì)和軟骨組織，且支架保持了基本的形態(tài)和柔韌性，證明這種共培養(yǎng)模式和支架組合在真實(shí)生物體內(nèi)的可行性。

3 3D 生物打印技術(shù)

有別于傳統(tǒng)的3D 打印，生物打印的材料同時(shí)含有液態(tài)生物材料、種子細(xì)胞以及必要的活性因子，又稱之為生物墨水。其優(yōu)勢(shì)在于可以通過對(duì)生物墨水的精確分層放置，直接生成細(xì)胞和生物材料一體化的結(jié)構(gòu)，達(dá)到既能控制功能成分空間位置，又具有特定形態(tài)的目的[54]，為具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)及組織的再生提供了新的方法。

3D 生物打印分為成像與設(shè)計(jì)、生物墨水的選擇和打印三個(gè)步驟。目前常用的打印方式有噴墨、擠壓和光輔助打印[55-56]。噴墨打印方法簡(jiǎn)單、靈活且成本低廉，可以打印單個(gè)細(xì)胞，所以分辨率高。缺點(diǎn)是只能打印液體材料，且由于生物墨水的沉積容易導(dǎo)致噴頭堵塞，因此打印時(shí)細(xì)胞密度低，不利于組織構(gòu)建。擠壓法可以打印各種黏度的水凝膠材料和高密度細(xì)胞，且能維持比較精確和完整的形狀結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)是細(xì)胞分辨率低，而且打印過程中會(huì)對(duì)細(xì)胞造成較大的壓力而導(dǎo)致部分細(xì)胞失活。光輔助打印又分為基于數(shù)字光處理打?。―LP）和激光輔助打印。DLP 打印的焦距為納米級(jí)，所以分辨率高，而且是通過對(duì)平面投影進(jìn)行打印，能保持較高的機(jī)械完整性，所以適用于打印光滑、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的模型。激光輔助打印的細(xì)胞分辨率和存活率都很高，但是打印成本較貴，而且打印的生物原材料僅限于光敏聚合物。

目前已知的可打印的生物墨水種類較少。Héctor 等[57]以人鼻軟骨細(xì)胞-納米纖維素-海藻酸鈉為復(fù)合生物墨水，采用微閥頭聯(lián)合噴墨打印技術(shù)構(gòu)建形成了三維立體耳廓，觀察到軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)成分的生成。Lee 等[58]以聚乙二醇為犧牲層，將負(fù)載軟骨細(xì)胞的海藻酸鈉水凝膠和PCL 采用噴頭打印技術(shù)實(shí)現(xiàn)三維耳軟骨組織的再生，通過添加可生物降解的PCL 材料改善了單純水凝膠支架機(jī)械強(qiáng)度不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。Bhamare 等[59]通過擠壓法對(duì)山羊耳廓軟骨細(xì)胞與聚乙烯醇/明膠組成的生物墨水進(jìn)行逐層打印堆積，實(shí)現(xiàn)了人耳形耳廓的快速自動(dòng)打印，也成功再生細(xì)胞外基質(zhì)、血管及軟骨組織。Kang 等[60]描述了一種ITOP 集成打印裝置，以Pluronic F-127水凝膠為犧牲層，將載有兔耳軟骨細(xì)胞的復(fù)合水凝膠（明膠、纖維蛋白原、透明質(zhì)酸和甘油）和PCL 按照特定模式打印成具有穩(wěn)定機(jī)械強(qiáng)度的人耳狀軟骨結(jié)構(gòu)，在裸鼠體內(nèi)收獲了與天然兔耳相似的軟骨組織。這種集成模式的優(yōu)勢(shì)在于可以在精確的位置融合多種細(xì)胞類型，生成各種自由的三維結(jié)構(gòu)，有望在臨床中再生缺損的組織和器官，再現(xiàn)其自然結(jié)構(gòu)和功能。

4 總結(jié)與展望

目前在動(dòng)物體內(nèi)外構(gòu)建了許多穩(wěn)定的、可供耳軟骨細(xì)胞良好生長(zhǎng)和分化的三維立體耳廓模式，但仍然存在許多難題需要攻克。首先，3D 生物打印對(duì)生物墨水的種類、組成成分要求較高，已知可供打印的生物墨水種類很少；其次，如何協(xié)調(diào)組織工程支架在體內(nèi)降解與軟骨組織再生速率之間的平衡，保證耳廓形態(tài)得到長(zhǎng)久維持；再者，目前大量的研究局限于體外實(shí)驗(yàn)和無(wú)免疫原性的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，正常生物體內(nèi)的長(zhǎng)期安全性和有效性尚未得到有效驗(yàn)證。另外，現(xiàn)在的研究集中于可植入的耳廓軟骨組織，尚未涉及更復(fù)雜的組織，比如脂肪、覆蓋的軟骨膜和皮膚等。未來(lái)的研究或許可以利用3D 生物打印技術(shù)通過將軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、上皮細(xì)胞與液態(tài)生物材料混合，進(jìn)行成分的區(qū)域分配，提高再造耳的組織復(fù)雜性，減少需要提前擴(kuò)張皮瓣或者同期、延期行皮瓣筋膜移植覆蓋的步驟，收獲真正具有完整組織的組織工程耳，為耳畸形患者的耳廓重建開創(chuàng)新的方向。