超高效液相色譜法快速測(cè)定飲料中赤蘚紅含量

謝 賽

(北京市東城區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 100009)

為使食品保持或增加色澤，增進(jìn)食欲，吸引消費(fèi)者目光，生產(chǎn)廠家往往向食品中添加一些天然色素或合成色素。合成色素是以苯、甲苯、萘等化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過(guò)磺化、硝化、鹵化、偶氮化等有機(jī)反應(yīng)制成[1]。合成色素具有價(jià)格低廉、穩(wěn)定性好、不易褪色等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品加工行業(yè)中，但合成色素有一定毒性，過(guò)多食用會(huì)危害人體健康，甚至產(chǎn)生致癌性和致突變性等危害[2]。

赤蘚紅(Erythrosine，E127)呈紅色或紅褐色，為非偶氮類人工合成著色劑，相較于大多數(shù)偶氮類合成色素，其具有化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上的差異[3]。國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)、歐盟、美國(guó)、中國(guó)、日本和韓國(guó)等都允許在飲料中使用赤蘚紅[4]。其檢測(cè)方法有液相色譜法[5]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[6]、免疫PCR法[7]、示波極譜法[8]等，其中有關(guān)高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定赤蘚紅的研究較多[9-12]，但是樣品的檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，除去前處理時(shí)間，每件樣品上機(jī)測(cè)定時(shí)間約需30 min，且有機(jī)試劑消耗量較大。表面增強(qiáng)拉曼光譜法適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)但檢出限較高，免疫PCR法的回收率范圍較寬，示波極譜法為早期研究方法但目前研究較少。超高效液相色譜(UPLC)是傳統(tǒng)高效液相色譜技術(shù)的升級(jí)和提高，與傳統(tǒng)的高效液相色譜相比具有分離度好、檢測(cè)速度快和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可以有效縮減檢測(cè)時(shí)間與節(jié)省試劑用量，高效和環(huán)保優(yōu)勢(shì)明顯[13]。

在色素前處理方法中，目前有關(guān)含赤蘚紅樣品的前處理方法有液—液萃取法[14]和固相萃取法[15-16]。GB 5009.35—2016對(duì)含赤蘚紅樣品單獨(dú)標(biāo)明了液—液萃取法的前處理方法，其提取步驟多、試劑多，操作繁瑣，且加標(biāo)回收也有較大損失，不適合大批量樣品的處理[11]。研究擬探求飲料樣品中赤蘚紅色素的簡(jiǎn)便前處理方法，并采用超高效液相色譜法(UPLC)縮短儀器檢測(cè)時(shí)間，提高分離度、靈敏度，建立快速測(cè)定飲料中赤蘚紅色素的方法，旨在為飲料中赤蘚紅色素的大批量準(zhǔn)確檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

超高效液相色譜儀：H-Class型，美國(guó)Waters公司；

超純水處理儀：Milli-Q型，法國(guó)Millipore公司；

電子天平：MCE225S型，德國(guó)Sartorius公司；

pH計(jì)：PH211型，意大利Hanna公司。

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈：色譜級(jí)，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；

乙酸銨：分析級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

乙酸、氨水：色譜級(jí)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液：GBW(E)100191-19002，103 μg/mL，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)530 nm，流動(dòng)相為乙腈—乙酸銨(0.02 mol/L，pH 6.25)，以保留時(shí)間和光譜圖定性，以峰面積定量。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)系列配制 分別準(zhǔn)確吸取質(zhì)量濃度為103 μg/mL 的赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mL，至5個(gè)10 mL潔凈容量瓶中，用超純水定容得到赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度分別為1.03，2.06，3.09，4.12，5.15 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 樣品前處理 移取適量飲料樣品，加入氨水調(diào)節(jié)pH值至7.00，以5%乙腈溶液定容，超聲提取30 min，經(jīng)0.20 μm濾膜過(guò)濾，供超高效液相色譜儀測(cè)定。

1.2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 將2.06 mg/L赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器在210～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

1.2.5 流動(dòng)相的選擇 調(diào)整流動(dòng)相極性，有助于促進(jìn)化合物在色譜柱中的吸附洗脫能力強(qiáng)弱，同時(shí)改善峰形。原先使用甲醇和0.02 mol/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相，但是赤蘚紅色譜峰響應(yīng)較低，峰形較寬，出峰時(shí)間較晚。采用乙腈和0.02 mol/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相，以冰乙酸調(diào)節(jié)乙酸銨溶液pH為6.25。

1.2.6 洗脫梯度 梯度條件見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase gradient elution conditions

1.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為5 μL。赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度分別為1.03，2.06，3.09，4.12，5.15 mg/L，以色譜峰的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，以赤蘚紅含量(x)為橫坐標(biāo)，繪制赤蘚紅的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 使用Excel錄入檢測(cè)結(jié)果，繪制統(tǒng)計(jì)圖表；應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)(雙尾)比較方法差異，以P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

由圖1可知，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為530 nm時(shí)，響應(yīng)值出現(xiàn)最大值為0.07 AU，因此選擇530 nm作為赤蘚紅的檢測(cè)波長(zhǎng)，與劉亞梅等[17]的結(jié)果一致。

圖1 赤蘚紅光譜圖Figure 1 Spectrogram of erythrosine

2.2 流動(dòng)相的選擇

由圖2可知，赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液的一針進(jìn)樣檢測(cè)時(shí)間為8 min，赤蘚紅出峰時(shí)間適宜，保留時(shí)間為4.371 min，色譜峰形對(duì)稱，基線平穩(wěn)，適用于檢測(cè)分析。

圖2 赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Figure 2 Chromatograms of standard solutions of erythrosine

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

由圖3可知，赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線一階線性回歸方程為y=69.072×103x+12.61×103，相關(guān)回歸系數(shù)R2=0.999 5，結(jié)果表明在1.03～5.15 mg/L范圍內(nèi)二者線性關(guān)系良好。方法定性檢出限(LOD)為0.010 3 mg/L，定量檢出限(LOQ)為0.030 9 mg/L。

圖3 赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 3 Standard curve of erythrosine

2.4 樣品超聲提取時(shí)間的選擇

取市售無(wú)赤蘚紅的飲料樣品(經(jīng)FAPAS檢測(cè)認(rèn)證的陰性樣品)，加入赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用純水溶解定容檢測(cè)，樣品中加標(biāo)赤蘚紅不能檢出。這是因?yàn)橛眉兯芙鈺r(shí)，赤蘚紅色素易吸附于管壁，加入一定比例的有機(jī)相乙腈后很容易將赤蘚紅溶解下來(lái)，且乙腈也是流動(dòng)相的一部分，適宜作溶劑。而且上機(jī)前采用的注射式過(guò)濾器避免使用尼龍濾膜，因?yàn)槠浠瘜W(xué)成分為聚酰胺，會(huì)吸附赤蘚紅而造成損失。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加標(biāo)樣品中加入微量氨水(pH值5.56)，5%乙腈水溶液溶解，可檢測(cè)到赤蘚紅的加標(biāo)回收，但回收率較低。由圖4可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，赤蘚紅加標(biāo)回收率先上升后緩慢下降再急速下降，當(dāng)超聲提取時(shí)間為30 min時(shí)，回收率達(dá)到最大值62%。因此，確定樣品超聲提取的最適時(shí)間為30 min。

圖4 超聲提取時(shí)間對(duì)赤蘚紅加標(biāo)回收率的影響Figure 4 Effect of ultrasonic extraction time on the spiked recovery of erythrosine

2.5 樣品pH值的選擇

由圖5可知，隨著樣液pH值的增加，赤蘚紅加標(biāo)回收率顯著增大；當(dāng)樣品pH值為7.00時(shí)，加標(biāo)回收率達(dá)到100.7%，之后加標(biāo)回收率趨于平緩；當(dāng)氨水調(diào)節(jié)樣品pH至堿性(8.00，9.00)時(shí)，加標(biāo)回收率略增，然而由于飲料由酸性變堿性，樣品顏色發(fā)生較大改變(由綠色變?yōu)樗{(lán)色)，可能是由于pH值的變化造成了飲料中其他成分或色素色調(diào)的變化。最終確定樣品pH值以氨水調(diào)至7.00為宜。

圖5 樣品pH值對(duì)加標(biāo)回收率的影響Figure 5 Effect of pH of sample on the spike recovery

2.6 回收率和精密度

由表2可知，試驗(yàn)精密度為0.4%～3.2%，回收率為92%～109%。

表2 精密度和回收率測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of precision and recovery

2.7 樣品分析

應(yīng)用試驗(yàn)建立的赤蘚紅含量測(cè)定方法對(duì)市售的6份飲料進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)購(gòu)的1份飲料樣品中含有赤蘚紅(圖6)，含量為0.034 6 g/kg，未超過(guò)GB 2760-2014規(guī)定的限量值(0.05 g/kg)，其他飲料未檢出。同時(shí)采用GB 5009.35—2016進(jìn)行檢測(cè)，以配對(duì)t檢驗(yàn)(雙尾)法比較，結(jié)果表明兩種方法無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖6 市售飲料中赤蘚紅實(shí)測(cè)色譜圖Figure 6 Chromatogram of erythrosine in a commercially available beverage

3 結(jié)論

優(yōu)化了飲料中合成著色劑赤蘚紅色素的前處理方法，建立了快速測(cè)定赤蘚紅含量的超高效液相色譜法。結(jié)果表明，飲料樣品經(jīng)氨水調(diào)節(jié)pH至7.00，以5%乙腈水溶液定容，再超聲提取30 min后，過(guò)0.2 μm濾膜，可直接經(jīng)UPLC進(jìn)行測(cè)定，赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)>0.999，加標(biāo)回收率為92%～109%，RSD<3.2%，定性檢出限為0.01 mg/L，定量檢出限為0.03 mg/L。該方法準(zhǔn)確性高、靈敏度高、重現(xiàn)性好。解決了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中赤蘚紅色素需要經(jīng)過(guò)液—液萃取前處理方法復(fù)雜的問(wèn)題，并且不使用固相萃取柱，最大程度地簡(jiǎn)化了樣品提取步驟，省時(shí)省力，提高了加標(biāo)回收率，便于大批量飲料樣品中赤蘚紅的處理檢測(cè)，適用于食品安全法用于日常市場(chǎng)監(jiān)督檢測(cè)。后續(xù)將使用超高效液相色譜法研究飲料中多種食品合成著色劑同時(shí)測(cè)定的檢測(cè)方法，以及對(duì)于復(fù)雜樣品基質(zhì)中赤蘚紅色素前處理方法的適用性研究。