劉冰　錢珊珊　李亞楠　顧敏　閆嘉

摘要：[目的]基于熒光定量免疫層析技術(shù)，開發(fā)一種生長化因子-15（（growth differentiation factor-15，GDF-15）定量檢測(cè)試劑盒。[方法]以熒光微球標(biāo)記偶聯(lián)抗體，硝酸纖維素膜上分別包被鼠抗人GDF-15單克隆抗體和羊抗鼠多克隆抗體，抗體作為檢測(cè)線和質(zhì)控線制備免疫熒光試紙條，采用熒光免疫層析技術(shù)，對(duì)試劑的線性范圍，最低檢出限，特異性，精密性，臨床診斷等方面進(jìn)行系統(tǒng)研究。[結(jié)果]該方法的靈敏度為0.5ng/mL，線性范圍為0.5-150 ng/mL，批內(nèi)變異系數(shù)為9.02%-14.16%，批間變異系數(shù)為10.99%-17.71%，相對(duì)偏差小于10%。[結(jié)論]建立一種操作簡便，靈敏度高，有良好準(zhǔn)確性和重復(fù)性，線性范圍較寬，能適和合臨床檢測(cè)的需要，用于疾病的早期篩查。

關(guān)鍵詞：GDF-15;熒光免疫層析技術(shù);試劑盒

GDF-15屬新發(fā)血清學(xué)標(biāo)志物，與多種心血管疾病診斷、預(yù)后判斷等有明確相關(guān)性。GDF-15與冠脈病變程度有關(guān)，可以通過GDF-15水平評(píng)估不良血管事件風(fēng)險(xiǎn)。正常情況下，機(jī)體內(nèi)GDF-15水平較低，在炎癥或損傷等狀態(tài)下，血清GDF-15表達(dá)水平明顯升高，并參與炎癥。

近年來熒光免疫層析技術(shù)快速發(fā)展，利用含有鑭系稀土元素的納米微球標(biāo)記偶聯(lián)抗體，結(jié)合后結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，力度均一，分散性相對(duì)較好，同時(shí)能夠有排除非特異性熒光的干擾，熒光壽命較長，分析靈敏度較高，該方法操作簡單，環(huán)境要求較低，使用簡單的儀器即可得到結(jié)果，適用于在基層醫(yī)院推廣使用。

1材料與方法

1.1儀器和試劑

1.2方法

1.2.1熒光微球偶合物的制備

1. 將偶聯(lián)后的微球取出，在15000r/min的條件下離心15min，溫度控制在4℃以下，離心結(jié)束后棄去上清液。加入一定量質(zhì)量的封閉液BSA，吹打混勻，超聲儀破碎，混勻后置于臺(tái)式恒溫振蕩器中避光震蕩，在37℃溫度下封閉1～2h，封閉結(jié)束后，4℃以下，15000r/min，離心15-20min，去除上清液。

1.2.2抗原檢測(cè)試劑的制備

（1）微球墊（結(jié)合墊）制備

將獲得的熒光微球標(biāo)記抗體，使用保護(hù)液對(duì)熒光微球偶聯(lián)物進(jìn)行稀釋，稀釋后使用XYZ噴金劃膜儀進(jìn)行噴球操作，噴球濃度，速度由實(shí)驗(yàn)獲得，使其均勻分布于玻璃纖維微球墊之上，將噴好的熒光免疫微球墊放置于干燥箱中進(jìn)行干燥，溫度設(shè)置為37℃，時(shí)間為8h以上。

（2）包被墊制備

以包被緩沖液將羊抗鼠多克隆抗體和鼠抗人GDF-15單克隆抗體稀釋至工作濃度配置成質(zhì)控線工作液（C）和檢測(cè)線工作液（T）。取稀釋后的羊抗鼠多克隆抗體工作液，用劃膜儀在硝酸纖維素膜上制備檢測(cè)線，噴量，劃膜儀平臺(tái)移動(dòng)速由實(shí)驗(yàn)獲得。取鼠抗人GDF-15單克隆抗用同樣的方法制備質(zhì)控線，室溫保持干燥。檢測(cè)線和質(zhì)控線在NC膜上之間的距離為5.0 ±0.1mm ，線寬約為0.8- 1.0mm，劃膜前后應(yīng)均勻，并置干燥箱37℃烘干，干燥保存。

（3）樣品墊

使用裁條機(jī)將玻璃纖維膜裁剪為一定寬度的樣品墊，將樣品墊置于干凈的器皿中，使用樣品墊處理液對(duì)其進(jìn)行浸泡，使其完全沉浸于溶液之中，浸泡一定時(shí)間后，用鑷子將其取出，平鋪在玻璃板上，然后將玻璃板放在干燥箱中干燥，溫度設(shè)置為37℃，干燥8小時(shí)以上。

1.2.3試紙條組裝

在溫度15-30℃，濕度≦30%的條件下，將樣品墊，微球墊，硝酸纖維素膜，吸水紙，PVC底板等物進(jìn)行組裝。

（1）貼熒光免疫微球墊：揭開PVC底板下方的雙面膠條，取干燥后的免疫微球墊，使其與包被膜的下緣重疊1～2mm，要求材料附著牢固。

（2）貼樣品墊：取干燥后的樣品墊，使其下緣與PVC底板下緣對(duì)其，上緣與免疫微球墊下緣的重疊寬度為1～2mm，要求材料附著牢固。

（3）貼吸水紙：揭開PVC底板上方的雙面膠條，取剪裁后的吸水紙，使其上緣與PVC底板的上緣對(duì)齊，下緣與包被膜的上緣重疊1～2mm，并壓平。

（4）切條及壓殼：將組裝后的PVC底板放置于微電腦自動(dòng)斬切機(jī)上，設(shè)置一定寬度的條寬，將其切為一定寬度的試紙條，將其放入塑料檢測(cè)卡底板中（操作過程中注意不要直接接觸包被膜），扣上塑料檢測(cè)卡上蓋，并將檢測(cè)卡壓緊，并與干燥劑一起放置于鋁箔袋中密封儲(chǔ)存。

1.2.4試紙條的檢測(cè)

（1）原理：待測(cè)血清加入加樣孔中后，血清中的抗原會(huì)和免疫微球墊上的熒光標(biāo)記GDF-15抗體結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，并在硝酸纖維素膜上通過毛細(xì)作用沿著液體層析方向移動(dòng)，從而被固定在T線上的包被抗體鼠抗人GDF-15單克隆抗體特異性的捕獲，形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物。此時(shí)鼠抗人抗體繼續(xù)移動(dòng)至C線，與其上的羊抗鼠抗體結(jié)合，使用熒光免疫層析檢測(cè)儀檢測(cè)，儀器會(huì)自動(dòng)讀取T線和C線上的熒光信號(hào)強(qiáng)度，由此來定量檢測(cè)血液中的抗原水平。

（2）檢測(cè)：在室溫條件下，用移液槍吸取80μL的樣品，垂直懸空緩慢加入樣品墊中，反應(yīng)完全后放入熒光免疫層析儀中檢測(cè)，讀取對(duì)應(yīng)的C、T值。在紫外燈下觀察，無論樣品中是否還有抗原，C線都應(yīng)該出現(xiàn)熒光條帶，若C線不出現(xiàn)熒光條帶，試紙條檢測(cè)結(jié)果則判定為無效。

1.2.5樣本檢測(cè)

取10uL全血或者5uL血漿樣本，加入到2mL的樣品稀釋液中，充分混勻后，取80ul混合液滴入到試劑卡樣品孔中，室溫下反應(yīng)5min后，用時(shí)間分辨熒光免疫分析儀判讀結(jié)果。

1.2.6性能評(píng)估

分別使用GDF-15內(nèi)部校準(zhǔn)品、含干擾物的樣品等對(duì)試劑卡進(jìn)行檢測(cè)，按照《體外診斷試劑分析性能評(píng)估系列指導(dǎo)原則（征求意見稿）》及《GDF-15技術(shù)審查指導(dǎo)原則》評(píng)估檢測(cè)系統(tǒng)的分析靈敏度、線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度、特異性及其穩(wěn)定性。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

檢測(cè)數(shù)據(jù)使用SPSS17.0等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行配對(duì)卡方檢驗(yàn)、Kappa一致性分析、線性回歸和Bland- Altman等分析考核試劑的相關(guān)性、一致性。同時(shí)檢測(cè)來自同一病人全血/血漿樣品各40份，考核試劑卡對(duì)不同標(biāo)本的檢測(cè)能力。

2.結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

用內(nèi)部校準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)濃度測(cè)試10次，剔除離群值后取平均值。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.0-150.0 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性范圍和相關(guān)性（r>0.98 ） 。

2.2分析靈敏度

以 0、0.25、0.50、1.0 ng/mL的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品各測(cè)定20次，以變異系數(shù)接近20%的最低濃度作為試劑盒的分析靈敏度，結(jié)果如表1。表明該試劑盒的分析靈敏度為0.1 ng/mL。

2.3精密度

選擇高（50.0ng/mL）、中（5.0ng/mL）、低 （1.0 ng/mL ）三個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行精密考察，共考察了3批產(chǎn)品，結(jié)果如表2。表明該試劑盒的批內(nèi)精密度<15%，批間精密度<20%，符合要求。

2.4特異性

選擇10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品濃度，分別在里面添加如表3中的物質(zhì)及其濃度，考察干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果如表3所示。表明干擾物質(zhì)對(duì)接觸結(jié)果影響甚微，偏差<10%，符合要求。

3討論

1）本試劑盒采用的主要原材料均為國產(chǎn)優(yōu)質(zhì)原材料，大幅降低了企業(yè)的生產(chǎn)成本，同時(shí)也能為客 戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品。配合本公司的快速時(shí)間分辨熒光免疫分析儀使用，能為患者現(xiàn)場(chǎng)提供快速、準(zhǔn)確的結(jié)果，特別適合中小型醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)，方便普通民眾的檢測(cè)需求。

2）本試劑盒利用時(shí)間分辨熒光微球標(biāo)記抗體技術(shù)，結(jié)合固相層析技術(shù)，采用雙抗體夾心法原理，GDF-15單克隆抗體標(biāo)記時(shí)間分辨熒光物質(zhì)（熒光信號(hào)示蹤），通過時(shí)間分辨熒光免疫分析儀俘獲檢測(cè)區(qū)域（T區(qū)）被激發(fā)的熒光信號(hào)，通過檢測(cè)區(qū)域/質(zhì)控區(qū)域的值與分析物的不同濃度獲得定標(biāo)曲線，實(shí)現(xiàn)人全血/血漿中的GDF-15定量檢測(cè)。

3）與一般的熒光物質(zhì)標(biāo)記不同，該方法采用了高熒光強(qiáng)度的時(shí)間分辨熒光微球進(jìn)行標(biāo)記，通過優(yōu)化標(biāo)記過程的每一個(gè)細(xì)節(jié)，使檢測(cè)試劑盒具有靈敏度高、檢測(cè)樣本用量少，檢測(cè)結(jié)果快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，保存有效期長的特點(diǎn)。

4）本研究對(duì)試劑盒的精密度、靈敏度、線性范圍和偏倚進(jìn)行了分析和評(píng)估，并與進(jìn)口試劑進(jìn)行對(duì)比分析，兩者具有良好的相關(guān)性，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），能夠滿足臨床的檢驗(yàn)需求。

5）本研發(fā)過程采用了企業(yè)與醫(yī)療機(jī)構(gòu)聯(lián)合研發(fā)的模式，在確保研發(fā)質(zhì)量的同時(shí)，能提高了研發(fā)效率，縮短研發(fā)周期，節(jié)省時(shí)間成本。

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