神經(jīng)生長因子與被動運(yùn)動對失神經(jīng)大鼠骨代謝指標(biāo)的影響

王楓 趙立奇 姬宇輝 蔣維海 張佳月

[摘要]目的探究神經(jīng)生長因子與被動運(yùn)動對失神經(jīng)大鼠骨代謝指標(biāo)的影響。方法采用隨機(jī)抽簽法將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（SHAM組）、去神經(jīng)組（DN組）、神經(jīng)生長因子組（NGF組）、被動運(yùn)動組（PM組）、神經(jīng)生長因子及被動運(yùn)動聯(lián)合組（NGF+PM組）共5組，SHAM組無需將坐骨神經(jīng)及股神經(jīng)切除，其他4組將大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)及股神經(jīng)切除，建立SD大鼠右側(cè)后肢去神經(jīng)模型，給予被動運(yùn)動及外源生長因子干預(yù)，比較各組大鼠血清骨鈣素（BGP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）水平。結(jié)果術(shù)后2周大鼠體重均有所增加，術(shù)后3周DN組、NGF+PM組、SHAM組體重均明顯高于PM組與NGF組，術(shù)后4周DN組最輕，SHAM組最重，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;DN組大鼠血清BGP明顯低于SHAM組，血清TRACP水平高于SHAM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;NGF組、NGF+PM組血清BGP水平高于DN組，血清TRACP 水平低于DN組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;PM組血清TRACP水平明顯低于DN組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論大鼠下肢喪失神經(jīng)支配后會出現(xiàn)肌肉萎縮及骨代謝破壞，給予神經(jīng)生長因子及被動運(yùn)動干預(yù)，有利于改善血清BGP與TRACP水平，預(yù)防骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞]大鼠;神經(jīng)生長因子;被動運(yùn)動;骨代謝指標(biāo);血清骨鈣素;血清抗酒石酸酸性磷酸酶

[中圖分類號]R580??? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A??? [文章編號]2095-0616（2022）01-0035-04

Effects of nerve growth factor and passive movement on bone metabolic indexes in denervated rats

WANG Feng??? ZHAO Liqi??? JI Yuhui??? JIANG Weihai??? ZHANG Jiayue

Department of Orthopedics，Shenzhen Samii Medical Center，Guangdong，Shenzhen 518118，China

[Abstract]Objective To investigate the effects of nerve growth factor （NGF）and passive movement （PM）on bone metabolic indexes in denervated （DN）rats. Methods A total of 60 rats were randomly divided into 5 groups，the sham-operated group （SHAM group），the DN group，the NGF group，the PM group，and the combined NGF and PM group （NGF+PM group）. The rats in the SHAM group were not required to remove the sciatic nerve and femoral nerve，while rats in the other 4 groups underwent the removal of the right sciatic nerve and femoral nerve to establish the right hindlimb DN model of SD rats，which were intervened with PM and exogenous growth factors. The levels of serum osteocalcin （BGP）and tartrate-resistant acid phosphatase （TRACP）were compared among these groups. Results The body weight of the rats increased at 2 weeks after the operation，and the body weight of the DN group，NGF+PM group，and SHAM group was significantly higher than that of PM group and NGF group at 3 weeks after operation;4 weeks after the operation，the DN group was the lightest and the SHAM group was the heaviest，and the differences were statistically significant （P<0.05）;The serum BGP level of rats in the DN group was significantly lower than that in the SHAM group，and the serum TRACP level was higher than that in the SHAM group，with statistically significant differences （P<0.05）. The serum BGP level in the NGF group and NGF+PM group were higher than that in DN group，and the level of serum TRACP were lower than that in the DN group，with statistically significant differences（P<0.05）. The serum TRACP level in the PM group was significantly lower than that in the DN group，with statistically significant differences （P<0.05）. Conclusion The denervation in the lower limbs of rats will lead to muscle atrophy and destruction of the balance of bone metabolism，and the intervention of NGF and PM is helpful to improve the serum BGP and TRACP levels and prevent the occurrence of osteoporosis.

[Key words]Rats;Nerve growth factor;Passive movement;Bone metabolism indexes;Serum BGP;Serum TRACP

作為臨床常見的骨科疾病，廢用性骨質(zhì)疏松主要指肢體運(yùn)動功能障礙或受限導(dǎo)致骨量減少進(jìn)而產(chǎn)生的骨質(zhì)疏松，與長時間缺乏運(yùn)動鍛煉密切相關(guān)。尤其是處于癱瘓臥床、肢體活動功能受限的情況下，患者飲食量減少，營養(yǎng)物質(zhì)攝入不足，更易引起廢用性骨質(zhì)疏松[1]。目前，臨床對于廢用性骨質(zhì)疏松尚無特效療法，主要采用電刺激及脈沖電磁場治療，有一定限制，且無法直接對癱瘓部位產(chǎn)生作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)生長因子對成骨細(xì)胞活性具有一定的強(qiáng)化作用[2]?；诖?，本研究構(gòu)建廢用性骨質(zhì)疏松大鼠模型，給予神經(jīng)生長因子及被動運(yùn)動干預(yù)，研究結(jié)果報道如下。

1??? 材料與方法

1.1??? 材料

本研究所用的60只普通級雄性SD大鼠均由上海甲干生物科技有限公司提供[生產(chǎn)許可SCXK（滬）2020-0006]，大鼠月齡2個月，重量150～210 g，平均（181.28±10.32）g，隨機(jī)分為5組，每組各12只。采用標(biāo)準(zhǔn)類嚙齒類動物飼料對所有大鼠進(jìn)行喂養(yǎng)。本研究所用鼠神經(jīng)生長因子購自舒泰神（北京）藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字S20060023。動物飼養(yǎng)、造模取材及各項檢測器材均購自南京英瀚斯生物科技有限公司。

1.2??? 方法

1.2.1??? 動物分組??? 所有實驗大鼠均進(jìn)行1周適應(yīng)性喂養(yǎng)，隨機(jī)分為5組，每組各12只。干預(yù)組包括去神經(jīng)組（DN組）、神經(jīng)生長因子組（NGF組）、被動運(yùn)動組（PM組）、神經(jīng)生長因子與被動運(yùn)動聯(lián)合組（NGF+PM組），均將右側(cè)坐骨神經(jīng)及股神經(jīng)切除。假手術(shù)組（SHAM組）無需將神經(jīng)切除，其余手術(shù)方法與干預(yù)組相同。

1.2.2??? 造模??? 嚴(yán)格按照國家動物實驗處置標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行造模。所有大鼠按照30 mg/kg的劑量給予戊巴比妥鈉（上海上藥新亞藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H31021725，規(guī)格：0.1g）腹腔麻醉，手術(shù)位置進(jìn)行脫毛及消毒處理，妥善固定四肢，將大鼠擺為俯臥位，由右側(cè)大腿后外股中部行一縱向切口，使股二頭肌充分暴露，對肌肉實施鈍性分離，對坐骨神經(jīng)進(jìn)行充分游離，切開長度以5 mm為宜，對傷口予以縫合。將大鼠調(diào)整為仰臥位，妥善固定，于腹股溝正中行一切口，使肌肉充分暴露，鈍性分離肌間，股神經(jīng)的切除應(yīng)在腹股溝韌帶下進(jìn)行，切口長度為5 mm，對切口予以沖洗后常規(guī)縫合。術(shù)后給予抗生素治療，時間為3 d，預(yù)防感染。

1.2.3??? 干預(yù)方法??? PM組：采用多關(guān)節(jié)主被動訓(xùn)練儀XY-ZBD-IB（上海涵飛醫(yī)療器械有限公司），設(shè)定好節(jié)奏，對大鼠患肢實施多關(guān)節(jié)幅度屈伸運(yùn)動，訓(xùn)練頻率以600來回/d為宜。NGF組：將外源性神經(jīng)生長因子注射液[舒泰神（北京）藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字S20060023，規(guī)格：30 jig（15 000 U）/瓶]按照2 U/（kg·d）的劑量注射于大鼠右側(cè)腓腸肌。NGF+PM組：實施神經(jīng)生長因子與被動運(yùn)動聯(lián)合干預(yù)，操作方法與PM組、NGF組相同。DN組：給予同等體積生理鹽水注射。SHAM組：不予任何干預(yù)措施。1.2.4&nbsp;?? 取材與指標(biāo)檢測??? 干預(yù)1個月，采用股動脈放血法對大鼠進(jìn)行處死處理，按照預(yù)先編訂的真空采血管對股動脈血進(jìn)行采集，在室溫狀態(tài)下靜置1 h，然后按照3000 r/min的離心速率進(jìn)行離心處理，時間為10 min，然后分離血清。采用GC-1200型γ放射免疫計數(shù)器（上海原子核所日環(huán)光電儀器有限公司）對血清BGP指標(biāo)予以測定，測定方法為放射免疫法，相關(guān)試劑盒購自上海信帆生物科技有限公司。血清抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）指標(biāo)采用邁瑞B(yǎng)S-200全自動生化分析儀（上海同舸醫(yī)療器械有限公司）。

1.3??? 觀察指標(biāo)

觀察大鼠一般情況并記錄5組大鼠在實驗前及術(shù)后1、2、3、4周的體重變化情況，對比5組大鼠血清骨鈣素（BGP）、TRACP指標(biāo)差異。

1.4??? 統(tǒng)計學(xué)方法

2??? 結(jié)果

2.1??? 大鼠一般情況分析

術(shù)后2 d大鼠活動出現(xiàn)減慢趨勢，神情倦怠，進(jìn)食量明顯減少，部分大鼠切口位置有血腫。SHAM組大鼠能夠自由、靈活活動，無右后腿萎縮。DN組大鼠生長速度較其他組延緩，毛色光澤降低，有稀疏、蓬松感，活動能力降低，神情倦怠。NGF組、PM組及NGF+PM組體征與SHAM組類似，身體增長速度較快。實驗期間各組大鼠生長發(fā)育基本正常。

2.2??? 5組大鼠體重變化比較

實驗前各組大鼠體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;術(shù)后2周體重均有所增加，術(shù)后3周DN組、NGF+PM組、SHAM組體重均明顯高于PM組與NGF組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;術(shù)后4周DN組最輕，SHAM組最重，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.3??? 5組大鼠血清BGP、TRACP水平比較

DN組大鼠血清BGP明顯低于SHAM組，血清TRACP水平高于SHAM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;NGF組、NGF+PM組血清BGP水平高于DN組，血清TRACP水平低于DN組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;PM組血清TRACP水平明顯低于DN組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3??? 討論

有文獻(xiàn)報道，骨形成細(xì)胞在骨折愈合中具有NGF表達(dá)，主要表現(xiàn)為成骨細(xì)胞可見NGF受體，其與NGF相結(jié)合會對成骨細(xì)胞活性起到增強(qiáng)作用，提示NGF在骨形成中有一定的參與作用[3-5]。神經(jīng)支配作用會直接影響骨折愈合的效果，神經(jīng)缺損狀態(tài)下，骨折愈合會出現(xiàn)骨痂缺陷。通過NGF干預(yù)能夠?qū)ι窠?jīng)纖維在骨痂生長方面起到引導(dǎo)作用，促進(jìn)骨折修復(fù)效率及修復(fù)速度的提升，是促進(jìn)骨折愈合的有效路徑。既往研究發(fā)現(xiàn)，人重組骨形態(tài)形成蛋白（BMP）可對NGF及其高親和受體表達(dá)進(jìn)行誘導(dǎo)，提示骨形成過程中NGF能夠通過BMP路徑發(fā)揮相應(yīng)的作用[6]。目前臨床關(guān)于NGF治療骨質(zhì)疏松方面的研究相對較少，NGF在骨折愈合中的作用機(jī)制尚不明確，但通過NGF對骨代謝促進(jìn)作用的研究可以考慮將NGF用于骨質(zhì)疏松癥治療，能改善骨質(zhì)疏松。

長期處于制動或臥床狀態(tài)時，因缺乏力學(xué)方面的刺激，容易引起骨質(zhì)疏松，嚴(yán)重者會出現(xiàn)脊髓損傷，導(dǎo)致下肢徹底制動，患者股骨頸及脛骨近端骨密度會受到嚴(yán)重的影響，導(dǎo)致骨量丟失嚴(yán)重[7]。有學(xué)者認(rèn)為早期給予脊髓損傷患者適當(dāng)干預(yù)能夠?qū)∪馕s癥狀起到緩解作用，防止?fàn)繌埩档?、消失，減少骨量的丟失，進(jìn)而對骨質(zhì)疏松起到預(yù)防作用[8-10]。被動訓(xùn)練則是早期干預(yù)最為常見的方法。針對失神經(jīng)支配患者，加強(qiáng)被動運(yùn)動可減緩骨量丟失及骨密度降低。在被動運(yùn)動干預(yù)下，機(jī)械牽應(yīng)力增加，有利于骨細(xì)胞膜礦化增加，對骨組織生長及重建具有一定的刺激作用。不僅如此，被動運(yùn)動還有利于骨皮質(zhì)血流量增加，加快骨組織吸收，使得營養(yǎng)物質(zhì)被充分吸收[11]。本研究在設(shè)計實驗時需要借助被動運(yùn)動使得大鼠下肢關(guān)節(jié)得以屈伸。作為重要骨代謝生化指標(biāo)，BGP主要來源于成骨細(xì)胞，具有較好的穩(wěn)定性，能夠?qū)Ξ惓Ａ谆沂w的形成產(chǎn)生抑制作用，使得骨正常礦化速率處于正常水平，生長軟骨礦化速率也會受到一定的影響[12-13]。BGP指標(biāo)能夠反映成骨細(xì)胞活動狀態(tài)及活性，具有較高的敏感性。TRACP主要分布于巨噬細(xì)胞與破骨細(xì)胞，能夠反映骨吸收情況及破骨細(xì)胞活性[14]。骨吸收得到增強(qiáng)后，骨表面會附著破骨細(xì)胞，經(jīng)過代謝作用會降低TRACP的活性。檢測血清TRACP水平能夠隨時掌握病理狀態(tài)下的骨吸收情況[15]。本研究結(jié)果顯示，去神經(jīng)各組大鼠血清BGP明顯低于SHAM組，血清TRACP水平高于SHAM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。且NGF+PM組血清TRACP水平明顯低于DN組。說明被動運(yùn)動與神經(jīng)生長因子聯(lián)合作用可增強(qiáng)成骨能力。但由于樣本較少、精力有限，本研究可能存在一定偏差，在后續(xù)研究中應(yīng)加大樣本，增加隨訪指標(biāo)，從更多方面探究神經(jīng)生長因子與被動運(yùn)動的優(yōu)勢及作用機(jī)制，為臨床提供更多可靠的依據(jù)。

綜上所述，神經(jīng)生長因子與被動運(yùn)動能夠?qū)κ窠?jīng)大鼠骨代謝指標(biāo)起到改善作用，有利于延緩、抑制廢用性骨質(zhì)疏松的發(fā)生，應(yīng)予以關(guān)注。

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