李姍姍 趙民楷 馮丹彥 阮鈴茹 王小敏*

（玉林師范學(xué)院 生物與制藥學(xué)院，廣西 玉林 537000）

大蒜（Allium sativumL.），俗稱蒜頭，胡蒜，獨蒜等，屬于半年生草本植物，百合科蔥屬，為廣義大蒜的地下鱗莖[1]。大蒜是重要的調(diào)料和經(jīng)濟作物，蒜苗、蒜薹是重要的蔬菜。大蒜含一種天然的廣普抗生素，具有很強的殺菌能力，對多種病原菌和多種微生物具有殺滅作用[2]。目前，對大蒜的研究主要集中在其農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量以及其有效成分的提取上，在提取大蒜DNA 方面的研究較少。因此，尋找一種可以簡便、迅速、安全、有效的大蒜基因組DNA 的提取方法成為很多研究者的共識。姚瓊鳳對大蒜的提取采用十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）法、簡化CTAB 法、改良十二烷基硫酸鈉（SDS）法[3]。本研究通過CTAB法、SDS 法、尿素法、試劑盒法、高鹽低pH 法這五種不同的方法分別對玉林大蒜鱗莖的DNA 進行提取，分析對比不同方法對玉林大蒜鱗莖DNA 的提取效果，給同科屬及不同品種的植物DNA 提取提供一定的參考依據(jù)，為大蒜分子育種以及遺傳轉(zhuǎn)化中DNA 的提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大蒜：來自于玉林仁東本地種植的大蒜。將新鮮采摘的大蒜鱗莖洗凈，自然晾干后剪碎，-80℃凍存待用。

1.2 DNA 的提取

1.2.1 SDS 法提取DNA

精密稱取1g 大蒜鱗莖，低溫研磨，置于1.5mL離心管中。往離心管中加入700μL1.5%SDS和10μLβ-巰基乙醇，充分混勻后65 ℃保溫30min，每隔10min 輕搖一次。加入700μL 苯酚、氯仿、異戊醇（25241），37℃保溫20min。加入-20℃預(yù)冷的異丙醇1mL，-20℃保存30min 后，4℃下10000rpm離心10min。將沉淀轉(zhuǎn)移至新1.5mL離心管中，加入1.5mL70%乙醇，輕搖5min，4℃下10000rpm 離心10min，收集沉淀，并重復(fù)1-2次。棄乙醇，超凈環(huán)境中5min 晾干，加入50μL的TE 緩沖液，待DNA 溶解后-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CTAB 法提取DNA

根據(jù)陳恒宇[4]等DNA 提取方法，略有改進。CTAB 提取液65℃預(yù)熱，異丙醇和氯仿異戊醇（241）混合液4℃預(yù)冷。精密稱取1g 大蒜鱗莖，低溫研磨，置于1.5mL 離心管中。向1.5mL 離心管中加入650μL CTAB 提取液，充分混勻1min，65℃保溫40min，每隔10min 上下顛倒3-4 次。加入650μL 預(yù)冷氯仿異戊醇（241）混合液，輕搖5min。于12000rpm 下離心10min，取上清液置新1.5mL 離心管中，加入上清液體積1/2 的預(yù)冷異丙醇，邊顛倒混勻邊觀察溶液變化，可見少量DNA 沉淀析出，析出DNA 呈白色絮狀或白色渾濁狀。在10000rpm 離心10min，取DNA 沉淀加600μL 無水乙醇洗滌，在12000rpm 離心5min，洗滌沉淀1-2 次。超凈環(huán)境中晾干后加80μL TE緩沖液溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 尿素法提取DNA

尿素法參照文獻[5]，并做修改。DNA 抽提液65℃預(yù)熱，抽提液與亞硫酸氫鈉500:1 比例加入亞硫酸氫鈉，溶解，65℃保溫。精密稱取1g 大蒜鱗莖，加入2.5mLDNA 抽提液（65℃），低溫研磨，置1.5mL 離心管中于65℃保溫30min，每隔10min 搖勻一次。吸取混合液置于新的1.5mL 離心管中，等體積加入氯仿異戊醇（241）混合液，15000rpm 離心15min，取上清液置新1.5mL 離心管中，加2 倍體積預(yù)冷的95%乙醇，把DNA 沉淀置新1.5mL 離心管中，加適量體積的70%乙醇洗滌，10000rpm 下離心1min，重復(fù)洗滌3 次。棄上清液，超凈環(huán)境中晾干，加入適量體積的TE 緩沖液，65℃溶解。加入與TE 緩沖液等體積的苯酚氯仿（11）混合液，15000rpm 下離心5min。將上清液置于新的1.5mL 離心管中，加等體積氯仿異戊醇（241）混合液，15000rpm 下離心5min。將上清液置新1.5mL 離心管中，加入其體積1/10的3mol/L 的醋酸鈉溶液，再加總體積2 倍預(yù)冷的95%乙醇，混勻后-20℃下放置12h。15000rpm下離心10min，70%乙醇重復(fù)洗滌3 次，加入適量TE 緩沖液65℃溶解后于-70℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 試劑盒法提取DNA

選用TaKaRa 公司mini BEST Plant Genimic DNA Extraction Kit 型試劑盒。精密稱取1 g 大蒜鱗莖，低溫研磨，置于1.5mL 離心管中。1mL Buffer HsII 與20μL 的RNase A混合液56 ℃保溫10min。加125μL 的Buffer KAC，冰上放置5min。12000rpm 離心5min。取上清液置新1.5mL離心管中，加等體積Buffer GB，混合后置吸附柱上。12000rpm 離心1min，棄廢液，加500μL的Buffer WA，12000rpm 離心1min，棄廢液。加700μL 的Buffer WB，重復(fù)離心1 次。12000rpm空柱離心2min。棄吸附管，加40μL 的Buffer，靜置5min，12000rpm離心2min，-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 高鹽低pH 法提取DNA

精密稱取1g 大蒜鱗莖，加入少量PVP 低溫研磨置1.5mL 離心管中。加750μL 高鹽低pH 提取液，65℃保溫40min，隔10min 取出混勻1 次。12000rpm 離心10min，取上清液置新1.5mL 離心管中。加等體積2.5mol/LNaAc（pH4.8）溶液，4℃下靜置30min。12000rpm 離心2min，棄沉淀，加入上清液2/3 體積的氯仿異戊醇（241）混合液，重復(fù)1 次。取上清液置1.5mL 離心管中，加2/3體積無水乙醇，-20℃靜置60min。8000rpm 離心5min，取DNA 沉淀70%乙醇洗滌3 次。晾干，加100μL TE 緩沖液溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA 質(zhì)量檢測

吸10μL 不同方法提取所得的DNA 溶液，加290μL 的蒸餾水稀釋至300μL，使用北京普析通用儀器有限公司TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計分別測其260nm 和280nm 波長處的吸光值透光率[6]，通過A=-lgT=ECL 計算吸光值，分析判斷其濃度與純度。

瓊脂糖凝膠制備（含1%瓊脂糖與1%核酸染液），取2.5μL 10X Loading Buffer 與4.5μL DNA樣品混合，再吸取2μL Marker，依次上樣，電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外分光結(jié)果分析

分別對采用5 種不同方法提取的玉林大蒜鱗莖DNA 溶液其純度和濃度進行檢測，結(jié)果見表1。

表1 DNA 濃度及A260/A280 值

尿素法、高鹽低pH 法和CTAB 法提取的DNA 其A260/A280的值分別為1.830、1.791 和1.758，在1.8 左右，純度較高。試劑盒法、SDS法提取的DNA 其A260/A280 的值分別為1.352 和1.380 小于1.6，純度較差。CTAB 法提取的DNA濃度最高，為798.33μg/mL，SDS 法次之，為669.667μg/mL，尿素法為590.667μg/mL，高鹽低pH 法為238μg/mL，試劑盒法提取濃度最低，為102.833μg/mL。由此可知：高鹽低pH法，CTAB 法，尿素法都能提取到純度較好的DNA，CTAB 法所得的DNA 濃度最高，試劑盒法提取的DNA 濃度最低。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析

采用5 種方法提取的玉林大蒜鱗莖DNA 通過瓊脂糖凝膠電泳檢測后結(jié)果如圖1 所示。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖

由圖1 可看出，泳道1 的CTAB 法，所提取的DNA 條帶最為明亮，泳道2 的SDS 法提取DNA條帶亮度次之，泳道4 的尿素法提取的DNA 條帶較SDS 法稍暗。泳道3 的試劑盒法和泳道5 的高鹽低pH 法提取的DNA 條帶亮度相差較小，跟前三種方法比較，這兩種方法提取的DNA 條帶較暗。DNA 條帶亮度與上述濃度相對應(yīng)。CTAB 法的點樣孔處明顯發(fā)亮，表明該法提取的DNA 中可能含有沒被除掉的蛋白質(zhì)、多糖和一些其它的次生代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)具有粘黏性，易跟DNA 結(jié)合形成復(fù)合物。CTAB 法、SDS 法、尿素法，這三種方法提取的DNA 條帶都有不同程度的彌散，說明DNA 完整性不好，其中CTAB 法彌散最嚴(yán)重，SDS 法次之，尿素法DNA 條帶彌散拖尾程度最輕。

3 結(jié)論

影響植物DNA 提取質(zhì)量的因素主要是多酚類及多糖類物質(zhì)[7]，大蒜中含有大量的多酚類物質(zhì)和多糖[8-9]，因此在提取大蒜DNA 的過程中，多糖和多酚類物質(zhì)的去除，直接決定著提取的DNA質(zhì)量。

1）DNA 濃度上，CTAB 法、SDS 法、尿素法提取的DNA 濃度均在500μg/mL 以上，而試劑盒法和高鹽低pH 法提取的DNA 濃度較低；

2）DNA 純度上，CTAB 法、尿素法、高鹽低PH 法提取的DNA 的A260/A280 的值均在1.8 左右，純度很高，而試劑盒法、SDS 法提取的DNA的A260/A280 的值都遠遠小于1.6，說明DNA 樣品中蛋白質(zhì)或酚污染較嚴(yán)重；

3）電泳條帶亮度上，CTAB 法、SDS 法、尿素法提取的DNA 條帶亮，試劑盒法和高鹽低pH法提取的DNA 條帶暗；電泳條帶彌散程度上，試劑盒法和高鹽低pH 法彌散均不明顯，CTAB 法彌散最嚴(yán)重，且點樣孔有明顯發(fā)亮，SDS 法彌散次于CTAB 法，尿素法介于SDS 法和試劑盒法、高鹽低pH 法之間。

試劑盒法操作簡便，安全無毒，但成本較高，且其裂解系統(tǒng)對大蒜多糖和多酚類物質(zhì)的去除不如其它四種采用苯、酚、氯仿、異戊醇對DNA 進行抽提的效果好。尿素法用了苯、酚混合液和氯仿、異戊醇混合液對DNA 進行了兩次抽提，同時也用了乙醇溶液對DNA 沉淀進行了多次洗滌，操作條件溫和，DNA 損傷較小，所得DNA 質(zhì)量相較于其它四種方法為最好。通過比較分析，最適合玉林大蒜鱗莖DNA 的提取方法是尿素提取法。