趙世偉，張麗波，茍學(xué)磊*，馬萬平，楊子彪

云南皇氏來思爾乳業(yè)有限公司（大理 671000）

乳酸菌是通過代謝碳源產(chǎn)生乳酸的一大類細菌，在世界范圍內(nèi)的各種食品及飼料發(fā)酵中發(fā)揮重要作用[1]。由于乳酸菌在抗生素相關(guān)性腹瀉[2]、艱難梭菌腹瀉[3]、腸易激綜合征及炎癥性腸病[4]等方面的治療作用及調(diào)節(jié)胃腸道菌群穩(wěn)態(tài)方面[5]的益生作用，乳酸菌及雙歧桿菌作為益生菌普遍應(yīng)用于添加劑及發(fā)酵食品中。因其特殊風味及色澤，具有活性益生菌的褐色乳酸菌飲料越來越受消費者青睞。褐色乳酸菌飲料主要以經(jīng)美拉德反應(yīng)后的牛奶及還原糖為基料，經(jīng)干酪乳桿菌/副干酪乳桿菌發(fā)酵調(diào)配而成[6]。但由于其工藝的特殊性，褐色乳酸菌飲料發(fā)酵周期較長，一般為72 h，有的甚至達90 h以上[6-9]，造成生產(chǎn)成本較高的同時也加大了發(fā)酵過程中的污染概率。因此，在保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的前提下，如何提高其發(fā)酵速率對于降低生產(chǎn)成本及發(fā)酵過程中的污染風險具有較大的現(xiàn)實意義。

褐色乳酸菌飲料生產(chǎn)過程中所使用的干酪乳桿菌/副干酪乳桿菌屬于異型乳酸發(fā)酵菌株，主要代謝產(chǎn)物為乳酸、乙醇及乙酸等[10]。目前乳制品發(fā)酵終點的主要判斷標準為滴定酸度，一般認為高細胞密度是影響乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸的重要因素[11]。因此，大量研究主要集中于培養(yǎng)基優(yōu)化以獲得較高細胞密度的發(fā)酵劑[12-13]。有研究指出生長培養(yǎng)基對于乳酸菌及其他種類菌株的細胞生長、有機酸生產(chǎn)速率及凍干后儲存過程中的存活率具有顯著的重要性[14-15]。除此之外，研究表明在葡萄糖代謝產(chǎn)乳酸過程中，磷酸果糖激酶、1, 6-二磷酸果糖醛縮酶、磷酸丙酮酸水合酶、丙酮酸激酶及乳酸脫氫酶等均需要金屬離子作為輔因子參與反應(yīng)[16]，因此，金屬離子是乳酸菌生長發(fā)酵過程中重要的生長因子之一。但由于乳制品企業(yè)大多使用商業(yè)直投式發(fā)酵劑生產(chǎn)相關(guān)產(chǎn)品，有關(guān)影響乳酸菌中間發(fā)酵劑活性因子的相關(guān)研究報道較少。因此，我們希望明確有利于干酪乳桿菌/副干酪乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)酸的生長因子，并以此解決以干酪乳桿菌/副干酪乳桿菌為生產(chǎn)菌種發(fā)酵生產(chǎn)褐色乳酸菌飲料發(fā)酵周期過長的問題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌株：副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）L9，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

MRS液體培養(yǎng)基：向1 000 mL水中加入20 g葡萄糖、10 g酪蛋白胨、10 g牛肉浸膏、5 g酵母浸粉、5 g無水乙酸鈉、2 g檸檬酸三銨、2 g磷酸氫二鉀、1 mL吐溫-80、0.25 g硫酸錳及0.58 g硫酸鎂，硫酸鎂及硫酸錳分開溶解后與其余成分混合，于121 ℃滅菌20 min，備用。MRS固體培養(yǎng)基：向MRS液體培養(yǎng)基中添加1.5%瓊脂粉后，于121 ℃滅菌20 min，備用。

中間發(fā)酵劑基料：將脫脂奶粉用水稀釋至蛋白含量3.0%后，于115 ℃滅菌15 min，備用。

褐色乳酸菌飲料基料：向1 000 mL蛋白含量為4.2%的脫脂奶粉溶液中添加62 g果葡糖漿（F42），在95℃條件下褐變2.5 h。

調(diào)配用糖水：向1 000 mL水中加入150 g蔗糖及24.5 g葡糖漿（F42），沸水浴煮沸后，保溫30 min，冷卻后置于4 ℃冰箱保存。備用。

試驗儀器：高壓滅菌鍋、生化培養(yǎng)箱、均質(zhì)機、pH計等。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

吸取50 μL甘油管保存的菌種至裝有10 mL MRS液體培養(yǎng)基的試管（18 mm×180 mm）中，于38 ℃培養(yǎng)18 h活化菌種，然后按2%（V/V）接種量將活化菌種轉(zhuǎn)接至裝有10 mL MRS液體培養(yǎng)基的試管（18 mm×180 mm）中，于38 ℃培養(yǎng)18 h后獲得種子培養(yǎng)基，備用。

1.2.2 褐色乳酸菌飲料基料發(fā)酵

以2%（V/V）接種量將副干酪乳桿菌L9種子培養(yǎng)基接種至裝有100 mL蛋白含量3.0%的脫脂奶培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，混合均勻，于38 ℃培養(yǎng)18 h后獲得中間發(fā)酵劑。以2%（V/V）接種量將中間發(fā)酵劑轉(zhuǎn)接至褐色乳酸菌飲料基料中，混合均勻，于38 ℃發(fā)酵。

1.2.3 不同生長因子對副干酪乳桿菌L9發(fā)酵產(chǎn)酸影響

以2%（V/V）接種量將活化后的副干酪乳桿菌L9種子培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接至添加不同濃度及種類的營養(yǎng)因子（2%葡萄糖、1%酪蛋白胨、0.5%酵母浸粉、0.2%檸檬酸三銨、0.2%磷酸氫二鉀、0.025%硫酸錳、0.058%硫酸鎂、0.5%無水乙酸鈉）的中間發(fā)酵劑基料中，于38 ℃發(fā)酵18 h后，以2%（V/V）轉(zhuǎn)種量將中間發(fā)酵劑轉(zhuǎn)接至褐色乳酸菌飲料基料中，于38 ℃發(fā)酵，分別測定發(fā)酵第0，第4，第8，第12，第16，第20，第24，第36，第48，第60，第72，第84，第96，第108和第120小時滴定酸度。

1.2.4 不同濃度硫酸錳對副干酪乳桿菌L9發(fā)酵產(chǎn)酸影響

以2%（V/V）接種量將副干酪乳桿菌L9種子培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接至添加不同濃度硫酸錳（0.05‰，0.10‰，0.15‰，0.20‰和0.25‰）的中間發(fā)酵劑基料中，于38 ℃發(fā)酵18 h后，以2%（V/V）轉(zhuǎn)種量將中間發(fā)酵劑轉(zhuǎn)接至褐色飲料發(fā)酵基料中，于38 ℃發(fā)酵，分別測定發(fā)酵第0，第4，第8，第12，第16，第20，第24，第36，第48，第60，第72，第84，第96，第108和第120小時滴定酸度。

1.2.5 不同濃度硫酸錳對副干酪乳桿菌L9發(fā)酵褐色飲料貨架期內(nèi)后酸、析水及活菌數(shù)影響

以2%（V/V）接種量將副干酪乳桿菌L9種子培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接至添加不同濃度硫酸錳（0.05‰，0.10‰，0.15‰，0.20‰和0.25‰）的中間發(fā)酵劑基料中，于38 ℃發(fā)酵18 h，以2%（V/V）轉(zhuǎn)種量將中間發(fā)酵劑轉(zhuǎn)接至褐色飲料發(fā)酵基料中，于38 ℃發(fā)酵至滴定酸度為220 °T結(jié)束發(fā)酵，搖勻破碎，于20 MPa均質(zhì)機均質(zhì)，用含15%蔗糖及6.5%果葡糖漿（F42）的糖水調(diào)配定容。定容后體積（mL）=4.2%/1.15%×褐色飲料發(fā)酵基料體積（mL）。式中，4.2%為褐色飲料發(fā)酵基料蛋白含量，1.15%為調(diào)配后褐色飲料產(chǎn)品蛋白含量。定容后，在20 MPa條件下進行二次均質(zhì)，并分裝至透明玻璃瓶中，在4 ℃條件下冷藏，測定并記錄第0，第5，第10，第15，第20，第25和第30天時產(chǎn)品滴定酸度、析水及活菌數(shù)變化情況。

1.2.6 滴定酸度、析水及活菌數(shù)測定方法

根據(jù)GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》檢測發(fā)酵產(chǎn)品酸度。析水情況測定方法：用直尺測定靜置不同天數(shù)產(chǎn)品中上清液高度。用傾注法測定產(chǎn)品中活菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長因子對副干酪乳桿菌L9發(fā)酵產(chǎn)酸影響

在前期試驗過程中，研究發(fā)現(xiàn)將經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后的副干酪乳桿菌L9直接轉(zhuǎn)接至褐色乳酸菌飲料基料中發(fā)酵，其產(chǎn)酸速率遠高于經(jīng)脫脂奶培養(yǎng)基培養(yǎng)的副干酪乳桿菌L9轉(zhuǎn)接至褐色乳酸菌飲料基料中發(fā)酵的產(chǎn)酸速率（圖1-a）。因此，首先考察了MRS液體培養(yǎng)基與脫脂奶中存在差異的營養(yǎng)因子對副干酪乳桿菌在褐色飲料基料中發(fā)酵產(chǎn)酸影響，結(jié)果如圖1（b）所示。結(jié)果表明，在中間發(fā)酵劑基料中添加葡萄糖、酪蛋白胨、酵母浸粉、檸檬酸三銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂及無水乙酸鈉時，副干酪乳桿菌L9在褐色飲料基料中發(fā)酵產(chǎn)酸速率無顯著差異，當在中間發(fā)酵劑基料中添加0.25‰硫酸錳時，副干酪乳桿菌L9在褐色飲料基料中發(fā)酵產(chǎn)酸速率較其他試驗組存在顯著性提高。具體來說，在中間發(fā)酵劑基料中添加0.25‰硫酸錳時，副干酪乳桿菌L9在褐色飲料基料中發(fā)酵第12小時滴定酸度即高于100 °T，發(fā)酵36 h時滴定酸度即達到200 °T以上，發(fā)酵120 h時滴定酸度為290~300°T。其余試驗組滴定酸度于發(fā)酵20 h時達到100 °T左右，于發(fā)酵72 h左右達到200 °T，發(fā)酵120 h時滴定酸度維持在230~240 °T。也就是說，在中間發(fā)酵劑基料中添加適量硫酸錳既可顯著提高副干酪乳桿菌L9在褐色飲料基料中產(chǎn)酸速度，又可提高副干酪乳桿菌L9在褐色飲料基料中極限酸度。

圖1 不同營養(yǎng)因子對副干酪乳桿菌L9產(chǎn)酸影響

2.2 不同濃度硫酸錳對副干酪乳桿菌L9發(fā)酵產(chǎn)酸影響

根據(jù)上述試驗結(jié)果可知添加適量硫酸錳可顯著提高副干酪乳桿菌L9在褐色乳酸菌飲料基料中的產(chǎn)酸速率。因此，考察了不同濃度硫酸錳對中間發(fā)酵劑中副干酪乳桿菌L9活菌數(shù)、滴定酸度及其在褐色乳酸菌飲料基料中發(fā)酵產(chǎn)酸速率的影響。結(jié)果表明，添加不同濃度硫酸錳對中間發(fā)酵劑活菌數(shù)無顯著性影響（圖2-a），活菌數(shù)均為2.4~2.9×109CFU/mL，中間發(fā)酵劑酸度差異不顯著，均在120 °T左右。由硫酸錳對L9在褐色乳酸菌飲料基料中產(chǎn)酸速率影響結(jié)果可以看出硫酸錳對中間發(fā)酵劑滴定酸度無顯著影響的原因在于中間發(fā)酵劑發(fā)酵時間為18 h，在此期間，硫酸錳濃度對副干酪乳桿菌L9產(chǎn)酸影響并不顯著。當中間發(fā)酵劑中硫酸錳添加質(zhì)量分數(shù)為0~0.20‰時，副干酪乳桿菌L9在褐色乳酸菌飲料基料中產(chǎn)酸速率隨硫酸錳濃度升高而逐漸升高，當硫酸錳添加質(zhì)量分數(shù)大于0.20‰時，副干酪乳桿菌L9在褐色飲料基料中產(chǎn)酸速率維持穩(wěn)定不變。另外，試驗結(jié)果也表明副干酪乳桿菌L9在褐色乳酸菌飲料基料中的極限酸度也與中間發(fā)酵劑基料中硫酸錳濃度相關(guān)。中間劑發(fā)酵基料中不含硫酸錳時，副干酪乳桿菌L9在褐色飲料基料中發(fā)酵極限酸度在220 °T左右，當中間發(fā)酵劑基料中硫酸錳添加質(zhì)量分數(shù)為0.05‰~0.20‰時，副干酪乳桿菌L9在褐色飲料基料中發(fā)酵極限酸度由250 °T左右升高至300 °T左右，當硫酸錳添加質(zhì)量分數(shù)大于0.20‰時，副干酪乳桿菌L9在褐色飲料基料中發(fā)酵極限酸度穩(wěn)定在300 °T左右。

圖2 不同濃度硫酸錳對副干酪乳桿菌L9在中間發(fā)酵劑中活菌數(shù)及發(fā)酵基料中產(chǎn)酸影響

2.3 不同濃度硫酸錳對褐色乳酸菌飲料貨架期內(nèi)后酸、析水及L.paracasei L9活菌數(shù)影響

由于不同濃度硫酸錳對副干酪乳桿菌L9發(fā)酵褐色乳酸菌飲料基料產(chǎn)酸具有較大影響，且隨硫酸錳濃度變化其極限酸度也有較大差異，而貨架期內(nèi)產(chǎn)品穩(wěn)定性及活菌數(shù)等與終產(chǎn)品酸度有較大的相關(guān)性[17]。因此，考察了不同濃度硫酸錳對副干酪乳桿菌L9發(fā)酵褐色乳酸菌飲料產(chǎn)品在4 ℃條件下保存30 d酸度、析水及活菌數(shù)的影響情況，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，褐色乳酸菌飲料產(chǎn)品在保存期內(nèi)后酸變化及析水情況與中間發(fā)酵劑中硫酸錳濃度顯著相關(guān)。向中間發(fā)酵劑中添加0，0.05‰，0.10‰，0.15‰，0.20‰和0.25‰硫酸錳后，產(chǎn)品在4 ℃條件下保存30 d后酸度分別上升了8.0，6.0，10.0，14.0，16.5和16.0 °T，析水層分別為6，5，6，7，7和9 mm，也就是說隨中間發(fā)酵劑中所添加硫酸錳濃度升高，褐色乳酸菌飲料產(chǎn)品穩(wěn)定性呈逐漸下降的趨勢。此外，還考察了在貨架期內(nèi)各產(chǎn)品中副干酪乳桿菌活菌數(shù)變化情況，結(jié)果表明褐色飲料產(chǎn)品中副干酪乳桿菌活菌數(shù)與中間發(fā)酵劑中所添加硫酸錳濃度無顯著相關(guān)性，活菌數(shù)均由初始產(chǎn)品中109CFU/mL下降至107CFU/mL左右。

圖3 不同濃度硫酸錳對褐色乳酸菌飲料穩(wěn)定性及活菌數(shù)影響

綜合來看，在中間發(fā)酵劑中添加0.05‰~0.10‰硫酸錳，既可有效提高副干酪乳桿菌L9在褐色乳酸菌基料中發(fā)酵產(chǎn)酸速度，顯著降低發(fā)酵時間，又能保證所獲得產(chǎn)品在貨架期內(nèi)的穩(wěn)定性。

3 討論與結(jié)論

相較于復(fù)雜的合成培養(yǎng)基，經(jīng)濟實惠的天然培養(yǎng)基在發(fā)酵工業(yè)中具有更廣泛的應(yīng)用。然而，天然培養(yǎng)基缺乏一些對發(fā)酵過程具有重要影響的關(guān)鍵營養(yǎng)因子。試驗發(fā)現(xiàn)，在褐色乳酸菌飲料基料中轉(zhuǎn)接含有Mn2+的MRS中間發(fā)酵劑的產(chǎn)酸速率顯著高于添加不含Mn2+的脫脂奶中間發(fā)酵劑的產(chǎn)酸速率。一般來說，發(fā)酵活力是中間劑最重要的指標，但活性缺失在乳酸菌中間劑生產(chǎn)過程中往往很微妙而難以發(fā)現(xiàn)。因此，對于發(fā)酵活性有較大的影響的因素仍然是發(fā)酵領(lǐng)域需要繼續(xù)深入研究的部分。

Mn2+是包括乳酸菌在內(nèi)多種生物重要的生長因子，其主要作用為影響蛋白質(zhì)合成，并在細胞生長、產(chǎn)酸及代謝等方面扮演重要角色[18]。眾所周知，大多數(shù)乳酸菌對氧氣敏感[19]，Mn2+對保護乳酸菌細胞耐受活性氧細胞毒性的關(guān)鍵酶-超氧化物歧化酶活性具有關(guān)鍵性作用[20-21]。盡管很多研究指出生長培養(yǎng)基在細胞生長、有機酸合成速率及凍干乳酸菌儲存期內(nèi)存活率等方面具有重要作用，但很少有研究報道在培養(yǎng)基中添加Mn2+可以增強乳酸菌中間劑發(fā)酵活性。

通過試驗結(jié)果表明Mn2+是影響乳酸菌中間發(fā)酵劑活性的關(guān)鍵微量元素。其調(diào)節(jié)機制可能是：在乳酸菌代謝途徑中，乳酸合成與TCA循環(huán)間存在競爭抑制作用，由于PDH活性顯著降低使丙酮酸進入TCA途徑的代謝流變?nèi)?，但Mn2+并未使磷酸果糖激酶及丙酮酸激酶活性發(fā)生顯著性變化。因此，Mn2+在乳酸菌代謝過程中可能扮演“代謝開關(guān)”的角色——增強丙酮酸代謝生成乳酸途徑而抑制其他代謝途徑[22]。

另外，作為人體必需微量元素，錳元素在能量代謝、抗氧化防護、傷口愈合及維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)方面具有重要作用[23]。錳元素攝入不足可導(dǎo)致發(fā)育不良、骨骼發(fā)育不良和骨骼缺陷、血糖耐受異常、脂質(zhì)和碳水化合物代謝改變等疾病[24]。根據(jù)2013版《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》[25]顯示，0~6月齡嬰兒錳適宜攝入量為0.01 mg/d，7~12月齡嬰兒錳適宜攝入量為0.7 mg/d，1~18歲未成年人錳適宜攝入量為1.5~4.5 mg/d，可耐受最高攝入量為3.5~10 mg/d，成年人錳適宜攝入量為4.5 mg/d，可耐受最高攝入量為11.0 mg/d。錳元素在谷物、蔬菜、堅果及水果中均有較豐富的含量，例如堅果中錳元素含量高達46 mg/kg，茶中錳元素高達0.4~1.3 mg/杯[26]。但人體從飲食中吸收錳元素的比例較小，一般日常飲食中錳元素含量為3~4 mg/d，人體吸收比例只有3%左右[27]?？偟膩碚f，根據(jù)上述資料可以判定在中間劑中添加微量錳元素是在安全范圍內(nèi)，但由于尚未有相關(guān)法規(guī)支持，目前對于其在食品中的應(yīng)用還需進一步研究。但作為某些代謝途徑的“代謝開關(guān)”，Mn2+在乳酸菌發(fā)酵活性相關(guān)的研究技術(shù)中仍是不可忽略的重要因素之一。