吳雙雙 孫鳳靈 秦 霞 文香月 張亞敏 徐小妹 盧雪花 李麗莎 林文津 徐榕青

福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院/福建省醫(yī)學(xué)測(cè)試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350001

澤瀉始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性寒味甘，有泄熱、利水滲濕、化濁降脂的功效，主要用于高脂血癥、小便不利、泄瀉尿少、水腫脹滿、痰飲眩暈等[1]。澤瀉為常見大宗中藥材，其中產(chǎn)于福建建甌、建陽(yáng)等地的澤瀉習(xí)稱“建澤瀉”。三萜類成分是澤瀉的主要成分，具有降血脂、降血糖、抗癌、抗菌等一系列藥理活性，是澤瀉發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)[2-5]。澤瀉中三萜類成分的常用測(cè)定方法有HPLC等[6-7]，同時(shí)檢測(cè)多種三萜類成分往往用時(shí)較長(zhǎng)，影響分析效率。UPLC-MS具有分析時(shí)間短、分析效率和分析靈敏度高的特點(diǎn)，尤其在同時(shí)測(cè)定中藥復(fù)雜組分方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。本文采用UPLC-MS聯(lián)用方法同時(shí)測(cè)定建澤瀉中澤瀉醇A等8種三萜類成分含量，旨在為建澤瀉品質(zhì)評(píng)價(jià)提供更準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便、可靠的分析手段。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料 建澤瀉植物樣本(采自福建建甌吉陽(yáng)鎮(zhèn))，液氮凍存，洗凈，60 ℃烘干后磨粉待用。采集樣本經(jīng)福建省建甌市吉陽(yáng)鎮(zhèn)農(nóng)技站呂竹清鑒定為澤瀉科植物澤瀉Alismaorientale(sam)juzep.的植株。

1.2 儀器 ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；Xevo TQS三重四級(jí)桿質(zhì)譜(美國(guó)Waters公司)；電子分析天平(AL204，METTLER TOLEDO(上海))；超聲波清洗器(KQ3200B，昆山市超聲儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG- 9070A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；高速多功能粉碎機(jī)(TYSP-100，永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司)；艾科浦超純水系統(tǒng)(ABZ1-0501-P，頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)。

1.3 試劑 23-乙酰澤瀉醇B(111846-201504)、甘草次酸(110723-201514)購(gòu)自中國(guó)食品藥品鑒定研究院；澤瀉醇A(19885-10-0)、澤瀉醇B(18649-93-9)、澤瀉醇F(155521-45-2)、澤瀉醇G(155521-46-3)、23-乙酰澤瀉醇C(26575-93-9)、24-乙酰澤瀉醇A(18674-16-3)、24-乙酰澤瀉醇F(443683-76-9)購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；乙腈(色譜純)購(gòu)自德國(guó) Merck 公司；水為超純水；甲酸為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用WatersCORTECSC18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)，流動(dòng)相0.1%甲酸水-乙腈，流速0.25 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μL。梯度洗脫方法為(以乙腈為標(biāo)準(zhǔn))：1～1.5 min，30%～55%；1.5～5.5 min，55%～75%；5.5～7.5 min，75%～90%；7.5～8.5 min，90%；8.5～8.6 min，90%～30%；8.5～10 min，30%。

2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧正離子模式；毛細(xì)管電壓3.50 kV；脫溶劑氣流：氮?dú)?00 L/h；脫溶劑溫度500 ℃；錐孔氣流：氮?dú)?50 L/h；離子源溫度：150 ℃；二級(jí)錐孔萃取電壓：3.00 V；碰撞氣體：氬氣。

2.3 溶液制備

2.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液制備 精密稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于25 mL容量瓶中，加入色譜純乙腈溶液定容，配置成濃度分別為：澤瀉醇A 490 mg/L、澤瀉醇B 520 mg/L、澤瀉醇F 500 mg/L、澤瀉醇G 500 mg/L、23-乙酰澤瀉醇B 490 mg/L、23-乙酰澤瀉醇C 520 mg/L、24-乙酰澤瀉醇A 510 mg/L、24-乙酰澤瀉醇F 530 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液制備 精密稱取甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品，置于25 mL容量瓶中混勻定容成510 mg/L內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。

2.3.3 樣品溶液制備 稱取建澤瀉樣品粉末約0.5 g置于50 mL錐形瓶中，精密加入乙腈25 mL并稱重，超聲30 min后冷卻至室溫，稱重并用乙腈補(bǔ)足失重。吸取上清并用0.22 μm的微孔濾膜過濾，將濾液稀釋20倍后與5.1 mg/L的甘草次酸內(nèi)標(biāo)溶液1∶1混合得樣品溶液。

2.4 質(zhì)譜測(cè)定方法 本實(shí)驗(yàn)采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)定量模式測(cè)定各成分含量，8個(gè)分析物及內(nèi)標(biāo)的具體質(zhì)譜分析條件見表1，在對(duì)應(yīng)參數(shù)下標(biāo)準(zhǔn)品及樣品中的8個(gè)待測(cè)成分的出峰情況如圖1所示。

表1 8種待測(cè)成分及內(nèi)標(biāo)的具體質(zhì)譜分析參數(shù)

注：圖中峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分與表1一致圖1 澤瀉醇A等8種成分的標(biāo)準(zhǔn)品(A)及樣品(B)MRM圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液各5 mL于50 mL容量瓶中，加入乙腈定容。分別吸取上述溶液2 μL、100 μL、200 μL、1 mL、2 mL 于10 mL容量瓶中，加乙腈定容，配成5種含內(nèi)標(biāo)系列對(duì)照品混合溶液，澤瀉醇A濃度分別為0.0098、0.49、0.98、4.90、9.80 mg/L，澤瀉醇B濃度分別為0.0104、0.52、1.04、5.20、10.40 mg/L,澤瀉醇F濃度分別為0.01、0.50、1.00、5.00、10.00 mg/L,澤瀉醇G濃度分別為0.01、0.50、1.00、5.00、10.00 mg/L,23-乙酰澤瀉醇B濃度分別為 0.0098、0.49、0.98、4.90、9.80 mg/L,23-乙酰澤瀉醇C濃度分別為0.0104、0.52、1.04、5.20、10.40 mg/L,24-乙酰澤瀉醇A濃度分別為0.0102、0.51、1.02、5.10、10.20 mg/L，24-乙酰澤瀉醇F濃度分別為0.0106、0.53、1.06、5.3、10.6 mg/L。按上述色譜條件、質(zhì)譜條件及測(cè)定方法對(duì)含內(nèi)標(biāo)系列對(duì)照品混合溶液進(jìn)行測(cè)定，并記錄峰面積。以待測(cè)成分峰面積與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)甘草次酸的峰面積比值(Y)對(duì)待測(cè)成分濃度(X)作線性回歸，結(jié)果如圖2所示，R2均大于0.99。

圖2 澤瀉醇A等8種化學(xué)成分線性關(guān)系圖

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一份對(duì)照品混合溶液2 μL，在上述色譜質(zhì)譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄澤瀉醇A、澤瀉醇B、澤瀉醇F、澤瀉醇G、23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、24-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇F與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值，RSD計(jì)算結(jié)果見表2，表明精密度良好。

2.6.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批澤瀉樣品6份，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄澤瀉醇A、澤瀉醇B、澤瀉醇F、澤瀉醇G、23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、24-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇F與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值并計(jì)算含量，RSD計(jì)算結(jié)果見表2，表明重復(fù)性良好。

表2 精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備1份澤瀉供試品溶液，分別于0、2、6、10、12和24 h進(jìn)樣分析，記錄澤瀉醇A、澤瀉醇B、澤瀉醇F、澤瀉醇G、23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、24-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇F與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值并計(jì)算含量，RSD計(jì)算結(jié)果見表2，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.4 加樣回收率 精密稱取已知含量的澤瀉樣品6份，每份0.25 g，置于50 mL錐形瓶中，分別精密加入接近等量8種對(duì)照品，精密加入乙腈25 mL并稱重，超聲30 min后冷卻至室溫，稱重并用乙腈補(bǔ)足失重，制備供試溶液。按前述方法測(cè)定含量并計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.7 樣品含量 測(cè)定按上述液相及質(zhì)譜條件對(duì)3批澤瀉塊莖樣品進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)回歸方程計(jì)算8種待測(cè)成分的含量，每批測(cè)定3次。結(jié)果見表4。

表4 建澤瀉塊莖中8種三萜類成分的含量

續(xù)表4 表4 建澤瀉塊莖中8種三萜類成分的含量

3 討論

三萜類成分是澤瀉的主要成分，具有降脂降糖等多種活性，現(xiàn)行版中國(guó)藥典以23-乙酰澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇C為含量測(cè)定指標(biāo)。澤瀉多種三萜類成分均為澤瀉發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，但不同產(chǎn)地、不同采收期、不同部位及不同炮制方法，澤瀉中三萜類成分有較大差異[7-10]。廣澤瀉中澤瀉醇A和24-乙酰澤瀉醇A的含量顯著高于建澤瀉和川澤瀉，川澤瀉中澤瀉醇B、澤瀉醇C等成分的含量顯著高于建澤瀉[11]。以澤瀉醇A24-乙酸酯峰為參照，HPLC指紋圖譜顯示不同產(chǎn)地澤瀉藥材的質(zhì)量有差異，所含成分的種類與量不完全一致[12]。不同育苗期、移栽期和采收期對(duì)川澤瀉三萜類成分均有顯著影響[13]。清炒、麩炒、鹽炙3種炮制方法對(duì)澤瀉中澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇B含量均有不同程度影響[14]。以個(gè)別的三萜成分為指標(biāo)評(píng)價(jià)澤瀉質(zhì)量具有較大的局限性，同時(shí)采用多個(gè)三萜類成分作為指標(biāo)控制澤瀉藥材質(zhì)量十分必要。

與HPLC相比，UPLC具有更高的柱效，并且在更寬的線速度范圍內(nèi)保持柱穩(wěn)定，有利于提高流動(dòng)相速度，縮短分析時(shí)間，提高分析通量。UPLC-MS聯(lián)用在同時(shí)測(cè)定中藥復(fù)雜多組分方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，并已得到日益廣泛的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定澤瀉中澤瀉醇A、澤瀉醇B、澤瀉醇F、澤瀉醇G、23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、24-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇F等8種三萜成分的UPLC-MS方法，簡(jiǎn)便快捷，靈敏度高，具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為澤瀉品質(zhì)評(píng)價(jià)及藥材質(zhì)量控制提供新的分析手段。