基于GFAP/STAT3通路探討針康法對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能和星形膠質(zhì)細胞的影響

孔妍 鄒偉 關(guān)睿騫 劉雙嶺 陳奧 崔乃松

缺血性腦卒中屬“中風病”范疇，最早見于《內(nèi)經(jīng)》中“卒中”“薄厥”等[1]，是由于腦血流供應不足導致局部腦組織缺血、缺氧引發(fā)的急性腦功能障礙性疾病，該病具有“四高一多”的特點，即發(fā)病率高、致殘率高、致死率高及并發(fā)癥多[2]，嚴重威脅到人類的生命健康。缺血性腦卒中占全部腦卒中類型的60%～80%，治愈率極低，且越來越趨于年輕化[3]，如何針對本病給予及時有效的治療干預，減輕卒中后的各種神經(jīng)和肢體功能障礙，一直是臨床醫(yī)師研究關(guān)注的重點問題。近年來，將中醫(yī)治療手段與現(xiàn)代康復技術(shù)相結(jié)合用于臨床各種功能障礙的治療，已取得了長足進展，其中以針灸和現(xiàn)代康復技術(shù)結(jié)合應用最為廣泛[4-5]。針康法是將頭穴叢刺法與康復訓練同步結(jié)合進行的一種治療方法，較之單一治療手法能夠更大限度地發(fā)揮二者的優(yōu)勢，達到療效最大化[6]，已在臨床廣泛應用于腦卒中的康復治療[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，缺血性卒中后星形膠質(zhì)細胞的激活和反應性膠質(zhì)化，能夠觸發(fā)級聯(lián)炎癥反應和膠質(zhì)癱痕生成，從而加重缺血性神經(jīng)功能損傷[9-10]。本實驗擬通過研究針康法對局灶性腦缺血再灌注模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠神經(jīng)功能及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)/信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)通路的影響，探討針康法干預星形膠質(zhì)細胞活化保護神經(jīng)功能的相關(guān)作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(250±20)g，購于黑龍江中醫(yī)藥大學GLP實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SYXK(黑)-2016-004，并經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準(批準號JZLLSC2019-0160)。于12小時/12小時晝夜循環(huán)交替，溫度20～22℃，濕度50%～60%實驗環(huán)境下，適應性喂養(yǎng)1周，維持自由進食、飲水。

1.2 實驗試劑

山羊血清封閉液、TBST溶液、蘇木素染液(國藥集團化學試劑有限公司，批號：191002/S200201/200102)；辣根過氧化物酶、ECL化學發(fā)光試劑，Trizol試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Sigma-Aldrich公司，批號：191101/020115/200403/200211)；DAB 顯色試劑盒、BCA 蛋白含量檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：026-01-04/2020-01-02)；鼠抗GFAP、表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)抗體、山羊抗兔IgG 二抗(Abcam公司，批號：K200302/K200106/200205)；鼠抗抗體-磷酸化蛋白質(zhì)激酶(phospho-Janus kinase 1，p-JAK1)、p-STAT3抗體(Santa Cruz公司，批號：sc-200106/sc-200504)。

1.3 實驗儀器

Sorvall Stratos冷凍高速離心機(美國Thermo公司，型號208V)；Stuart 組織勻漿器(英國Bibby-Stuart公司，型號SHM2)；Leica光學顯微鏡(德國 Leica公司，型號DMi8)；紫外可見分光光度計(METTLER TOLEDO公司，型號UV5)；SDS-PAGE凝膠電泳儀(美國Bio-rad公司，型號：165-8029)；Invitrogen iBright凝膠智能成像系統(tǒng)(美國Thermo公司，型號CL1000)；實驗室大鼠恒溫箱(FU.YI.LIAN公司，型號FYL-YS-280L)。

1.4 分組與造模

90只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、針刺組、康復組、針康組共 5組，每組各18只。模型組和各治療組均采用Longa改良線栓法建立大鼠MCAO模型[11]：大鼠稱重后以10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上，常規(guī)消毒頸部皮膚，取頸部正中部位切口，鈍性分離右側(cè)頸總動脈和頸外動脈，動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，在頸總動脈近心端與頸外動脈處用縫合線結(jié)扎，在頸外動脈分叉處做一直徑約0.20 mm的V型切口，將線栓自切口處導入動脈管腔，在插入線栓的同時松開動脈夾，線栓插至深度約(18.50±0.50)mm處，遇明顯阻力時停止，造成大鼠腦缺血，在缺血90分鐘后將線栓拉出進行再灌注。假手術(shù)組不進行血管結(jié)扎及線栓導入，其他操作相同。于大鼠麻醉清醒后采用Zea-Longa’s級標準評分法對大鼠進行神經(jīng)功能評分，評分為1～3分即為造模成功，可進行下一步實驗。

1.5 干預方法

(1)針刺組：于造模后第2日開始給予頭穴叢刺法干預治療，參考《實驗動物穴位圖譜》取百會穴及百會左、右側(cè)各旁開2 mm處(頂區(qū))作為刺激區(qū)，以華佗牌針灸針(0.25 mm×25 mm)向前平刺至頂前區(qū)，深度0.5寸，快速捻轉(zhuǎn)(頻率200轉(zhuǎn)/分鐘)5分鐘后留針6小時，留針期間每1小時捻轉(zhuǎn)一次，每次5分鐘，每日針刺1次。(2)康復組：各組大鼠均于造模前給予適應性跑臺訓練3天，康復組大鼠于造模后第2日開始給予跑臺訓練，均為每次30分鐘，每日1次。采用五跑道電動跑臺，設(shè)定跑臺斜度為0°，跑臺履帶不斷向后傳輸，履帶尾部帶有電柵欄，為避免電柵欄的電擊，大鼠需不斷自主向前奔跑，履帶傳輸速度：術(shù)前3天為12 m/分鐘，術(shù)后第1日為5 m/分鐘，術(shù)后第2日為8 m/分鐘，第3日及以后為12 m/分鐘。(3)針康組：于造模后第2日開始給予頭穴叢刺法結(jié)合跑臺康復訓練。(4)假手術(shù)組、模型組：造模后不給予任何干預治療，僅放回籠中正常飼養(yǎng)。

1.6 觀察指標

1.6.1 神經(jīng)功能評分 (1)Zea-Longa’s級標準評分[12]：采用Zea-Longa’s級標準評分法分別于治療第6小時、3天、7天、14天對大鼠進行神經(jīng)功能評分，評分按照0～4分五級評分：0分為行為正常，無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分為提尾時左前肢屈曲；2分為行走時左前肢屈曲并軀體自發(fā)性向左轉(zhuǎn)圈；3分為軀體左側(cè)偏癱；4分為意識障礙，無法自發(fā)行走，分值越高表示神經(jīng)功能損傷越嚴重。(2)mNSS評分[13]：采用改良神經(jīng)功能缺損評分(mNSS評分)分別于治療第6小時、3天、7天、14天對大鼠神經(jīng)功能進行評價，該評分法包括運動、感覺、平衡功能及反射水平等多個方面的測評，能夠全面反映出腦缺血大鼠的神經(jīng)功能損傷情況，總分為18分，分值越高表示神經(jīng)功能損傷越嚴重，其中0～6分為輕度損傷；7～12 分為中度損傷；13～18分為重度損傷。

1.6.2 免疫組化法檢測腦組織GFAP、EGFR陽性表達 神經(jīng)功能評分后，腹腔麻醉大鼠，迅速開胸暴露心臟，采用4 ℃，0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛溶液依次心臟灌注，待大鼠死亡后斷頭取腦，將腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定處理，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，在3% H2O2中室溫孵育10分鐘，微波抗原修復，血清封閉30分鐘，滴加稀釋的一抗，4℃保存過夜，PBS沖洗3次×2分鐘，滴加稀釋的二抗，37℃孵育30分鐘，PBS沖洗3次×2分鐘，DAB顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，置顯微鏡下觀察，每組隨機選取5個高倍鏡(×400)下視野，采用Image-pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對陽性表達進行分析，以陽性細胞計數(shù)代表蛋白表達量。

1.6.3 WB檢測腦組織P-JAK1、P-STAT3蛋白表達 神經(jīng)功能評分后，同“1.6.2”方法心臟灌注處死大鼠后斷頭取腦，腦組織以4 ℃，0.9 %生理鹽水清洗干凈，研磨粉碎，加入足量新鮮配制的蛋白裂解液，4℃下勻漿處理30分鐘，12000 r/分鐘高速離心10分鐘，取上清液，BCA 法測定蛋白濃度。10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1小時，TBST 洗膜后，滴加稀釋的一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1000)，室溫孵育1小時，TBST洗膜后，ECL顯色、曝光，以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J凝膠成像分析系統(tǒng)對電泳圖像進行分析，以各目的蛋白與GAPDH的光密度比值代表蛋白的相對表達量。

1.6.4 RT-PCR檢測腦組織GFAP、EGFR mRNA水平 神經(jīng)功能評分后，同“1.6.2”方法心臟灌注處死大鼠后斷頭取腦，腦組織以Trizol 法提取總RNA，紫外分光光度法檢測總RNA濃度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得 cDNA后進行PCR擴增反應，反應程序為：95℃預變性3分鐘，變性30秒；62℃退火30秒；72℃延伸30秒，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用Invitrogen iBright凝膠成像分析系統(tǒng)對電泳圖像進行分析，以2-△△Ct值計算蛋白的相對表達量。PCR引物序列由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成，見表1。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 Zea-Longa’s級標準評分比較

模型組和各治療組大鼠在不同時間點的Zea-Longa’s級標準評分均較假手術(shù)組明顯增加(P<0.05)，各組Zea-Longa’s級標準評分隨時間呈現(xiàn)下降趨勢；其中，各治療組大鼠在第3天、7天、14天時的Zea-Longa’s級標準評分均較模型明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組MCAO大鼠Zea-Longa’s級評分比較(分,ˉ

2.2 mNSS評分比較

模型組和各治療組大鼠在不同時間點的mNSS評分均較假手術(shù)組明顯增加(P<0.05)，各組mNSS評分隨時間呈現(xiàn)下降趨勢，其中，各治療組大鼠在第3天、7天、14天時的mNSS評分均較模型組明顯降低(P<0.05)，針康組在第6小時的mNSS評分亦較模型組明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組MCAO大鼠mNSS評分比較(分,

2.3 腦組織GFAP、EGFR陽性表達

免疫組化結(jié)果可見，模型組和各治療組大鼠腦組織GFAP、EGFR陽性細胞計數(shù)均較假手術(shù)組明顯增多(P<0.05)；各治療組大鼠腦組織GFAP、EGFR陽性細胞計數(shù)均較模型組明顯減少(P<0.05)，且以針康組陽性細胞計數(shù)為最低。見表4、圖1。

表4 各組MCAO大鼠腦組織GFAP、EGFR陽性細胞計數(shù)比較(個

圖1 各組MCAO大鼠腦組織GFAP、EGFR陽性表達(DBA，×400)

2.4 腦組織P-JAK1、P-STAT3蛋白表達

WB結(jié)果可見，模型組和各治療組大鼠腦組織P-JAK1、P-STAT3蛋白表達均較假手術(shù)組明顯增加(P<0.05)；干預后，各治療組大鼠腦組織P-JAK1、P-STAT3蛋白表達均較模型組明顯降低(P<0.05)，且以針康組為最低。見表5、圖2。

圖2 各組MCAO大鼠腦組織P-JAK1、P-STAT3蛋白表達

表5 各組MCAO大鼠腦組織P-JAK1、P-STAT3蛋白表達

2.5 腦組織GFAP、EGFR mRNA水平

RT-PCR結(jié)果可見，模型組和各治療組大鼠腦組織GFAP、EGFR mRNA水平均較假手術(shù)組明顯增加(P<0.05)；干預后，各治療組大鼠腦組織GFAP、EGFR mRNA水平均較模型組明顯降低(P<0.05)，且以針康組為最低。見表6。

表6 各組MCAO大鼠腦組織GFAP、EGFR mRNA水平比較

3 討論

缺血性腦卒中歸屬于中醫(yī)學“中風”“卒中”“薄厥”等范疇，本病病位在頭部，為人體經(jīng)氣匯聚之所，《靈樞·五亂》記載“氣亂于頭則為厥逆, 頭重眩仆……取之天柱?！笨梢姡^部穴位與人體臟腑器官及經(jīng)絡(luò)氣血功能有著密切聯(lián)系[14]。頭穴叢刺取頭頂區(qū)百會穴及左、右側(cè)各旁開2 mm處，主要對應大腦中央前回、中央后回及旁中央小葉等區(qū)域，配合長留針、間斷捻轉(zhuǎn)手法，尤適用于腦卒中后運動、感覺障礙的治療[15]。針康法是頭穴叢刺法與現(xiàn)代康復治療的有機結(jié)合，即在頭穴叢刺長留針期間，同步進行各種運功康復訓練[16]，臨床用于腦卒中的治療，療效確切，其核心治療思想為“針康同步、動態(tài)治療、整體康復”，其中，頭穴叢刺法可通過針刺效應透過顱骨，直接刺激大腦皮質(zhì)，作用于責任病灶；康復訓練則作用于四肢，通過多次重復康復運動，間接刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)，提高腦神經(jīng)元功能可塑性，促進受損神經(jīng)功能恢復，二者雙向調(diào)節(jié)、同步作用，以實現(xiàn)療效最大化[17-18]。

近年來，關(guān)于針康法干預治療腦缺血再灌注損傷的機制研究屢見報道，如針康法可能通過促進腦缺血區(qū)域皮質(zhì)突觸可塑性，降低腦缺血后神經(jīng)細胞損傷，加速神經(jīng)功能重建[19]；其可通過下調(diào)Caspase-3 mRNA和蛋白，抑制海馬神經(jīng)元凋亡，促進腦卒中后神經(jīng)功能恢復[20]；或可上調(diào)腦缺血區(qū)皮質(zhì)微血管計數(shù)及海馬SDF-1A mRNA表達，參與血管內(nèi)皮細胞遷移和增殖，降低腦缺血再灌注后神經(jīng)損傷[21]，然而，關(guān)于針康法干預星形膠質(zhì)細胞活化改善腦缺血再灌注損傷的機制研究目前尚未見報道。研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的細胞，在腦缺血狀態(tài)下，發(fā)揮著雙重作用[22-24]：一方面，腦缺血后星形膠質(zhì)細胞能夠迅速活化為反應性星形膠質(zhì)細胞，通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、促紅細胞生成素及谷胱甘肽等抗氧化物質(zhì)，發(fā)揮神經(jīng)保護作用；另一方面，活化后的星形膠質(zhì)細胞可通過分泌多種炎癥介質(zhì)、興奮性氨基酸、細胞毒性因子等物質(zhì)進一步損傷腦神經(jīng)。同時，星形膠質(zhì)細胞過度增生形成的膠質(zhì)瘢痕，可壓迫局部腦組織，抑制微血管生成，阻礙局部腦血流恢復，進一步加重腦組織缺血缺氧情況[25]。GFAP是星形膠質(zhì)細胞的特異性標志蛋白，能夠反應出星型膠質(zhì)細胞的反應性和重塑性[26]。EGFR是一種酪氨酸激酶型受體，廣泛分布于活化的星形膠質(zhì)細胞中，能夠反映出星形膠質(zhì)細胞的分化與增殖情況[27]。腦卒中后，GFAP、EGFR在星形膠質(zhì)細胞中均呈現(xiàn)高表達，且與神經(jīng)功能損傷程度密切相關(guān)[28]。STAT3 是信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)家族成員之一，在活躍狀態(tài)下可與 GFAP 啟動子位點結(jié)合，誘導酪氨酸快速磷酸化，促進星形膠質(zhì)細胞的活化、增生[29]。STAT3同時是 EGFR下游的重要效應分子之一，其可通過與細胞表面受體結(jié)合后誘導受體上的酪氨酸殘基磷酸化和核轉(zhuǎn)位，進而刺激星形膠質(zhì)細胞活化，加速神經(jīng)細胞損傷[30]。由此可見，對腦卒中后星形膠質(zhì)細胞的活化機制進行深入研究，抑制其活化和反應性膠質(zhì)化，對于改善腦卒中后繼發(fā)性腦損傷，促進神經(jīng)功能恢復具有重要的意義。

本研究采用針康法干預治療MCAO大鼠，通過研究該方法對腦卒中后神經(jīng)功能及GFAP/STAT3通路的影響，探討針康法干預星形膠質(zhì)細胞活化發(fā)揮神經(jīng)保護作用的相關(guān)作用機制，也為臨床尋找治療缺血性腦卒中的新作用靶點和治療方案提供數(shù)據(jù)支持。結(jié)果顯示，治療干預后，針刺組、康復組和針康組大鼠的的Zea-Longa’s級標準評分和mNSS評分在第3天、7天、14天時均較模型組明顯降低(P<0.05)，且各組評分均隨時間呈現(xiàn)下降趨勢。免疫組化和RT-PCR結(jié)果可見，各治療組大鼠在干預治療后的腦組織GFAP、EGFR陽性細胞計數(shù)和mRNA水平均較模型組明顯減少(P<0.05)，且以針康組為最低。WB結(jié)果可見，各治療組大鼠在干預治療后的腦組織P-JAK1、P-STAT3蛋白表達均較模型組明顯降低(P<0.05)，且以針康組為最低。研究結(jié)果提示：針康法能夠明顯改善MCAO大鼠神經(jīng)功能損傷，并降低缺血腦組織GFAP、EGFR、P-JAK1、P-STAT3等蛋白及基因表達。

綜上所述，針康法干預治療腦缺血再灌注大鼠能夠有效改善神經(jīng)功能損傷，該作用機制可能是通過調(diào)控GFAP/STAT3通路抑制星形膠質(zhì)細胞活化實現(xiàn)的。