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      以凝固型發(fā)酵乳為樣本探究pH對大腸菌群的影響

      2022-03-24 11:54:42李玉平孫叢叢
      現(xiàn)代食品 2022年3期
      關(guān)鍵詞:平皿大腸菌群稀釋液

      ◎ 李玉平,李 鵬,孫叢叢,凌 森

      (河北三元食品有限公司,河北 石家莊 050700)

      溶液的pH值等于溶液中氫離子濃度的負對數(shù),代表了溶液的酸堿度。pH值是影響微生物生長的一個關(guān)鍵因素,微生物會因細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變性和核酸的變異出現(xiàn)生物活性下降的現(xiàn)象;當pH有所改變時,營養(yǎng)物質(zhì)會因受到影響而發(fā)生改變,導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的有效利用率降低,微生物的生長速度隨之下降[1]。不同微生物適宜生存的pH環(huán)境不同,在溫度、水分等條件適宜的情況下,菌體內(nèi)酶的活性在最適pH或最適pH區(qū)間時最高,生長速度也最快,環(huán)境的pH發(fā)生變化會在一定程度上影響微生物的生長速度,在一定pH區(qū)間外微生物會受到損傷而死亡[1]。

      大腸菌群(Coliforms)一般指一群在特定培養(yǎng)條件下能夠發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌[2]。該菌群與人們的生活息息相關(guān),常出現(xiàn)在糞便和被糞便污染的地帶。大腸菌群計數(shù)是評價食品衛(wèi)生狀況的重要指標之一,在食品衛(wèi)生方面中得到廣泛使用[3]。大腸菌群含量的高低不僅可以反映食品被糞便污染的程度,還可以直接影響食品的儲存期、口感和人體健康。大腸菌群是條件性致病菌,其較強的產(chǎn)毒能力決定了其具有較低的感染劑量,感染大腸菌群后的中毒反應(yīng)有發(fā)熱、嘔吐、腹瀉和腹痛等。一直以來人們都在不斷關(guān)注著影響大腸菌群檢測結(jié)果準確性的因素及注意事項,持續(xù)探究著大腸菌群的生存特點。為了得到更加準確的大腸菌群計數(shù)結(jié)果,首先要熟練掌握國家檢驗標準,從方法的適用性、培養(yǎng)基及試劑的滅菌要求、使用溫度和使用量、操作步驟(樣品稀釋、接種時間、培養(yǎng)溫度和時間)、平板計數(shù)和證實試驗到結(jié)果報告等每個環(huán)節(jié)都要嚴格按照標準要求進行。在研究大腸桿菌的生存特點時發(fā)現(xiàn),在不同的極端環(huán)境下,大腸桿菌會產(chǎn)生不同的應(yīng)激機制,有針對性地對抗高壓、低溫、高熱和高酸等壓力帶來的威脅。近幾年有不少學(xué)者對大腸桿菌的耐酸性進行了研究,不同的酸性條件下大腸桿菌的生長情況也不盡相同。

      李小媚等[4]研究表明,pH值為5.0~7.0時,大腸桿菌(0157:H7)可以良好地生長;pH值為2.0~4.0時,大腸桿菌(0157:H7)的生長受到了抑制;當pH值<2.0時,大腸桿菌(0157:H7)幾乎被全部殺死。另外,當環(huán)境中的pH值不同時,大腸桿菌(0157:H7)所呈現(xiàn)出來的形態(tài)也有所不同,當環(huán)境的pH值降低時細胞由長桿狀變成短桿狀或橢圓狀,由此可見大腸桿菌(0157:H7)對酸的耐受性較強,可以很好地對抗酸性環(huán)境對其生長的影響。這一特性使得酸性果汁、乳制品等酸性或發(fā)酵食品極易被大腸桿菌污染,同時也反映出了在對食品進行大腸菌群計數(shù)檢驗過程中,pH是影響檢測結(jié)果的重要因素之一[5]。為探究不同pH值對大腸菌群生長的影響,本試驗以凝固型發(fā)酵乳為樣本,采用平板計數(shù)的方法,分別對存放前后的已接種等量大腸埃希氏菌的不同pH值的樣本稀釋液進行大腸菌群計數(shù)。通過比較存放前后大腸菌群含量的變化來判定pH對大腸菌群生長的影響[6]。

      1 材料與方法

      1.1 儀器與設(shè)備

      滅菌吸管、直徑為90 mm的無菌平皿、無菌錐形瓶、試管和水浴鍋,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;(36±1)℃電熱恒溫培養(yǎng)箱,DNP-9272BS-Ⅲ,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;pH計,DELTA320,梅特勒托利多有限公司;電子天平,T1000,常熟市雙杰測試儀器廠;高壓滅菌器,YXQ-100A,上海博訊實業(yè)有限公司。

      1.2 試劑

      0.85%無菌生理鹽水、1 mol·L-1NaOH 溶液、1 mol·L-1HCl溶液,均為自制。

      1.3 培養(yǎng)基

      本次試驗使用的培養(yǎng)基均按照《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》(GB 4789.28—2013)的要求進行質(zhì)量驗收,且驗收合格的商品化脫水合成培養(yǎng)基。

      結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA):嚴格按照培養(yǎng)基標簽上的方法進行配制,臨用前制備。

      煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯:嚴格按照培養(yǎng)基標簽上的方法進行配制,分裝至放有倒置玻璃小導(dǎo)管的試管中,每管10 mL,121℃條件下高壓滅菌15 min。

      1.4 試驗方法

      1.4.1 菌懸液

      本次試驗使用的是從美國典型菌株保藏中心購入的大腸埃希氏菌,菌懸液由儲備菌株在BHI(非選擇性肉湯)中培養(yǎng)過夜后制得[7]。

      1.4.2 樣品稀釋

      無菌條件下,準確稱量50 g樣本于裝有50 mL無菌生理鹽水的容器中,充分混勻,共制備6份,對稀釋液分別編號為S0、S1、S2、S3、S4和S5,用1 mol·L-1NaOH 溶液和 1 mol·L-1HCl溶液調(diào)節(jié)各稀釋液的pH值,測得各稀釋液的pH值依次為4.4(未調(diào)pH)、2.0、3.0、4.4(未調(diào)pH)、5.3和6.8。

      1.4.3 大腸菌群計數(shù)

      (1)對S0(未接種)進行大腸菌群計數(shù)測試。用無菌吸管吸取S0稀釋液于2個無菌培養(yǎng)皿中,每皿2 mL,此接種量相當于1 mL樣本原液,記為100;同樣量取2 mL S0稀釋液至裝有8 mL無菌生理鹽水的試管中,振蕩均勻,用無菌吸管量取上述勻液至2個無菌平皿,每皿1 mL,此接種量相當于0.1 mL樣本原液,記為10-1。另取1 mL無菌生理鹽水至無菌培養(yǎng)皿中,作為空白對照。

      (2)對S1~S5(接種)進行大腸菌群計數(shù)測試。向稀釋液S1、S2、S3、S4和S5中分別加入ATCC 25922大腸埃希氏菌的工作菌懸液1 mL,振蕩均勻,用無菌吸管吸取各個已接種的稀釋液,分別接種至2個無菌平皿,每皿2 mL,記為100;量取2 mL各稀釋液于盛有8 mL無菌生理鹽水的試管中,充分混勻,記為10-1;用無菌吸管量取10-1勻液1 mL于盛有9 mL生理鹽水的試管中(吸管尖端不要觸及稀釋液面),充分混勻,制成10-2的樣品勻液。按前面的操作,制成10倍遞增系列稀釋液。每個稀釋度,換用1支無菌吸管。取多個連續(xù)稀釋度,每個稀釋度接種2個無菌平皿,每皿1 mL。

      (3)向所有平皿中倒入46 ℃左右的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂,每皿需倒15~20 mL。順時針搖晃平皿,使培養(yǎng)基和接種的樣液混合充分,放置一段時間,至瓊脂完全凝固后,倒入3~4 mL VRBA覆蓋整個平板。完全凝固后,將平皿倒置,在(36±1)℃條件下培養(yǎng)18~24 h。

      (4)接種完成后,將稀釋液S1~S5放置6.5 ℃環(huán)境中存放1 d,重復(fù)上述操作。

      (5)培養(yǎng)結(jié)束后,嚴格按照《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)》(GB 4789.3—2016)9.3的規(guī)定,計數(shù)典型和可疑菌落數(shù)。典型菌落是紫紅色,有紅色的膽鹽沉淀環(huán)在其周圍。嚴格按照《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)》(GB 4789.3—2016)9.4證實試驗的規(guī)定,從VRBA平板上取10個典型單個菌落,轉(zhuǎn)種于BGLB肉湯試管內(nèi),于(36±1)℃條件下培養(yǎng)24~48 h,結(jié)果BGLB肉湯管均有氣體產(chǎn)生。

      2 結(jié)果與分析

      試樣S0(未接種)的計數(shù)結(jié)果為<1 CFU·g-1,說明樣本沒有被大腸菌群污染;分別對S1~S55個試樣的各稀釋度平板進行大腸菌群計數(shù),結(jié)果見圖1。

      從圖1可以看出,試樣的pH值為4.4~6.8時,存放前后大腸菌群數(shù)量沒有明顯變化,數(shù)量級不變,由此可見,大腸菌群有較強的耐酸性;試樣的pH值=3時,存放前后大腸菌群含量由7.8×106CFU·g-1減少至1.3×104CFU·g-1,pH值的降低明顯影響了大腸菌群的生物活性;試樣的pH值<3時,存放后大腸菌群幾乎全部死亡,含量由7.5×106CFU·g-1減少至0,大腸菌群在酸性較高的環(huán)境下受到嚴重損傷而死亡。綜上,本次試驗結(jié)果表明,當大腸菌群含量較大時,不同的pH值對大腸菌群有不同程度的影響,pH值在4.4~6.8時對大腸菌群沒有明顯抑制性;pH值≤3時對大腸菌群有顯著抑制性。

      圖1 試樣S1~S5存放前后大腸菌群含量變化趨勢圖

      3 結(jié)論

      大腸菌群對酸有較強的耐受性,在pH值≤3的條件下受到顯著抑制。大腸菌群計數(shù)是評價食品衛(wèi)生污染狀況的重要指標,為了準確得到食品中大腸菌群的含量,檢測過程應(yīng)注意培養(yǎng)基以及樣品勻液的pH值,調(diào)節(jié)pH值至國家標準要求的范圍。另外,產(chǎn)品在存放過程中pH值的變化也會對大腸菌群的含量有影響,因此要注意檢測的及時性。

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