玫瑰花復(fù)合煎劑的毒性及免疫活性研究

鄭小娟

[摘要]目的：玫瑰花復(fù)合煎劑的急性毒性反應(yīng)及對小鼠免疫活性的研究。方法：采用最大耐受劑量法，以15000.mg/（kg·BW）劑量玫瑰花復(fù)合煎劑給予小鼠灌胃，觀察動物在一周內(nèi)的活動及中毒情況，考察小鼠是否有死亡現(xiàn)象，并進行大體解剖觀察病理改變;在加S9與不加S9混合液的條件下進行Ames試驗，以2.5、5.0、.10.0.g/（kg·BW）玫瑰花復(fù)合煎劑灌胃小鼠，進行小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗。保健功能試驗：以300、600、1200.mg/（kg·BW）劑量組連續(xù)灌胃小鼠30天，另設(shè)玫瑰花組和蒸餾水陰性對照組，測定臟器/體重比值，小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（耳腫脹法），小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)（Jerne改良玻片法）以及NK細(xì)胞活性（乳酸脫氫酶測定法），以考察其增強免疫力的作用。結(jié)果：急性經(jīng)口毒性實驗中，小鼠一般表現(xiàn)和行為均未見異常且無死亡;三項遺傳試驗結(jié)果均為陰性，未見遺傳毒性;增強免疫力實驗中，與陰性對照組相比，玫瑰花復(fù)合煎劑300、600、1200.mg/（kg·BW）各劑量組的小鼠左右耳片重量差值、溶血空斑數(shù)有顯著性差異（P<0.05）;600、.1200.mg/（kg·BW）劑量組小鼠NK細(xì)胞活性均有顯著性差異（P<0.05）;玫瑰花組小鼠左右耳片重量差值、溶血空斑數(shù)與陰性對照組相比均有顯著性差異（P<0.05）。結(jié)論：玫瑰花復(fù)合煎劑無明顯的急性毒性反應(yīng)，屬無毒級，且無遺傳毒性;玫瑰花與黃精組成配伍聯(lián)合應(yīng)用其增強免疫功能較玫瑰花單方更加顯著。

[關(guān)鍵詞]玫瑰花;黃精;急性毒性;遺傳毒性;免疫

[中圖分類號]R392.11.

[文獻標(biāo)識碼]A.

[文章編號]2096-5249（2022）03-0184-03

玫瑰花是薔薇科植物玫瑰的干燥花蕾[1]，《本草綱目拾遺》載：“玫瑰花活血、行血、健脾降火、理氣調(diào)經(jīng)、滋補養(yǎng)顏”。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，玫瑰花甘、微苦，具有行氣解郁、止痛和血及活血散瘀等功效，常用于肝胃氣痛、月經(jīng)不調(diào)，跌撲傷痛等，常被用來當(dāng)作茶飲。

黃精為百合科黃精屬（Liliaceae）的干燥根莖，主要包括滇黃精Polygonatum kingianum Coll.Et Hemsl、黃精Polygonatum sibiricum Red或多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua[2]。主要化學(xué)成分有多糖、皂苷、蒽醌等[3]。藥典記載，黃精性平、味甘，具有補氣養(yǎng)陰、益腎健脾的功效。李時珍引《神仙草芝經(jīng)》云：“黃精寬中益氣，使五臟調(diào)和，肌肉充盈，骨髓堅強，其力倍增，多年不老，顏色明顯，發(fā)白更黑，齒落更生”。我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，黃精可長期用于治療脾胃虛弱、精血不足、腎虛虧損、倦乏無力等，自古以來就被認(rèn)為是補益類中藥中的上品[4]。

玫瑰花在免疫方面的試驗研究較少，本研究主要探討以玫瑰花及玫瑰花配伍黃精后對小鼠免疫指標(biāo)的影響，同時對其毒理學(xué)試驗進行評價，為臨床應(yīng)用提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1材料與對象

1.1實驗動物

昆明種小鼠420只，選用蘇州大學(xué)昭衍新藥研究中心培育的SPF級小鼠（合格證編號201900963）。雌雄各半，體重18～22g。

1.2受試物與試劑

玫瑰花組：取玫瑰花300g，加入12倍量水提取2次，每次2h，濾過，合并2次提取液減壓濃縮至1g/mL。

玫瑰花復(fù)合煎劑：取玫瑰花、黃精各300g分別加入12倍量水提取2次，每次2h，濾過，合并2次提取液減壓濃縮至1g/mL。實驗時用蒸餾水配制，冷藏保存。

1.3主要儀器和試劑

100μL微量注射器、電子分析天平、手術(shù)器械、723分光光度儀、RPMI1640玻片架、顯微鏡、離心機、二氧化碳培養(yǎng)箱、SRBC、Hank’s液、DNFB、丙酮、乳酸脫氫酶、恒溫水浴等。

1.4實驗方法

急性經(jīng)口毒性實驗：采用最大耐受劑量法，設(shè)玫瑰花復(fù)合煎劑15000mg（/kg·BW）一個劑量組，小鼠20只，雌雄各半，隨機分為給藥組和對照組，均按20mL（/kg·BW）經(jīng)口灌胃。灌胃前動物禁食12h，不限飲水。對照組灌胃等體積的生理鹽水，期間試驗小鼠正常飲食和飲水。連續(xù)觀察一周，觀察外表體征、精神狀態(tài)等，每天記錄小鼠的體重、飲水量、進食量的變化以及動物的中毒表現(xiàn)以及是否有死亡現(xiàn)象發(fā)生，實驗結(jié)束后處死動物做大體解剖[5]。

遺傳毒性試驗：（1）Ames試驗。將受試物高壓滅菌后置于4°C冰箱保存，試驗前用無菌去離子水等比例進行稀釋，設(shè)立濃度為8、40、200、1000、5000μg/皿5個劑量組，采用平板摻入法，在加與不加體外活化系統(tǒng)（S9混合液）的條件下進行。試驗同時設(shè)立溶劑對照組、未處理對照組（自發(fā)回變組）和陽性對照組。若受試物的回變菌落數(shù)高于自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍以上，且具有一定的劑量反應(yīng)關(guān)系，則表明細(xì)菌回復(fù)突變試驗結(jié)果為陽性，整個試驗在相同的條件下重復(fù)進行一次。（2）小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗。小鼠雌雄各半，隨機分成5組（n=10），即2.5、5.0、10.0g（/kg·BW）劑量組，陽性對照組注射環(huán)磷酰胺40mg/kg，陰性對照組灌服等體積蒸餾水。給藥2次，間隔24h，第2次給藥后6h，將動物處死，制骨髓涂片、晾干、甲醇固定、Giemsa染色。鏡檢PCE，計算微核率。（3）小鼠精子畸形試驗。雄性小鼠隨機分成5組（n=10），即2.5、5.0、10.0g（/kg·BW）劑量組，陰性對照組和環(huán)磷酰胺陽性對照組（40mg/kg）。按20mL（/kg·BW）容量灌胃5d，繼續(xù)喂養(yǎng)1個月，35d后處死，取出其兩側(cè)睪丸、附睪，放入生理鹽水離心管中，制成精子懸液，過濾、濾液涂片，用體積分?jǐn)?shù)1%的伊紅染色，晾干，油鏡下檢查精子形態(tài)，記錄畸形精子數(shù)，計算精子畸形率。

1.5增強免疫力實驗

劑量選擇：玫瑰花復(fù)合煎劑設(shè)300、600、1200mg（/kg·BW）三個劑量組，另設(shè)玫瑰花組和蒸餾水陰性對照組。各組小鼠每日灌胃量均為0.2mL/10（g·BW），連續(xù)灌胃30d。

脾臟/體重比值、胸腺/體重比值：試驗結(jié)束時稱量動物體重，于處死動物后，取出脾臟和胸腺，并進行稱重，計算脾臟/體重比值、胸腺/體重比值。

二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠DTH試驗（耳腫脹法）：在小鼠右耳兩面均勻涂抹DNFB溶液，以此進行攻擊。攻擊后24h頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，按要求進行稱重。用左右耳重量之差表示DTH的程度。方法參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003年版）試驗方法進行[7]。

抗體生成試驗（Jerne改良玻片法）：脫纖維綿羊紅細(xì)胞免疫5d處死動物，取脾臟制成脾細(xì)胞懸液，將表層培養(yǎng)基加熱溶解后，放45～50°C水浴保溫，與等量中性2倍的Hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5mL，向管內(nèi)加入50μL10%SRBC，25μL脾細(xì)胞懸液，迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，待凝固后，放入二氧化碳培養(yǎng)箱1.5h，用SA緩沖液稀釋的補體

（1∶8）加入到片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)溫育1.5h，計數(shù)溶血空斑數(shù)。

NK細(xì)胞活性測定（乳酸脫氫酶LDH測定法）：頸椎脫臼處死小鼠，制備濃度為2×107個/mL的脾細(xì)胞懸液。將脾細(xì)胞和靶細(xì)胞YAC-1細(xì)胞各100μL分置于96孔培養(yǎng)板中，參考保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范（2003年版）操作，在490nm處測定OD值，計算NK細(xì)胞活性率。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS21.0軟件進行處理。計量資—料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料用[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1急性經(jīng)口毒性實驗

給予玫瑰花復(fù)合煎劑后，小鼠一般表現(xiàn)和行為均未見異常，觀察期內(nèi)未見動物死亡，灌胃最大給藥劑量連續(xù)觀察7d小鼠外觀、精神等均無異常。對照組和給藥組平日進食量和飲水量無顯著差異，未出現(xiàn)毒性反應(yīng)。實驗結(jié)束時處死動物，大體解剖肉眼觀察未見病理異常改變。說明玫瑰花復(fù)合煎劑對小鼠急性經(jīng)口MTD值均大于15000mg（/kg·BW），按急性毒性分級，該受試物屬于無毒級。

2.2遺傳毒性試驗結(jié)果

對TA97、TA98、TA100和TA102試驗菌株，不同濃度受試物在加和不加S9條件下的回變菌落數(shù)與陰性對照組無顯著差異（P>0.05），而陽性對照組回變菌落數(shù)均高于陰性對照組回變菌落數(shù)2倍以上（P<0.05）。玫瑰花復(fù)合煎劑細(xì)菌回復(fù)突變試驗檢測結(jié)果為陰性，重復(fù)試驗仍得出相同結(jié)果。

與陰性對照組比較，玫瑰花復(fù)合煎劑各劑量組微核率無顯著性差異（P>0.05）;與陰性對照組比較，環(huán)磷酰胺陽性對照組微核率有顯著性差異（P<0.01）。

與陰性對照組比較，玫瑰花復(fù)合煎劑各劑量組小鼠精子畸形率無顯著性差異（P>0.05）;與陰性對照組比較，環(huán)磷酰胺陽性對照組小鼠精子畸形率有顯著性差異（P<0.01）。

2.3免疫功能試驗結(jié)果

連續(xù)灌胃30d后，玫瑰花組、玫瑰花復(fù)合煎劑300、600、1200mg（/kg·BW）三個劑量組動物的脾臟/體重比值、胸腺/體重比值與陰性對照組相比，均無顯著性差異（P>0.05），見表1。

連續(xù)灌胃30d后，與陰性對照組相比，玫瑰花復(fù)合煎劑三個劑量組動物的左右耳片重量差值，300、600、1200mg（/kg·BW）三個劑量組動物均有顯著性差異（P<0.05）。玫瑰花片組左右耳片重量差值也明顯增加（P<0.05），見表2。

連續(xù)灌胃30d后，玫瑰花復(fù)合煎劑三個劑量組動物的溶血空斑數(shù)與陰性對照組相比，300、600、1200mg（/kg·BW）三個劑量組動物均有顯著性差異（P<0.05）。玫瑰花片組溶血空斑數(shù)也明顯增加（P<0.05），見表3。

連續(xù)灌胃30d后，玫瑰花復(fù)合煎劑三個劑量組、玫瑰花組動物的NK細(xì)胞活性與陰性對照組相比均有不同程度的增加，玫瑰花復(fù)合煎劑600、1200mg（/kg·BW）劑量組有顯著性差異（P<0.05），見表4。

3結(jié)論

免疫是機體識別和排除抗原性異物，維護自身生理平衡和穩(wěn)定的一種功能。人體的免疫系統(tǒng)由免疫器官（如胸腺、脾臟等）、免疫細(xì)胞（如吞噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等）和免疫分子（如補體、細(xì)胞因子等）所組成，通過先天性免疫（非特異性免疫）和獲得性免疫（特異性免疫）來執(zhí)行，發(fā)揮免疫防御、免疫穩(wěn)定和免疫監(jiān)視三大功能。

玫瑰花含有黃酮類、多酚、多糖等多種化學(xué)成份，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗癌抗菌、降血脂和預(yù)防心臟病等生理活性[8]。黃精在臨床中是重要的扶正固本類中藥，常被用于補益脾腎、填精補腎，增強機體免疫的功效。黃精多糖作為黃精中主要的有效成分，具有多種生物活性[9-10]，沈建利等[11]以黃精多糖（100、400、800mg/kg）灌胃環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制模型小鼠，免疫抑制小鼠的臟器指數(shù)、血清溶血素水平及吞噬指數(shù)顯著提高（P<0.05）;表明黃精多糖可增強機體免疫力。葉紹凡[12]的研究顯示，給予黃精多糖，可顯著提高運動小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、巨噬細(xì)胞吞噬率、吞噬指數(shù)，與單純運動組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，且作用呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。提示黃精多糖可提高長期力竭訓(xùn)練小鼠的免疫能力，具有顯著免疫增強效應(yīng)。

本研究實驗結(jié)果表明玫瑰花、黃精復(fù)合煎劑連續(xù)灌胃小鼠30d后，能顯著提高小鼠的遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)、溶血空斑數(shù)以及NK細(xì)胞活性。可初步判定，玫瑰花及黃精配伍可增強動物細(xì)胞免疫、體液免疫和NK細(xì)胞活性，具有增強免疫力的功能，且功效較玫瑰花單用更加顯著。本實驗毒理結(jié)果表明，玫瑰花與黃精復(fù)合煎劑對小鼠急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果MTD值>15000mg（/kg·BW），屬無毒級，小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗、Ames試驗均未見遺傳毒性，為用藥劑量及安全性提供了參考。