周 軻，牛 淳，劉文娟，姚萬(wàn)玲，紀(jì) 鵬，華永麗，魏彥明

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

脾虛泄瀉是指因脾陽(yáng)氣虛而致運(yùn)化失常、作瀉，多表現(xiàn)為腹瀉、久瀉不愈、時(shí)瀉時(shí)止或完谷不化、食欲不振、消瘦或乏力等[1]。獸醫(yī)臨床上，脾虛泄瀉多因飼養(yǎng)寒涼食物、饑飽失常、過度使役、環(huán)境性應(yīng)激等造成，為獸醫(yī)臨床常見病證之一，通常會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物食欲低下，消化不良，使動(dòng)物體重下降，抵抗力降低繼發(fā)其他疾病，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡，對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。

動(dòng)物百會(huì)穴的定穴與人不同。人的百會(huì)穴定于后發(fā)際正中上7寸，兩耳尖直上頭頂正中[2]，而動(dòng)物的百會(huì)穴定于腰薦十字處，即最后腰椎與第一薦椎棘突間的凹陷中，但都處于督脈循行路線上。動(dòng)物百會(huì)穴主要用于治療腰胯疾病[3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，白針或水針百會(huì)穴對(duì)腰胯損傷、后肢麻痹及馬的破傷風(fēng)有一定的治療效果[4-6]。但有關(guān)針刺百會(huì)穴治療家畜脾胃泄瀉等疾病的研究鮮有報(bào)道，僅王魯?shù)萚7]電針百會(huì)穴來(lái)進(jìn)行抗腹瀉試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)電針百會(huì)穴對(duì)治療仔豬腹瀉具有良好療效。脾虛泄瀉多與消化道中下部有密切聯(lián)系，而消化道中下部與百會(huì)穴解剖位置較接近，利用近治取穴的原則[3]，可選取該穴治療脾虛泄瀉。其次督脈可督一身之陽(yáng)氣，脾虛泄瀉時(shí)中陽(yáng)不健、運(yùn)化無(wú)權(quán)，針灸督脈之穴，可扶正機(jī)體陽(yáng)氣。因此百會(huì)穴可作為治療脾虛泄瀉的重要穴位。

本研究用灌胃番瀉葉的方法建立脾虛泄瀉動(dòng)物模型，以電針百會(huì)穴的方法進(jìn)行治療，通過觀察臨床癥狀，測(cè)定脾、胰的器官指數(shù)及檢測(cè)胃腸吸收能力和炎癥因子變化情況來(lái)評(píng)價(jià)電針百會(huì)穴對(duì)脾虛泄瀉的治療作用，為獸醫(yī)臨床治療脾虛泄瀉提供一種方便快捷的針灸治療方法，也為進(jìn)一步研究百會(huì)穴的功效以及發(fā)揮功效的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)藥品 番瀉葉購(gòu)自蘭州惠仁堂藥業(yè)銀灘雅苑店，處理方法：將1 kg番瀉葉加入到5 L沸水中，浸泡30 min，紗布過濾得到浸泡液，將浸泡液用蒸餾水定容至5 L，得到質(zhì)量濃度為0.2 g·mL-1的番瀉葉浸液。浸液置于4 ℃冰箱備用。天然蒙脫石散(生產(chǎn)批號(hào)：F25551)購(gòu)自博福-益普生(天津)制藥有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 D-木糖試劑盒(貨號(hào)：A035)購(gòu)自南京建成生物工程研究所，D-木糖(貨號(hào)：SX8030)購(gòu)自索萊寶科技有限公司，大鼠淀粉酶ELISA試劑盒(貨號(hào)：ml059302)、大鼠IL-12 ELISA試劑盒(貨號(hào)：ml622111)均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，大鼠IL-2 ELISA試劑盒(貨號(hào)：ERC001.96)、大鼠腫瘤壞死因子-α ELISA試劑盒(貨號(hào)：ERC102a.96)均購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 YP502 N電子天平(上海天美天平儀器有限公司)，BSA224S-CW分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，KWD-808I脈沖電療儀(常州市武進(jìn)長(zhǎng)城醫(yī)療器械有限公司)，Spectra Max Plus384酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司)，752 N紫外分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組 64只Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，合格證號(hào)SCXK(甘)2021-0001，室溫自然光照環(huán)境，標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后分成假手術(shù)組(sham operated group，Sham)，百會(huì)組(electric acupuncture Baihui group, Baihui)，模型組(model group，Model)和陽(yáng)性對(duì)照組(positive control group，PC)。

1.2.2 動(dòng)物模型建立及治療 造模方法在徐海珍等[8]、周鴻雲(yún)等[9]、彪雅寧等[10]基礎(chǔ)上加以改良調(diào)整。模型組、百會(huì)組、陽(yáng)性對(duì)照組分別在中午12：00和晚上24：00各灌胃1次番瀉葉浸液(0.2 g·mL-1)，按體質(zhì)量以10 μL·g-1計(jì)算用量；假手術(shù)組灌胃相應(yīng)體積(按體質(zhì)量以10 μL·g-1計(jì))生理鹽水。第5天，造模各組大鼠普遍出現(xiàn)腹瀉、糞便稀溏、精神萎靡等癥狀，提示造模成功。造模成功后，仍按照上述方法持續(xù)灌胃番瀉葉浸液至第18天。百會(huì)組從第5天開始，每天早上9：00—11：00，將其固定在大鼠固定架上，并電針百會(huì)穴(刺入深度為3～5 mm，針尖5 mm處纏繞透明膠帶，保證入刺深度趨于一致)連續(xù)波刺激，基礎(chǔ)電強(qiáng)度為2級(jí)，其余調(diào)為4級(jí)左右，以大鼠微微顫抖為標(biāo)準(zhǔn)，針刺激15 min。陽(yáng)性對(duì)照組灌胃蒙脫石散懸濁液(濃度為40 mg·mL-1，用量20 μL·g-1)。假手術(shù)組和模型組每天在大鼠固定架上固定15 min直至第19天。

1.2.3 樣本采集 第18天給藥結(jié)束后，所有大鼠禁食不禁水12 h，第19天解剖前1 h灌胃5% D-木糖2 mL。水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈采血，置于室溫制備血清，-80 ℃保存?zhèn)溆茫徊裳滤篮笃嗜∑?、胰腺?/p>

1.2.4 一般行為學(xué)觀察 試驗(yàn)中每天觀察大鼠的一般狀態(tài)，如精神狀態(tài)、活動(dòng)狀態(tài)、生長(zhǎng)體態(tài)、被毛、飲食欲、肛周、糞便等，并加以記錄。

1.2.5 腹瀉指數(shù) 記錄奇數(shù)天每只大鼠出籠1 min內(nèi)的排便次數(shù)及稀便等級(jí)。計(jì)算方法根據(jù)國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)，腹瀉指數(shù)=稀便率×稀便等級(jí)。稀便率按照稀便次數(shù)/排便次數(shù)來(lái)計(jì)算。稀便等級(jí)按照稀便最小直徑分為4級(jí)，小于1 cm為1級(jí)，1～2 cm為2級(jí)，2～3 cm為3級(jí)，稀便最小直徑大于3 cm的為4級(jí)。

1.2.6 體質(zhì)量測(cè)定 奇數(shù)天對(duì)大鼠進(jìn)行稱重，稱重需在拉尾排便試驗(yàn)結(jié)束后，去除排便減重的干擾，對(duì)大鼠進(jìn)行3次體質(zhì)量的測(cè)量，取平均值。

1.2.7 臟器指數(shù)的測(cè)定 摘取脾、胰腺，剔除多余結(jié)締組織，用分析天平測(cè)定其質(zhì)量。計(jì)算脾及胰腺的器官指數(shù)。計(jì)算公式：臟器指數(shù)=器官質(zhì)量/動(dòng)物體質(zhì)量×100%。

1.2.8 血清AMS和D-木糖的檢測(cè) 取出-80 ℃下保存的血清，室溫下解凍，嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明，進(jìn)行AMS和D-木糖檢測(cè)。

1.2.9 血清炎性因子的測(cè)定 取出-80 ℃下保存的血清，室溫下解凍，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明，進(jìn)行血清IL-2、IL-12及TNF-α的測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1 一般行為學(xué)變化

造模前，所有大鼠精神狀態(tài)良好、活潑好動(dòng)，被毛光滑潔白，食欲良好，糞便成型，肛周潔凈。試驗(yàn)第13天(治療一周后)，模型組大鼠體型消瘦，神情呆滯，被毛雜亂，不愿走動(dòng)，排水樣稀便，稀便常黏附于肛周及尾巴，百會(huì)組一般行為學(xué)表現(xiàn)有所好轉(zhuǎn)，肛周污穢減少，糞便濕潤(rùn)。陽(yáng)性對(duì)照組糞便稀軟(圖1)。而百會(huì)組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠狀態(tài)逐漸恢復(fù)，通過2周的治療，百會(huì)組和陽(yáng)性對(duì)照組一般行為學(xué)與假手術(shù)組趨于一致。

圖1 第13天各組大鼠的腹瀉情況

2.2 電針百會(huì)穴對(duì)脾虛泄瀉動(dòng)物體質(zhì)量的影響

與假手術(shù)組相比，從第3天開始，模型組雄性大鼠體質(zhì)量變化率在奇數(shù)天均顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)；雌性大鼠在第9、13天模型組的體質(zhì)量變化率顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，從第11 天開始，百會(huì)組雄性大鼠體質(zhì)量變化率奇數(shù)天均顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)；雌性大鼠變化不顯著(P>0.05)。從電針百會(huì)穴第1天起，百會(huì)組和陽(yáng)性對(duì)照相比雌雄大鼠體質(zhì)量變化率均差異不顯著(P>0.05)(圖2)。

A.雄性大鼠體質(zhì)量變化率；B.雌性大鼠體質(zhì)量變化率；模型組與假手術(shù)組相比，*.P<0.05，**.P<0.01；百會(huì)組與模型組相比，#.P<0.05，##.P<0.01

2.3 電針百會(huì)對(duì)脾虛泄瀉動(dòng)物稀便及腹瀉指數(shù)的影響

從第5天起，模型組、百會(huì)組和陽(yáng)性對(duì)照組均出現(xiàn)了持續(xù)性腹瀉癥。與假手術(shù)組相比，其他三組的腹瀉指數(shù)顯著升高(P<0.05)(圖3A)。第13天時(shí)，電針和藥物治療1周后，與模型組相比，百會(huì)組腹瀉指數(shù)極顯著降低(P<0.01)，而陽(yáng)性對(duì)照組和模型組差異不顯著(P>0.05)(圖3B)。第19天時(shí)，相較于模型組，百會(huì)組和陽(yáng)性對(duì)照組腹瀉指數(shù)均極顯著降低(P<0.01)(圖3C)。

2.4 電針百會(huì)穴對(duì)脾虛泄瀉動(dòng)物胰腺和脾指數(shù)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組的脾指數(shù)極顯著升高(P<0.01)，胰腺指數(shù)顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，百會(huì)組和陽(yáng)性對(duì)照組的脾臟指數(shù)極顯著降低(P<0.01)，胰腺指數(shù)顯著升高(P<0.05)(表1)。

表1 各組雌性大鼠的脾、胰腺指數(shù)

2.5 電針百會(huì)穴對(duì)脾虛泄瀉大鼠消化吸收功能的影響

與假手術(shù)組相比，模型組血清D-木糖含量極顯著降低(P<0.01)，陽(yáng)性對(duì)照組的D-木糖含量顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組血清中D-木糖含量顯著升高(P<0.05)，百會(huì)組血清中D-木糖含量極顯著升高(P<0.01)。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，百會(huì)組血清中D-木糖的水平顯著上升(P<0.05)(圖4A)。與假手術(shù)組相比，模型組淀粉酶含量顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，百會(huì)組和陽(yáng)性對(duì)照組淀粉酶含量均顯著上升(P<0.05)(圖4B)。

A.D-木糖；B.淀粉酶。與假手術(shù)組相比，*.P<0.05，**.P<0.01；與模型組相比，#.P<0.05，##.P<0.01；百會(huì)組與陽(yáng)性對(duì)照組相比，+.P<0.05

2.6 電針百會(huì)對(duì)脾虛泄瀉動(dòng)物血清炎性因子的影響

與假手術(shù)組相比，模型組IL-2含量極顯著升高(P<0.01)，與模型組相比，百會(huì)組和陽(yáng)性對(duì)照組的IL-2含量均極顯著降低(P<0.01)(圖5A)。與假手術(shù)組相比，模型組IL-12含量顯著升高(P<0.05)，與模型組相比，百會(huì)組IL-12含量顯著降低(P<0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組IL-12含量極顯著降低(P<0.01)(圖5B)。與假手術(shù)組相比，模型組TNF-α含量極顯著升高(P<0.01)，與模型組相比，百會(huì)組和陽(yáng)性對(duì)照組TNF-α含量均顯著降低(P<0.05)(圖5C)。百會(huì)組和陽(yáng)性對(duì)照組的血清IL-2、IL-12和TNF-α均差異不顯著(P>0.05)(圖5)。

A.IL-2；B.IL-12；C.TNF-α。與假手術(shù)組相比，*.P<0.05，**.P<0.01；與模型組相比，#.P<0.05，##.P<0.01

3 討 論

百會(huì)穴在獸醫(yī)上常用來(lái)治療腰胯損傷，后肢麻痹等；人醫(yī)臨床中，此解剖部位穴位多用于治療婦科疾病，如月經(jīng)不調(diào)、疼痛等病癥。關(guān)于針刺此穴治療泄瀉報(bào)道較少。中獸醫(yī)臨床上對(duì)脾虛泄瀉常用參苓白術(shù)散或其衍生方來(lái)治療，針灸治療通常選取后三里、脾俞為主穴，以及脾、胃經(jīng)絡(luò)的穴位為配穴[11]。作者前期預(yù)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，電針后三里、脾俞、百會(huì)穴對(duì)脾虛泄瀉治療效果確切。而百會(huì)穴相較于其他穴位定穴簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、不易溜針，更適合應(yīng)用于臨床治療。作者通過電針百會(huì)穴的確切療效可對(duì)臨床治療脾虛泄瀉的針灸療法，提供一定的選穴依據(jù)。

本研究中，脾虛泄瀉大鼠表現(xiàn)出食欲降低，腹痛，觸摸后閃躲，精神萎靡，四肢無(wú)力，尤以腹瀉次數(shù)增加，排水樣稀便，肛周黏附糞便污漬，被毛雜亂無(wú)光澤等癥狀為主。百會(huì)組電針百會(huì)穴治療1周后大鼠食欲明顯改善，精神狀態(tài)稍有好轉(zhuǎn)，活動(dòng)范圍增大且腹瀉次數(shù)明顯降低。治療2周后，狀態(tài)與假手術(shù)組接近。從癥狀體征上來(lái)看，成功建立了大鼠脾虛泄瀉模型，且電針百會(huì)穴可以緩解脾虛動(dòng)物的臨床癥狀。脾虛泄瀉對(duì)大鼠體質(zhì)量也具有重要的影響。徐俊[12]曾把體質(zhì)量下降定義為脾虛泄瀉模型建立成功的標(biāo)志，脾虛泄瀉動(dòng)物體質(zhì)量下降是因?yàn)榇笫笫秤陆?，采食量降低；另外腹瀉造成腸胃蠕動(dòng)加快，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收不良，致體質(zhì)量降低。但本試驗(yàn)結(jié)果表明，脾虛模型組雄性大鼠全程和第9與13天的雌性大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率下降，與該報(bào)道結(jié)果不完全一致。雌性大鼠體質(zhì)量沒有全程增長(zhǎng)率下降，這可能是由于不在雌鼠生長(zhǎng)發(fā)育最明顯階段或雌鼠天然抵抗力較強(qiáng)或其他因素導(dǎo)致。因此，脾虛泄瀉的判定僅靠體質(zhì)量下降不夠全面，應(yīng)考慮性別原因，并結(jié)合其他癥狀體征綜合判斷。

腹瀉指數(shù)因其能很好地描述動(dòng)物個(gè)體腹瀉情況，常用作評(píng)價(jià)腹瀉程度的國(guó)際指標(biāo)[13]。本試驗(yàn)前期動(dòng)物出現(xiàn)了大范圍腹瀉，電針百會(huì)穴治療1周后(第13天)，百會(huì)組的腹瀉指數(shù)較模型組明顯下降，表明電針百會(huì)穴對(duì)腹瀉起到了一定的緩解作用。治療2周后(第19 天)，腹瀉指數(shù)降為0，表明電針百會(huì)穴可有效緩解脾虛泄瀉大鼠腹瀉癥狀，這與施旭光等[14]、肖怡等[15]報(bào)道的脾虛泄瀉模型建立后及藥物治療后腹瀉指數(shù)變化趨勢(shì)一致。

中(獸)醫(yī)學(xué)的脾包括現(xiàn)代解剖學(xué)中的脾和胰腺[16-17]。本研究結(jié)果顯示，脾虛泄瀉時(shí)，會(huì)導(dǎo)致雌性大鼠的脾指數(shù)顯著增大，胰腺指數(shù)顯著減小，這與藺曉源等[18]報(bào)道的脾虛泄瀉動(dòng)物脾增大相一致。說(shuō)明脾、胰功能及形態(tài)發(fā)生了改變，這可能是由于脾虛泄瀉時(shí)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)而使脾發(fā)生了代償，胰腺指數(shù)下降可能是由于胰腺發(fā)生萎縮，這與本研究中胃腸消化吸收功能減弱相一致。本研究未選用雄性大鼠的臟器指數(shù)數(shù)據(jù)是由于雄性大鼠體質(zhì)量變化過大，臟器指數(shù)測(cè)量大多依賴體質(zhì)量而發(fā)生偏差，導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確。通過電針百會(huì)穴降低了脾指數(shù)，提升了胰腺指數(shù)，從而恢復(fù)了脾和胰腺的功能狀態(tài)，進(jìn)一步說(shuō)明電針百會(huì)穴對(duì)脾虛泄瀉具有一定的治療作用。

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為D-木糖吸收試驗(yàn)是一種重要且靈敏度較高的檢查胃腸吸收的方法[19-20]。主要是因?yàn)镈-木糖吸收部位在小腸，其代謝不需要消化酶的參與，經(jīng)腎以尿液形式排出體外[21]。脾胃虛弱時(shí)小腸細(xì)胞膜表面的Na-K-ATP酶活性降低，小腸黏膜的吸收功能下降導(dǎo)致吸收D-木糖的能力降低[22]。AMS廣泛存在于唾液和胰腺中，發(fā)生脾虛泄瀉時(shí)，淀粉酶活性降低而導(dǎo)致消化不良[23]。本研究結(jié)果顯示，脾虛泄瀉模型組大鼠D-木糖及AMS水平降低，可能是由于泄瀉導(dǎo)致腸道吸收水平降低，而百會(huì)組D-木糖及AMS水平升高，說(shuō)明電針百會(huì)穴上調(diào)了D-木糖及AMS水平，恢復(fù)了腸道的吸收功能。這與黃娟等[24]、張明等[25]關(guān)于脾虛泄瀉動(dòng)物體內(nèi)D-木糖及AMS變化結(jié)果一致。

脾虛泄瀉的產(chǎn)生通常伴隨炎癥因子的變化[26]。孫勝振等[27]發(fā)現(xiàn)使用蒼術(shù)和白術(shù)配伍對(duì)脾虛泄瀉動(dòng)物體內(nèi)炎性因子有較好的改善作用。長(zhǎng)期腹瀉會(huì)損傷腸黏膜，引起機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，釋放炎性因子，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)促炎因子水平升高[28]。IL-2能活化T細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生，并激活巨噬細(xì)胞，調(diào)節(jié)腸道炎癥環(huán)境。IL-2、IL-12都是促炎因子，IL-12可以促進(jìn)TNF-α的釋放[29]。TNF-α在腸道中促進(jìn)炎癥的發(fā)生，充當(dāng)黏膜損傷介質(zhì)并導(dǎo)致腸黏膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化[30]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，電針百會(huì)穴可能是通過抑制了IL-12的表達(dá)水平，導(dǎo)致TNF-α水平降低，抑制了炎癥反應(yīng)，從而緩解脾虛泄瀉模型動(dòng)物體內(nèi)炎癥反應(yīng)，以治療脾虛泄瀉。

4 結(jié) 論

成功建立了脾虛泄瀉大鼠模型，電針刺激百會(huì)穴對(duì)脾虛泄瀉具有一定的治療效果，主要表現(xiàn)為緩解脾虛泄瀉的癥狀體征，增加體質(zhì)量，緩解腹瀉，增強(qiáng)腸道消化吸收功能，降低機(jī)體的炎性反應(yīng)。這為臨床治療脾虛泄瀉提供一種方便快捷的針灸方法，并為研究針刺百會(huì)穴可以治療脾虛泄瀉提供證據(jù)支持。