朱捷，方佩琪，潘柏申,2，王蓓麗,2，郭瑋,2(.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建廈門 3605)

血小板是人體血液重要的組分，骨髓中的巨核細(xì)胞生成血小板后會釋放入外周血液中，在循環(huán)中存活5～7 d[1]。一旦機(jī)體發(fā)生損傷或者血管破損，血小板會發(fā)生激活，黏附聚集在血管內(nèi)皮破損處暴露出來的細(xì)胞外基質(zhì)上，形成血栓物質(zhì)，阻止機(jī)體出血并修復(fù)損傷[2-3]。臨床上最為常見且危害嚴(yán)重的是免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)，成人發(fā)病率已經(jīng)上升至每10萬9.5人[4]。該病發(fā)病原因以及相關(guān)機(jī)制仍不明確，相關(guān)研究主要依賴于體外巨核細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)以及ITP小鼠模型[5-7]。在體外實(shí)驗(yàn)中,常使用小鼠幼肝、人骨髓和臍帶血分選純化CD34原始細(xì)胞,進(jìn)一步將其誘導(dǎo)分化為巨核細(xì)胞后進(jìn)行功能學(xué)研究[8-9]。在評估巨核細(xì)胞分化能力時(shí)，其所產(chǎn)生的血小板數(shù)量是一項(xiàng)重要的考察指標(biāo)，但是培養(yǎng)體系中巨核細(xì)胞產(chǎn)生的血小板數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常規(guī)血液細(xì)胞分析儀的檢測下限，而人工計(jì)數(shù)法耗時(shí)長，重復(fù)性差。流式細(xì)胞術(shù)是一種對溶液中單個(gè)細(xì)胞或者顆粒物質(zhì)進(jìn)行多參數(shù)分析的技術(shù)[10]，本研究擬用流式細(xì)胞術(shù)檢測低值血小板并進(jìn)行性能評價(jià)。

1 對象與方法

1.1標(biāo)本收集 選擇2020年10月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院體檢的表觀健康人，入組50人，用于血小板分離和后續(xù)實(shí)驗(yàn)方法評估。入組條件：①無心血管疾病及腫瘤病史；②無血液病；③血小板數(shù)量處于參考區(qū)間內(nèi)；④樣本無脂血、黃疸、溶血。

1.2主要儀器與試劑 XN-2800血液分析儀(日本Sysmex公司)，CantoⅡ流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，Thermo Scientific SL8臺式離心機(jī)(美國Thermo公司)。

前列環(huán)素I2(prostaglandin I2，PGI2)(美國MCE公司)，無鈣臺式液(雷根生物技術(shù)公司)，絕對計(jì)數(shù)管(每管小球數(shù)量：46 900)及人抗體CD61(美國 BD公司)，鼠抗體CD61(美國Biolegend公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國 Gibco公司)，人重組SCF蛋白、人重組IL-3蛋白、人重組IL-6蛋白、人重組促血小板生成素(TPO)蛋白、人重組FLT-3蛋白(美國R&D公司)，BLAB/c小鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物公司)。

1.3血小板前處理 在2 mL EDTA-K2抗凝血中添加PGI2(終濃度為50 ng/L)，防止血小板激活發(fā)生聚集[11]。200 r/min離心10 min，吸取上層富血小板血漿，再次加入PGI2，3 000 r/min離心10 min，去除上層血漿。加入5 mL無鈣臺式液，重懸后3 000 r/min離心10 min，重復(fù)3次，每次離心前均添加PGI2以防止血小板聚集。最后將血小板重懸于1 mL無鈣臺式液中。用XN-2800血液分析儀檢測血小板濃度5次并取平均值，作為基線值。

使用無鈣臺式液對血小板懸液進(jìn)行梯度稀釋，將1011/L血小板10倍稀釋至10/L，備用。

1.4血小板計(jì)數(shù) 流式檢測：在絕對計(jì)數(shù)管中加入50 μL血小板懸液，再加入5 μL CD61-PerCP抗體，充分混勻后暗室靜置溫育30 min。加入250 μL無鈣臺式液重懸，用CantoⅡ流式細(xì)胞儀檢測。依照公式：血小板濃度=(檢測獲取的血小板數(shù)量/檢測獲取的微球數(shù)量)×[微球總數(shù)(固定值)/樣品體積]，換算得到血小板濃度。每份樣品平行檢測10次。具體設(shè)門方式見圖1，在FITC通道圈門選取微球，在PerCP通道圈門選取血小板。門內(nèi)設(shè)定收集至少50個(gè)血小板，圖1列出不同血小板濃度下門內(nèi)血小板收集情況。

手工樣品檢測：取10 μL血小板懸液進(jìn)行牛鮑氏計(jì)數(shù)板充池，室溫靜置10～15 min，由2名資深檢驗(yàn)科工作人員用雙盲法進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，在高倍鏡下依次計(jì)數(shù)中央大方格內(nèi)的四角以及正中共5個(gè)大方格內(nèi)的血小板數(shù)量，每份樣品平行計(jì)數(shù)5次，取均值。

圖1 流式方法檢測血小板設(shè)門方式

1.5巨核細(xì)胞分化培養(yǎng) 用13.5 d的BLAB/c小鼠幼肝干細(xì)胞誘導(dǎo)巨核細(xì)胞的分化培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[12]。將細(xì)胞分為6組，每組培養(yǎng)體系內(nèi)均添加小鼠幼肝干細(xì)胞106個(gè)，在每組培養(yǎng)體系中分別添加不同濃度的TPO,濃度分別為100、80、60、40、20 ng/mL，添加PBS作為空白對照。培養(yǎng)14 d后分別觀察體系中巨核細(xì)胞生成數(shù)量及血小板數(shù)量。

1.6精密度和正確度驗(yàn)證 對稀釋后不同濃度的血小板懸液測定10次。計(jì)算變異系數(shù)(CV)及偏倚。判斷標(biāo)準(zhǔn):(1)CV和偏倚應(yīng)小于15%；(2)如果CV≥15%或者偏倚≥15%，優(yōu)先考慮人為操作誤差，則對該濃度下的血小板重新檢測10次，并將所得數(shù)據(jù)與之前數(shù)據(jù)合并計(jì)算，以增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠程度。如果CV<15%，偏倚<15%，則表明該濃度下的血小板檢測精密度以及正確度通過驗(yàn)證；如果CV≥15%或者偏倚≥15%，則表明該濃度下的血小板檢測精密度或者正確度無法通過驗(yàn)證，達(dá)不到后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

2 結(jié)果

2.1精密度驗(yàn)證 將制備好的血小板懸液進(jìn)行梯度稀釋，分別用人工鏡檢和流式檢測的方式對不同濃度的血小板進(jìn)行檢測，結(jié)果見表1。隨著血小板濃度的降低，人工鏡檢法和流式檢測法的精密度均逐漸下降。當(dāng)血小板濃度在108/L及以上時(shí)，人工鏡檢法和流式檢測法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但當(dāng)血小板濃度進(jìn)一步下降后，人工鏡檢法和流式檢測法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且相同濃度下流式檢測法的CV值小于手工鏡檢法。表明用流式法檢測低值血小板時(shí)的精密度優(yōu)于手工鏡檢法。當(dāng)血小板濃度為5.60×105/L時(shí)，2名檢測人員的鏡下檢測結(jié)果差異巨大，所得結(jié)果不在同一個(gè)次方水平，故而判定無法檢測出血小板結(jié)果。而用流式法檢測血小板，當(dāng)濃度為5.60×104/L時(shí)，流式圈門的門內(nèi)所得血小板數(shù)量不足50個(gè)，也判定結(jié)果無法測出。

表1 手工鏡檢法和流式檢測法精密度比對

2.2正確度驗(yàn)證 以手工稀釋的血小板理論濃度值為標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算手工鏡檢法和流式檢測法相對于標(biāo)準(zhǔn)值的偏倚，結(jié)果見表2。隨著血小板濃度的下降，2種檢測方法的偏倚程度也逐漸加大，但流式檢測法的偏倚小于手工鏡檢法。其中，血小板濃度為5.60×106/L時(shí)，流式檢測法偏倚值也小于15%。表明流式檢測法在檢測低值血小板時(shí)其正確度可靠。

表2 手工鏡檢法和流式檢測法正確度比對

2.3流式方法檢測體外巨核細(xì)胞生成的血小板計(jì)數(shù) 用流式法檢測不同組別中小鼠幼肝干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨核細(xì)胞所生成的血小板數(shù)量，其檢測方法與檢測人源性血小板方法相同，同時(shí)在鏡下計(jì)數(shù)巨核細(xì)胞的數(shù)量(放大倍數(shù)為200)，結(jié)果見圖2。實(shí)驗(yàn)體系內(nèi)血小板濃度大致在106/L以上時(shí)，用流式方法檢測血小板可以有效計(jì)算出培養(yǎng)體系中血小板的濃度。加入100 ng/mL TPO的培養(yǎng)體系中所生成的血小板數(shù)量最高，隨著TPO濃度下降，血小板數(shù)量也隨之下降。血小板濃度與其體系中巨核細(xì)胞數(shù)量存在顯著正相關(guān)(r2=0.879 9，P<0.001，回歸方程為Y=0.993 8X-3.221)。見圖3。

注：黑色箭頭為巨核細(xì)胞。

注：A、B、C分別為不同濃度TPO培養(yǎng)體系中血小板數(shù)量、不同濃度TPO培養(yǎng)體系中巨核細(xì)胞數(shù)量以及二者的相關(guān)性結(jié)果。

3 討論

本研究探索了流式細(xì)胞術(shù)在低值血小板檢測方法學(xué)上的可行性。通過檢測不同濃度血小板來判定該檢測方法的精密度和正確度，我們發(fā)現(xiàn)手工法檢測低值血小板的偏倚和CV較大。但是使用流式檢測方法時(shí)，可以通過長時(shí)間收集樣本來獲得足夠的血小板，進(jìn)而通過絕對計(jì)數(shù)管中的微量小球計(jì)算獲得血小板濃度。只是當(dāng)血小板濃度在104/L時(shí)或者更小時(shí)，門內(nèi)無法獲得足夠的血小板，且非特異性熒光干擾較大，故而無法檢測。

用流式細(xì)胞術(shù)定量檢測血小板數(shù)量已有報(bào)道。王建中等[11]用3種流式檢測方式測定血小板濃度，用絕對計(jì)數(shù)管檢測血小板效果最優(yōu)，但是易受紅細(xì)胞碎片干擾。黎慶梅等[12]通過實(shí)驗(yàn)表明，用流式方法檢測109/L～1011/L血小板，其檢測能力優(yōu)于電阻抗法。本研究用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的血小板，同時(shí)探索了該檢測方法在檢測極低血小板濃度時(shí)的正確度和精密度，尚無相關(guān)研究報(bào)道，具有一定的創(chuàng)新性。

本研究通過對幼鼠幼肝內(nèi)干細(xì)胞進(jìn)行刺激，誘導(dǎo)其分化為巨核細(xì)胞，用流式檢測法檢測添加不同濃度TPO培養(yǎng)體系上清液中的血小板數(shù)量，發(fā)現(xiàn)其與培養(yǎng)體系內(nèi)的巨核細(xì)胞數(shù)量呈正比。該實(shí)驗(yàn)從側(cè)面表明，本研究基于流式平臺檢測低值血小板的方法可行，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)工作的開展。