劉利娟

（鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鶴壁 458030）

母乳是嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育最理想的食物，牛乳因營(yíng)養(yǎng)成分與母乳十分接近，越來(lái)越成為人們不可或缺的食物。牛乳中蛋白質(zhì)主要由乳清蛋白和酪蛋白兩大類蛋白質(zhì)構(gòu)成[1]，其中，酪蛋白占牛乳總蛋白質(zhì)含量約80%，乳清蛋白占牛乳總蛋白量約20%，通常通過(guò)調(diào)節(jié)牛乳pH 為4.6 時(shí)，利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)沉淀原理，將乳清蛋白與酪蛋白分離，上清液即為乳清蛋白[2]。乳清蛋白含有多種活性物質(zhì)，包含α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳鐵蛋白、免疫球蛋白等[3]，能夠?yàn)槿梭w提供優(yōu)質(zhì)蛋白和活性肽。α-乳白蛋白可以有效的防止癌變，具有抗腫瘤的效果；它還可與鈣相結(jié)合，是鈣主要補(bǔ)充劑，可以促進(jìn)兒童的鈣吸收以及防止老年人出現(xiàn)骨質(zhì)疏松的癥狀；同時(shí)，含高濃度胱氨酸和色氨酸，易于嬰幼兒消化吸收，所以，嬰幼兒配方奶粉中通常添加α-乳白蛋白，使?fàn)I養(yǎng)成分更加接近母乳[4]。β-乳球蛋白能夠與脂肪酸和脂溶性維生素相結(jié)合，同時(shí)還能夠加快其在機(jī)體內(nèi)吸收的速度。乳鐵蛋白被視為紅蛋白，它是可以結(jié)合鐵的功能性糖蛋白，含有氨基和羧基，能夠與鐵可逆結(jié)合從而促進(jìn)鐵吸收；乳鐵蛋白能夠調(diào)節(jié)人體鐵質(zhì)轉(zhuǎn)移，可以促進(jìn)嬰兒骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育。

高效液相色譜法（HPLC）作為測(cè)定食品中蛋白質(zhì)含量的方法已基本成熟且工業(yè)應(yīng)用范圍較廣，但這種方法操作十分繁雜，需要人工手動(dòng)進(jìn)樣，且耗時(shí)較長(zhǎng)；超高效液相色譜（UPLC）色譜柱更短，裝填的填料粒徑更小[5]，常見(jiàn)的為1.7 μm，較小的粒徑使得該色譜柱與常規(guī)高效液相色譜柱（HPLC）比，具有單位長(zhǎng)度內(nèi)更高的塔板數(shù)，從而使樣品達(dá)到更好的分離。高流速的使用加速了分析的速度，同時(shí)也提高了分辨率和靈敏度，因此，本研究意在縮短洗脫時(shí)間，與高效液相色譜法相比實(shí)現(xiàn)在更短的時(shí)間里對(duì)乳及乳制品中乳清蛋白的快速檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

α-乳白蛋白（德國(guó)sigma 公司，純度≥85%）、β-乳球蛋白（德國(guó)sigma 公司，純度≥90%）、乳鐵蛋白（德國(guó)sigma 公司，純度≥95%）、乙腈（can，色譜純，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）、三氟乙酸（TFA，色譜純，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）、鮮牛乳、嬰幼兒配方奶粉。

PB-10 型pH 計(jì)（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、抽濾裝置（北京卓信偉業(yè)科技有限公司）、sigma3K-15 型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)sigma 公司）、超高效液相色譜（上海沃特世科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 UPLC 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH300 ? C18 色譜柱，柱溫38℃；流動(dòng)相A 為0.1%TFA/H2O，流動(dòng)相B 為乙腈+三氟乙酸（1 000:0.5）；進(jìn)樣量為10 μL；流速為0.5 mL/min；波長(zhǎng)為280 nm，分離度4.8 nm。

2.2 樣品前處理

牛乳樣品：取50 mL 鮮牛乳樣品，于20℃溫度下，10 000 r/min 離心20 min，過(guò)濾去除脂肪，清液于-20℃保存，備用。取5 mL 的清液，用1 mol/L 的醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH 至4.6，放置室溫沉淀1 h，然后以10 000 r/min 離心10 min，用移液槍吸取上清液（上下層沉淀為酪蛋白），清液再以10 000 r/min離心，去除雜質(zhì)，0.22 μm 的尼龍膜過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)[5]。

奶粉樣品：稱取嬰兒奶粉100 g，定容至1 000 mL 混勻，制備成均一穩(wěn)定的復(fù)原乳。取50 mL 復(fù)原乳樣品，于20℃溫度下，10 000 r/min 離心20 min，過(guò)濾去除脂肪，清液于-20℃保存，備用。上機(jī)前處理方法同牛乳樣品。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

分別精確稱取α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品20 mg、20 mg 和25 mg 用超純水溶解定容至10 mL，即得母液濃度為2 mg/mL、2 mg/mL 和2.5 mg/mL，將母液保存至-20℃，備用。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜柱及檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

色譜柱通常根據(jù)填料的細(xì)孔直徑和鍵合的烷基鏈長(zhǎng)度的不同分為C4、C8、C18，C4 常用來(lái)分離較大分子量的蛋白，而C8、C18 用來(lái)分離中等大小的蛋白，通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)C18色譜柱對(duì)于樣品的保留峰型較好，故本實(shí)驗(yàn)選用C18 來(lái)分離乳清蛋白，并且分別選用了ACQUITY UPLC BEH 色譜柱粒徑為300 ? 和150 ? 進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)表明粒徑為300 ? 的色譜柱對(duì)樣品的保留值較高。

檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇中，實(shí)驗(yàn)分別在220 nm、250 nm、280 nm處都有吸收峰，250 nm 和280 nm 處雜峰均較少，但是標(biāo)準(zhǔn)品在250 nm 處出現(xiàn)雜峰，容易對(duì)樣品的檢測(cè)產(chǎn)生干擾，且峰形不夠尖銳。而在280 nm 處，響應(yīng)值最高，靈敏度也最高，故實(shí)驗(yàn)方法最終選擇280 nm 的波長(zhǎng)。

3.2 洗脫條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)共選擇多種洗脫條件，最終選擇出較好的洗脫梯度，整個(gè)洗脫時(shí)間為9 min，流速為0.5 mL/min，0 min～3 min 洗脫相A 由61%～59%，3 min～5 min洗脫相A由59%～54%，5 min～7 min 洗脫相A 由54%～15%，7 min～9min 洗脫相A 由15%～61%。在這種條件下混標(biāo)得到了基本的分離，且樣品在此條件下分離度也十分良好，實(shí)現(xiàn)了更快速的檢測(cè)。具體分離情況如圖1、圖2 所示。

圖1 經(jīng)優(yōu)化后的乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 經(jīng)優(yōu)化后的奶粉樣品色譜圖

圖1 為乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，三種蛋白質(zhì)能夠在4 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離，且分離度較好，說(shuō)明該洗脫條件比較好，由圖2 根據(jù)出峰時(shí)間可以確定出α-乳白蛋白、β-乳球蛋白，可以看出奶粉樣品中沒(méi)有檢測(cè)出乳鐵蛋白，分析原因有兩個(gè)，一是這批奶粉中的乳鐵蛋白含量很低，含量已經(jīng)低至色譜儀的檢出限以下；二是由于超高效液相色譜的檢測(cè)速度太快，分離度不好，導(dǎo)致乳鐵蛋白未檢測(cè)出。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品母液分別稀釋成0.5 mg/mL、1 mg/mL、1.5 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL；β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品母液稀釋為0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL；乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品母液稀釋為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL。按照上述2.1 小節(jié)的色譜條件、3.2 小節(jié)的洗脫條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)乳清蛋白進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法繪制曲線，求得α-乳白蛋白回歸方程為y=1 158 781.813 4x-37 443.707 8，線性范圍為0.5 mg/mL～4 mg/mL，檢出限為0.005 mg/mL；β-乳球蛋白回歸方程為y=2 147 168.176 5x+288 433.480 4，線性范圍為0.125 mg/mL～2 mg/mL，檢出限為0.002 mg/mL；乳鐵蛋白回歸方程為y=1 088 688.819 7x+33 176.763 7，線性范圍為0.25 mg/mL～4 mg/mL，檢出限為0.005 mg/mL；三種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的回歸方程相關(guān)系數(shù)均大于0.999 4，線性回歸性良好。

3.4 精密度實(shí)驗(yàn)

在2.2 小節(jié)的樣品前處理的條件下處理樣品，根據(jù)3.2 小節(jié)的洗脫條件進(jìn)樣10 μL，每個(gè)樣品連續(xù)進(jìn)樣5 次，求得樣品中各乳清蛋白的含量，并求得平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。

如表1 所示，α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳鐵蛋白檢測(cè)的RSD 值均小于2%，滿足實(shí)驗(yàn)的要求，實(shí)驗(yàn)的精密度良好。嬰兒奶粉中的α-乳白蛋白含量明顯高于牛乳，且含量同嬰幼兒奶粉中的配方含量一致。但β-乳球蛋白的含量相對(duì)較低，這是由于奶粉在加工過(guò)程中損失掉一部分蛋白，且該奶粉中沒(méi)有特別添加β-乳球蛋白。牛乳中測(cè)得的乳鐵蛋白含量較低，可能是由于品種、批次和季節(jié)的原因?qū)е潞科停谭壑泻恳训椭翙z出限以下，證實(shí)該嬰幼兒配方奶粉沒(méi)有特別添加乳鐵蛋白或者添加量較少，不符合生產(chǎn)要求。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)（n=5）

3.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

平行稱取牛乳樣品和奶粉樣品各3 份，分別加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)按照2.2 小節(jié)的樣品前處理方法、2.1 小節(jié)的色譜條件、3.2 小節(jié)的洗脫條件，上機(jī)檢測(cè)，求得樣品的回收率和RSD 值。

如表2 所示，牛乳和奶粉中的回收率均在91.31%～103.49%之間，測(cè)得α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳鐵蛋白的RSD 值分別為0.696%、2.494%、4.699%、4.851%和3.872%，均小于5%，說(shuō)明該方法的前處理優(yōu)化條件良好，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性良好，實(shí)驗(yàn)可靠。

表2 加標(biāo)回收率(n=3)

4 結(jié)論

本研究采用超高效液相色譜，使用ACQUITY UPLC BEH300 ? C18 色譜柱測(cè)定乳清蛋白含量，以0.1%TFA/H2O，乙腈+三氟乙酸（1 000:0.5）為流動(dòng)相，流速為0.5 mL/min，進(jìn)行梯度洗脫，在280 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)。通過(guò)多次優(yōu)化前處理方法、流動(dòng)相洗脫程序，在9 分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)了完全分離，具有操作簡(jiǎn)單、無(wú)需人工操作、可實(shí)現(xiàn)連續(xù)進(jìn)樣、分離時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。該方法的精密度實(shí)驗(yàn)的RSD 值均在5%以下，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性良好，鮮牛乳和嬰幼兒奶粉的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳鐵蛋白的加標(biāo)回收率均在91.31%～103.49%之間，回收率較高，方法可靠準(zhǔn)確，該方法的建立為企業(yè)提供了更快速、更微量的測(cè)定乳清蛋白的方法。