劉桃源 李昂 王順 李淑艷 潘洪明 衣同輝

[摘要]目的在細胞水平上初步探討Temponn-PE肽抗結(jié)腸癌作用。方法分別用50、100、150、200 μg/ml Temporin-PE肽處理的人結(jié)腸癌LoVo細胞株作為實驗組，以等體積DMEM-H（無血清）處理的LoVo細胞作為對照組。通過CCK-8法和細胞克隆形成實驗檢測不同濃度Temporin-PE肽對LoVo細胞增殖活性的抑制作用，劃痕實驗檢測細胞的遷移能力，DAPI染色檢測LoVo細胞的凋亡形態(tài)學(xué)改變，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。結(jié)果Temporin-PE肽能抑制LoVo細胞的增殖且呈劑量依賴性;劃痕實驗可見細胞遷移率隨Temporin-PE肽濃度增高而逐漸降低;DAPI染色可見各實驗組出現(xiàn)細胞凋亡，Temporin-PE濃度越高細胞形態(tài)變化越明顯;流式細胞術(shù)檢測凋亡趨勢與DAPI染色一致。結(jié)論Temporin-PE肽可抑制LoVo細胞增殖與遷移、促進LoVo細胞的凋亡，呈劑量依賴性。

[關(guān)鍵詞]Temporin-PE肽;結(jié)腸癌;增殖;凋亡

[中圖分類號]R735.3+5??? [文獻標識碼]A??? [文章編號]2095-0616（2022）01-0028-04

Impacts of Temporin-PE peptide on proliferation，migration and apoptosis of LoVo cells of colon cancer

LIU Taoyuan??? LI Ang??? WANG Shun??? LI Shuyan??? PAN Hongming??? YI Tonghui

Qiqihar Medical University，Heilongjiang，Qiqihar 161006，China

[Abstract]Objective To preliminarily investigate the anti-colon cancer effect of Temporin-PE peptide at cell level. Methods LoVo cell strain of human colon cancer treated with Temporin-PE peptide of 50，100，150 and 200 μg/ml was used as the experimental group，and LoVo cell treated with DMEM-H （serum-free）was used as the control groups. CCK-8 method and cell clone formation experiment were used to detect the inhibitory effect of different concentrations of Temporin-PE peptide on the proliferation activity of LoVo cells. Scratch test was used to detect the migration ability，DAPI staining was used to detect the morphological changes of apoptosis of LoVo cells，and flow cytometry was used to detect the apoptosis rate. Results Temporin-PE peptide can inhibit the proliferation of LoVo cells in a dose-dependent manner. Scratch test showed that the migration rate of cells gradually decreased with the increase of Temporin-PE peptide concentration. DAPI staining showed apoptosis in all the experimental groups. The higher the concentration of Temporin-PE，the more obvious the morphological changes of cells. The trend of apoptosis detected by flow cytometry was consistent with DAPI staining. Conclusion Temporin-PE peptide can inhibit the proliferation and migration of LoVo cells and promote the apoptosis of LoVo cells in a dose-dependent manner.

[Key words]Temporin-PE peptide;Colon cancer;Proliferation;Apoptosis

2020年結(jié)腸癌全球新發(fā)病例數(shù)超過190萬例，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第3位和病死率第2位，且在東亞地區(qū)的發(fā)病率最高[1]。目前結(jié)腸癌治療的主要手段是手術(shù)、化療、放療以及靶向治療等[2- 4]，但現(xiàn)有治療手段也存在一定的不足，如部分抗癌藥物不能精準靶向癌細胞導(dǎo)致患者產(chǎn)生不良反應(yīng)。Temporin-PE 肽（F-L-P-I-V-A-K-L-L-S-G-L-L）是從Pelophylax，kl.Esculentus蛙的皮膚分泌物中分離得到的一種生物活性肽。研究發(fā)現(xiàn)，Temporin-PE肽對NCI-H157、U251MG、PC-3、MDA-MB-435s細胞的增殖有抑制作用，表明Temporin-PE肽具有一定的抗腫瘤活性[5]。本實驗擬在體外研究Temporin- PE肽對結(jié)腸癌LoVo細胞增殖、遷移和凋亡的影響，并進一步探討其分子機制，旨在為研發(fā)新的結(jié)腸癌治療策略提供參考。

1??? 材料與方法

1.1??? 材料

結(jié)腸癌細胞株LoVo（中科院上海細胞庫）;Temporin-PE肽（安徽國平藥業(yè)有限公司）;DMEM-H培養(yǎng)基（美國Gibco公司）;胎牛血清（美國Gibco公司）;CCK-8試劑（北京索萊寶有限公司）;吉姆薩染色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;DAPI試劑（北京索萊寶有限公司）;Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit（北京博奧森技術(shù)有限公司）;FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2??? 方法

1.2.1??? 細胞培養(yǎng)與分組??? 人結(jié)腸癌LoVo細胞株用含有10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)基在37℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達70%～80%時，分別用50、100、150、200 μg/ml Temporin-PE處理細胞，以等體積DMEM-H（無血清）處理的細胞為對照組（每個濃度設(shè)3個復(fù)孔）。

1.2.2??? CCK-8法檢測細胞增殖情況??? 采用CCK-8法檢測Temporin-PE肽對LoVo細胞的增殖抑制作用。細胞培養(yǎng)與分組同1.2.1，將LoVo細胞接種于96孔板中培養(yǎng)過夜，實驗組加入相應(yīng)濃度Temporin- PE肽，對照組加入等體積DMEM-H，分別培養(yǎng)12、24 h，測定450 nm處OD值，計算細胞存活率。

1.2.3??? 細胞克隆形成實驗??? 細胞培養(yǎng)與分組同1.2.1，取處于對數(shù)生長期LoVo細胞，按8×10個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h充分貼壁后，分別加入相應(yīng)濃度Temporin-PE肽。處理24 h后棄舊培養(yǎng)基，用含10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1周后，PBS洗滌，吉姆薩染液染色，計算各組細胞克隆形成數(shù)。

1.2.4??? 劃痕實驗??? 細胞培養(yǎng)與分組同1.2.1，取處于對數(shù)生長期LoVo細胞，按3×10個/孔接種于12孔板，培養(yǎng)過夜。用200 μl槍頭進行劃痕，PBS洗滌2次，分別加入相應(yīng)濃度Temporin-PE肽，分別于0 h和24 h拍照。

1.2.5??? DAPI染色??? 細胞培養(yǎng)與分組同1.2.1，取處于對數(shù)生長期LoVo細胞，按1×10個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)過夜。分別加入相應(yīng)濃度Temporin-PE培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定細胞25 min，PBS洗滌2次，加入DAPI染色液室溫10 min，PBS洗滌2次，340 nm波長激發(fā)熒光，熒光鏡下觀察各組細胞形態(tài)。

1.2.6??? 流式細胞術(shù)??? 細胞培養(yǎng)與分組同1.2.1，取處于對數(shù)生長期LoVo細胞，按3×10個/孔接種于12孔板，培養(yǎng)過夜。分別加入相應(yīng)濃度Temporin-PE 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，用無EDTA胰酶消化后收集細胞，PBS洗滌2次重懸細胞，使用Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit試劑盒染色后冰浴放置;流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.3??? 統(tǒng)計學(xué)方法

使用Graphpad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以

2??? 結(jié)果

2.1??? Temporin-PE肽抑制LoVo細胞增殖

CCK-8實驗結(jié)果顯示，不同濃度Temporin- PE肽處理細胞12、24h后，細胞存活率均隨濃度的增加而降低，見圖1。表明Temporin-PE肽能抑制LoVo細胞增殖且呈劑量依賴性。

2.2??? Temporin-PE肽抑制LoVo細胞克隆形成能力

克隆形成實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，實驗組細胞克隆形成率顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖2。表明Temporin-PE肽能抑制LoVo細胞的克隆形成能力。

2.3??? Temporin-PE肽抑制LoVo細胞的遷移

劃痕實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，實驗組24 h細胞劃痕面積隨Temporin-PE肽濃度增高而增大，見圖3。通過劃痕面積計算各組遷移率，可見LoVo細胞遷移率隨Temporin-PE肽濃度增高而降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖4。表明Temporin- PE肽能抑制LoVo細胞的遷移能力。

2.4??? Temporin-PE肽誘導(dǎo)結(jié)腸癌LoVo細胞凋亡

DAPI染色實驗結(jié)果顯示，對照組細胞核大小均一，實驗組細胞核皺縮、大小不一，在200 μg/ml組出現(xiàn)明顯凋亡小體，見圖5。流式細胞術(shù)實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，實驗組凋亡率顯著增高，且隨濃度增加細胞凋亡率也顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），見圖6。表明Temporin-PE肽能誘導(dǎo)LoVo細胞凋亡且呈劑量依賴性。

3??? 討論

近年來，結(jié)腸癌的全球發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，而且結(jié)腸癌的早期臨床癥狀不明顯，難以早期診斷早期治療，中晚期結(jié)腸癌患者臨床治療效果差，因此尋找更有效的結(jié)腸癌治療方法是目前的研究重點之一[6-7]。目前已有數(shù)百種生物活性肽被發(fā)現(xiàn)具有抗癌活性，抗癌肽因具有廣譜的抗癌活性、不易產(chǎn)生細胞耐藥、與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物具有良好的協(xié)同效應(yīng)等特點，在癌癥的臨床治療中有巨大的研究應(yīng)用前景[8-10]。Temporin-PE 肽是從Pelophylax，kl.Esculentus蛙的皮膚分泌物中分離得到的一種生物活性肽，已有研究表明其具有一定的抗菌及抗癌活性。

腫瘤細胞的增殖和遷移是影響患者生存率和復(fù)發(fā)率的重要因素[11-13]。本研究利用不同濃度Temporin-PE肽處理結(jié)腸癌LoVo細胞，觀察其增殖、遷移和凋亡情況。CCK-8檢測結(jié)果顯示，在LoVo細胞培養(yǎng)液中分別加入不同濃度的Temporin-PE肽，培養(yǎng)12 h和24 h后，細胞的增殖均受到抑制，且呈劑量依賴性。克隆形成實驗結(jié)果顯示，Temporin-PE肽顯著降低LoVo細胞的克隆形成能力。劃痕實驗結(jié)果顯示，隨著Temporin-PE肽濃度的增高，LoVo細胞的遷移能力顯著降低，提示Temporin-PE肽對LoVo細胞增殖、克隆形成能力以及遷移能力均產(chǎn)生了明顯的抑制作用。細胞凋亡是細胞增殖過程中重要的調(diào)控機制，腫瘤細胞因正常凋亡受到抑制導(dǎo)致細胞無限增殖[14-15]。本研究利用DAPI實驗及流式細胞術(shù)檢測Temporin-PE肽對LoVo細胞凋亡能力的影響。DAPI染色結(jié)果顯示，Temporin-PE肽作用24 h后，可見細胞邊界收縮變圓，細胞核大小不一，出現(xiàn)核內(nèi)部分染色質(zhì)斷裂、皺縮現(xiàn)象，核碎裂細胞明顯增多。流式細胞術(shù)分析可見，隨著Temporin-PE肽濃度的增高，各組LoVo細胞凋亡率也呈顯著增高趨勢，提示Temporin-PE肽能促進LoVo細胞凋亡。

綜上所述，Temporin-PE肽能抑制結(jié)腸癌LoVo細胞的增殖、克隆和遷移能力，促進細胞凋亡。其分子機制還需要進一步的研究來探討。

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