陳兆玉,王永,2,丁靜*,李義

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實驗室/園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,河南 鄭州 450002;3.康涅狄格大學(xué)植物科學(xué)與景觀建筑系,斯托爾斯 美國 CT06269)

番茄(Solanumlycopersicum)是世界范圍內(nèi)廣泛種植的茄果類蔬菜,其生長的最適土壤濕度為60%～70%[1],易受干旱脅迫等逆境傷害。干旱會引起番茄植株發(fā)生一系列生理生化變化,包括含水量降低、光合速率下降、細(xì)胞膜損傷以及活性氧(ROS)積聚等[2],從而導(dǎo)致其果實產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。

細(xì)胞分裂素是最重要的植物激素之一,廣泛參與植物的生長發(fā)育過程[3],包括促進(jìn)細(xì)胞分裂和芽分化,解除頂端優(yōu)勢,抑制側(cè)根生長,延緩葉綠素分解和葉片衰老等[4]。細(xì)胞分裂素對植物生長發(fā)育的調(diào)控依賴于細(xì)胞分裂素受體(屬于組氨酸激酶,histidine kinase,HK)。受體HK蛋白與細(xì)胞分裂素結(jié)合后,通過磷酸基團(tuán)的傳遞,激活對下游響應(yīng)基因的調(diào)控[5]。研究表明,HK基因的突變會阻斷細(xì)胞分裂素的信號傳遞,使植株對細(xì)胞分裂素不敏感,并表現(xiàn)出細(xì)胞分裂素缺乏的表型,如植株生長停滯、葉片衰老提前及側(cè)根數(shù)目增加等[5-6]。

研究表明,擬南芥中有3個細(xì)胞分裂素受體基因:AHK2、AHK3和AHK4[7]。其中,AHK2主要在葉和花中表達(dá),在根中表達(dá)量很低;AHK3在各個組織中都有較高的表達(dá);AHK4主要在根和花梗及其他維管束組織中表達(dá),而在葉片中表達(dá)量很低[7-8]。對擬南芥不同細(xì)胞分裂素受體突變體的研究表明,AHK3主要調(diào)控地上部的生長發(fā)育,且是抑制葉片衰老的關(guān)鍵受體[9];AHK4主要調(diào)控根的生長發(fā)育、愈傷的形成和植株對磷酸的響應(yīng)等[10-11];AHK2參與AHK3、AHK4的調(diào)控,其特定功能尚有待發(fā)現(xiàn)。不同細(xì)胞分裂素受體基因的功能既有特異性,又有一定的冗余。擬南芥單/雙受體基因的突變對植物的生長沒有影響或僅有很小的影響,只有當(dāng)AHK2、AHK3和AHK4這3個基因同時突變,才明顯抑制擬南芥植株的生長,使雌性和雄性器官發(fā)育異常[5,8,11]。

此外,已有研究顯示,細(xì)胞分裂素受體在ABA信號傳導(dǎo)和非生物脅迫反應(yīng)中起負(fù)調(diào)控作用[12-13]。ahk2、ahk3單突變體和ahk2/ahk3雙突變體比野生型(WT)具有更強(qiáng)的抗旱性和耐鹽性。然而,ahk4突變體在干旱脅迫下的表型和復(fù)水后的植株存活率與WT沒有顯著差異;在外施細(xì)胞分裂素的條件下,ahk4突變體的耐鹽性顯著提高[13],因此認(rèn)為受體基因AHK4對擬南芥非生物脅迫抗性的調(diào)控依賴于細(xì)胞分裂素的存在。

筆者所在課題組前期對番茄細(xì)胞分裂素受體基因進(jìn)行了鑒定及CRISPR/Cas突變。本研究以擬南芥受體基因AHK4在番茄中的直系同源基因SlHK4的突變株系為材料,分析比較slhk4突變株系和WT在干旱脅迫下的表型、光合作用、抗氧化性等方面的差異,旨在為系統(tǒng)解析細(xì)胞分裂素及其受體基因在番茄抗逆性中的功能及其分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 載體構(gòu)建、試驗材料及干旱處理

本試驗以劉耀光老師課題組的pYLCRISPRCas9Pubi-N載體[14]為基礎(chǔ),構(gòu)建細(xì)胞分裂素受體基因SlHK4(Solyc04g008110)的CRISPR/Cas編輯載體。利用在線工具CRISPR-P 2.0(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)在SlHK4基因的5′端分別設(shè)計2個sgRNA序列,即sgRNA1(CAAGCTTCCGGAAAACCCGA)和sgRNA2(TCTTAAGAGCTAGGGCCAGT);使用pYLgRNA中間載體[14]上的AtU3d、AtU3b啟動子分別驅(qū)動sgRNA1和sgRNA2,同時連入pYLCRISPRCas9Pubi-N載體,獲得編輯載體CRISPR-SlHK4。所有DNA片段合成由南京金斯瑞公司完成。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將CRISPR-SlHK4載體遺傳轉(zhuǎn)化番茄品種‘Micro-Tom’。使用PCR擴(kuò)增CRISPR/Cas轉(zhuǎn)基因及sgRNA靶定區(qū)域(引物序列見表1),并利用測序鑒定sgRNA靶定位點(diǎn)的突變。將具有突變的株系自交繁殖,獲得不含有CRISPR/Cas外源基因的2個T3代獨(dú)立純合突變株系slhk4-4和slhk4-118。經(jīng)測序檢驗,與WT相比,slhk4-4和slhk4-118突變株系均在sgRNA1靶定區(qū)域存在突變;從SlHK4基因起始密碼子開始計算,slhk4-4和slhk4-118分別缺失了第700～704 bp的4個核苷酸和第600～703 bp的103個核苷酸(圖1)。

表1 本試驗所用的引物

圖1 slhk4-4(A)和slhk4-118(B)突變株系靶定位點(diǎn)測序結(jié)果

選取飽滿的slhk4-4、slhk4-118T3代種子和‘Micro-Tom’番茄(WT)種子,無菌水浸泡12 h后置于暗處催芽。待種子露白后,播種于盛有育苗基質(zhì)的穴盤中,放置在晝/夜溫度為25 ℃/20 ℃、晝/夜時間為 16 h/8 h、光照強(qiáng)度為200 μmol·m-2·s-1和相對濕度50%～55%的氣候生長室中生長7 d。選取長勢一致的slhk4-4、slhk4-118和WT幼苗各30株,移栽到盛有栽培基質(zhì)的花盆(直徑10 cm,高10 cm)中,于相同條件生長30 d。徹底灌水后停止?jié)菜?進(jìn)行干旱處理。停止?jié)菜?干旱處理)30 d后對所有植株徹底澆灌復(fù)水,復(fù)水7 d后統(tǒng)計植株存活率。

1.2 生理生化指標(biāo)的測定

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果,干旱處理15 d以上,植株開始出現(xiàn)干旱表型。將干旱處理8 d作為番茄正常生長的對照組開始取樣,每個參數(shù)測定3個重復(fù),每個重復(fù)至少包含8株植株材料,盡量避免取萎蔫葉片。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

1.2.1 葉片相對含水量的測定取干旱處理8、20、24、27 d植株倒數(shù)第3片新鮮葉片,去除葉脈后測定葉片相對含水量(RWC)[15]。計算公式:RWC=(自然鮮重-干重)/(飽和鮮重-干重)×100%。

1.2.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定取干旱處理8、20、24、27 d植株倒數(shù)第5片新鮮葉片,暗處理15 min后,使用調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)(Image-Pam)測定葉綠素?zé)晒鈪?shù),包括:光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、實際光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)、光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)和電子傳遞相對速率(ETR)。

1.2.3 葉綠素含量的測定取干旱處理8、13、21、30 d植株倒數(shù)第5片葉片,使用手持葉綠素儀(SPAD-502 Plus)測定。

1.2.4 氧化脅迫相關(guān)參數(shù)的測定取干旱處理8、14、20、22 d植株倒數(shù)第4片葉片,立刻在液氮中冷凍并保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。由于干旱處理22 d之后的WT葉片萎蔫嚴(yán)重,不適合取樣,因此未對之后的葉片進(jìn)行相關(guān)參數(shù)的檢測。采用超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)測定SOD活性,采用植物谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(南京菲亞生物公司)測定GST含量,采用丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京邁博生物科技生物公司)測定MDA含量。

1.3 RNA提取和實時熒光定量PCR

取干旱處理8、16、20、22 d植株倒數(shù)第4片葉片,采用改良CTAB法[16]提取RNA。由于干旱處理22 d之后的WT葉片萎蔫嚴(yán)重,不適合取樣,未對之后的葉片進(jìn)行基因表達(dá)的檢測。采用PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser(perfect real time)試劑盒(TaKaRa)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,作為實時熒光定量PCR(RT-qPCR)反應(yīng)的模板。RT-qPCR所用的熒光染料為DRR041A SYBR(TaKaRa)。應(yīng)用CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad)進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng),每個樣品3個重復(fù)。擴(kuò)增程序為:95 ℃ 1 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法[17]將基因的表達(dá)值用番茄SlActin內(nèi)參基因(引物序列見表1)進(jìn)行歸一化處理,計算基因的相對表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件和SPSS 24軟件進(jìn)行分析和圖表繪制。顯著性檢驗使用One-way ANOVA方差檢驗和Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 SlHK4基因突變對干旱脅迫下番茄表型及存活率的影響

選取野生型(WT)、slhk4-4和slhk4-118番茄幼苗各30株進(jìn)行干旱處理,結(jié)果(圖2)表明,干旱處理前,與WT相比,2個突變株系地上部較矮。正常生長25 d時,slhk4-4株系平均株高5.3 cm,略小于slhk4-118株系(5.5 cm),顯著小于WT(8.0 cm)。此外,2個突變株系地上部冠幅較小,葉面積較小,但復(fù)葉數(shù)目與WT相同。干旱處理8 d,各株系番茄葉片均正常舒展,未發(fā)現(xiàn)可見的干旱表型變化。干旱處理16 d,有11株WT植株部分葉片尖端或邊緣向上翻卷,出現(xiàn)輕微萎蔫現(xiàn)象;而slhk4株系的葉片均正常舒展,未萎蔫。干旱處理22 d,30株WT植株均出現(xiàn)葉片萎蔫下垂現(xiàn)象,其中13株全部葉片萎蔫,莖皺縮;slhk4株系中,僅一半植株出現(xiàn)輕微葉片萎蔫,slhk4-4和slhk4-118株系間無明顯差異。干旱處理30 d,所有番茄植株均處于缺水萎蔫狀態(tài),WT多數(shù)植株整株枯萎且倒伏,2個slhk4株系葉片萎蔫程度比WT低且大多數(shù)未倒伏。干旱處理期番茄植株的表型變化顯示,slhk4-4和slhk4-118株系的耐旱性很可能高于WT。

圖2 干旱和復(fù)水條件下slhk4-4、slhk4-118及野生型(WT)的表型

干旱處理30 d后給所有植株復(fù)水,復(fù)水7 d后統(tǒng)計各株系的存活率,發(fā)現(xiàn)30株WT中存活3株,存活率僅為10.0%;而slhk4-4和slhk4-118分別存活18和19株,存活率為60.0%和63.3%,分別是WT的6.0和6.3倍。復(fù)水后植株存活率的統(tǒng)計表明,slhk4突變株系的抗旱能力顯著高于WT。

干旱脅迫過程中各株系葉片相對含水量(RWC)結(jié)果(圖3-A)顯示,各株系葉片RWC隨著干旱時間的延長均大幅降低,但WT下降幅度更大。干旱處理8 d,slhk4突變株系葉片RWC與WT無顯著差異,均為90%左右;干旱處理20、24和27 d,slhk4株系的RWC顯著高于WT。slhk4-4株系干旱處理24 d時葉片RWC(55.6%)與WT干旱處理20 d時(55.6%)相同;干旱處理27 d,slhk4-4和slhk4-118的RWC與WT差異最為顯著,分別是WT的1.7和1.6倍。表明干旱脅迫下,slhk4突變株系葉片的持水能力更強(qiáng)。

由圖3-B可以看出:干旱響應(yīng)標(biāo)記基因SlDREB1基因在干旱處理前16 d的各株系葉片中表達(dá)量極低且沒有明顯差異;干旱處理20 d,WT葉片中SlDREB1表達(dá)量大幅增加,而slhk4突變株系中SlDREB1基因的表達(dá)尚無顯著變化。干旱處理22 d,slhk4和WT葉片中SlDREB1的表達(dá)均顯著上調(diào),且slhk4-4株系SlDREB1表達(dá)量上升的幅度高于WT。

圖3 干旱脅迫下slhk4-4、slhk4-118及WT葉片的相對含水量(A)和干旱響應(yīng)標(biāo)記基因SlDREB1的表達(dá)量(B)

綜合以上結(jié)果可以得出:干旱處理8 d時,WT與slhk4突變株系均尚未受到干旱脅迫,該時間點(diǎn)可作為干旱處理的起始對照點(diǎn);在相同干旱條件下,2個slhk4株系的持水能力比WT強(qiáng),較晚受到干旱脅迫的影響;slhk4株系受到干旱脅迫后其在較短時間內(nèi)的響應(yīng)幅度可能比WT更劇烈。

2.2 SlHK4基因突變對干旱脅迫下番茄光合性能的影響

由圖4-A可見:干旱處理13 d,2個slhk4株系葉片葉綠素含量與干旱處理8 d無顯著差異,且顯著高于WT。隨著干旱程度增加,WT葉片葉綠素含量逐漸降低,干旱處理21、30 d,WT葉片葉綠素含量分別比干旱處理8 d減少7.5%和22.2%,而2個slhk4株系葉片的葉綠素含量均沒有下降,slhk4-118葉片葉綠素含量甚至略有升高,說明本試驗中的干旱處理對slhk4株系葉片的影響較小,并未引起slhk4株系葉片中葉綠素的大量降解。

干旱處理8 d,即無干旱脅迫條件下,2個slhk4突變株系和WT的光合作用沒有顯著差異(圖4-B—E)。干旱處理24 d前,各株系間Fv/Fm差異不大,且均未出現(xiàn)顯著下降;直至干旱處理27 d,WT的Fv/Fm大幅下降,而2個slhk4株系基本不變(圖4-B)。WT和2個slhk4株系的ΦPSⅡ和qP均從干旱處理24 d開始下降;干旱處理27 d時,WT的ΦPSⅡ和qP大幅下降至極低的水平;而2個slhk4株系下降不明顯(圖4-C—E)。WT和2個slhk4株系的ETR在干旱處理8～20 d均發(fā)生大幅降低;WT的ETR在干旱處理27 d再次顯著降低,而2個slhk4株系變化不大。與干旱處理8 d相比,干旱處理27 d時WT的Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP和ETR分別下降21.2%、90.6%、92.9%和96.5%,說明在干旱脅迫后期,WT的光合作用受到嚴(yán)重影響;而此時2個slhk4株系的Fv/Fm并未顯著下降,ΦPSⅡ、qP和ETR的下降幅度也顯著小于WT,表明slhk4株系在相同干旱條件下的光合性能更強(qiáng)。

圖4 干旱脅迫下slhk4-4、slhk4-118和WT葉片的光合作用相關(guān)參數(shù)

干旱處理8 d,2個slhk4株系的SlPsbQ基因表達(dá)量與WT差異不大;干旱處理16 d,2個slhk4株系和WT的SlPsbQ表達(dá)量大幅降低;干旱處理20 d,WT的SlPsbQ表達(dá)量下降到極低水平,與干旱處理8 d相比下調(diào)97.7%,slhk4-4和slhk4-118株系SlPsbQ表達(dá)量顯著高于WT,分別是WT的8.2和7.3倍。說明干旱脅迫下,slhk4株系光合速率下降比WT慢,光合作用更強(qiáng),slhk4突變株系抗旱性更強(qiáng)。

2.3 SlHK4基因突變對干旱脅迫下番茄活性氧(ROS)清除能力的影響

由圖5可見:干旱處理8 d時,2個slhk4株系的MDA含量與WT無明顯差異;干旱處理14和22 d,2個slhk4株系和WT葉片的MDA含量均顯著升高,但2個slhk4株系的增幅小于WT;干旱處理22 d,slhk4-4、slhk4-118葉片的MDA含量分別比WT降低42.5%和18.6%,說明slhk4株系的膜系統(tǒng)氧化損傷程度較輕,即slhk4株系內(nèi)部的ROS毒害作用可能較小。

圖5 干旱脅迫下slhk4-4、slhk4-118和WT葉片的氧化脅迫相關(guān)參數(shù)

干旱處理14 d,WT的GST含量比干旱處理8 d顯著增加(55.8%),而slhk4-4、slhk4-118株系變化不大(分別增加8.2%、6.2%);干旱處理22 d,2個slhk4株系的GST含量顯著升高,slhk4-4、slhk4-118的GST含量分別比WT高11.0%、45.2%。隨著干旱程度增加,slhk4株系中編碼POX的SlCEVI-1基因表達(dá)量在干旱處理20 d顯著上升,而WT中略微下降。干旱處理22 d,slhk4-4、slhk4-118中SlCEVI-1表達(dá)量分別是WT中的3.7和5.2倍。因此,GST和SlCEVI-1可能參與slhk4株系中過量ROS的清除;slhk4株系可能通過提高干旱脅迫條件下的GST含量和SlCEVI-1基因的表達(dá)量,加速清除體內(nèi)的過量ROS。

slhk4-4、slhk4-118株系在干旱處理期內(nèi)SOD活性均顯著低于WT,但在干旱處理22 d大幅上升(分別升高71.3%和55.8%),而WT升高較少(22.8%),說明SOD可能參與干旱脅迫中后期slhk4株系中ROS的加速清除。此外,2個slhk4株系與WT中SlCAT1基因表達(dá)量始終差異不大,表明CAT可能不是slhk4株系ROS清除能力提高的原因。SOD、GST和POX可能對slhk4株系抗氧化性的提高有所貢獻(xiàn)。

3 討論

植物可以通過調(diào)控光合作用、滲透調(diào)節(jié)、抗氧化代謝等生理生化過程響應(yīng)干旱脅迫[18]。本研究結(jié)果表明,相同干旱條件下,相比于野生型番茄,2個slhk4突變株系存活率更高,葉片含水量更高,光合作用更強(qiáng),清除ROS能力更強(qiáng),說明slhk4株系比WT更抗旱。slhk4-4和slhk4-118株系的部分參數(shù)存在差異,但均顯著優(yōu)于WT,且兩者總體抗旱性差異不大,表明細(xì)胞分裂素受體基因SlHK4在番茄抗旱性中具有負(fù)調(diào)控作用。而在擬南芥中,AHK4單基因的突變對植株抗旱性沒有明顯作用。在外施細(xì)胞分裂素的條件下,ahk4突變體的耐鹽性才顯著提高[13]。這說明不同植物的直系同源細(xì)胞分裂素受體在干旱等非生物脅迫中的功能及作用機(jī)制并不完全一致。

葉綠素和葉綠素?zé)晒鈪?shù)是衡量植物葉片光合性能的重要指標(biāo)[19-20]。擬南芥AHK4單基因的突變不影響葉片葉綠素含量,AHK2和AHK4雙基因突變使葉片葉綠素含量顯著升高[5],說明AHK4很可能在依賴于細(xì)胞分裂素的葉綠素保持中不起主要作用。本試驗結(jié)果表明,SlHK4單基因的突變即引起葉片葉綠素含量顯著上升,并且對干旱條件下的葉綠素降解具有明顯的抑制作用,說明SlHK4基因很可能負(fù)調(diào)控番茄葉片的葉綠素含量。干旱處理27 d,WT的ΦPSⅡ、qP和ETR均大幅下降至很低水平,說明其光合作用在干旱處理后期很可能受到嚴(yán)重影響,這與干旱脅迫致使生菜幼苗ΦPSⅡ、qP及ETR等指標(biāo)降低的研究結(jié)果一致[21];而slhk4突變株系的葉綠素?zé)晒鈪?shù)均顯著高于WT,說明slhk4光合性能雖然受到了影響但程度較輕。

葉綠體中的光合電子傳遞鏈?zhǔn)侵参锂a(chǎn)生ROS的主要場所之一[22]。正常生長條件下,植株體內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡[23]。干旱條件下,氣孔關(guān)閉,葉肉細(xì)胞內(nèi)的二氧化碳濃度下降,使得光合作用減弱,光能相對過量,光合電子傳遞鏈中產(chǎn)生的ROS增加[22]。大量增加的ROS很可能引起葉綠素分子及其他光合組件被破壞,導(dǎo)致光合性能進(jìn)一步降低。本研究結(jié)果顯示,slhk4突變株系清除ROS的能力較強(qiáng),葉片內(nèi)的MDA含量較低,ROS毒害作用較小,所以相同干旱條件下,slhk4株系的葉綠體和光合組件受到的損害可能小于WT,因而能夠保持更強(qiáng)的光合能力。這與在茶菊[24]和芍藥[25]上的研究結(jié)果一致。

逆境脅迫條件下,植株可以通過提高抗氧化酶基因表達(dá)量,增加體內(nèi)抗氧化酶活性,來清除多余的ROS[26],之前的研究發(fā)現(xiàn),番茄幼苗的SOD、CAT等抗氧化酶的活性在干旱脅迫下會大幅提高[27-28]。本研究2個slhk4株系的GST含量、SOD活性以及SlCEVI-1的基因表達(dá)量大幅提高與之相一致。slhk4中SlCAT1的表達(dá)量與WT差異不大,推測GST、SOD、POX參與slhk4株系脅迫響應(yīng)中ROS的清除,而CAT則可能對slhk4株系抗旱性的提高貢獻(xiàn)不大。

本研究中,與WT相比,slhk4突變株系較矮,葉片面積較小,地上部長勢較弱,因此葉片蒸騰速率可能較小,相同干旱條件下的水分散失較低。除了ROS清除能力,這些表型性狀上的差異,也可能對slhk4突變株系抗旱性的提高有所貢獻(xiàn)。綜上,本研究為系統(tǒng)解析細(xì)胞分裂素受體基因SlHK4在番茄抗旱性中的功能奠定了基礎(chǔ),為培育抗旱性番茄提供了可利用的基因,但SlHK4基因突變提高番茄抗旱性的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。