半夏瀉心湯加減治療多囊卵巢綜合征及胰島素抵抗“異病同治”的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

賈凡 趙紅玉 鄭冬雪 劉新敏

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期女性常見(jiàn)的的生殖內(nèi)分泌紊亂性疾病，因其病因尚未明確、病理機(jī)制復(fù)雜、臨床表現(xiàn)具有異質(zhì)性、遠(yuǎn)期并發(fā)癥繁多，所以屬婦科領(lǐng)域的一大難題[1]。PCOS患者的典型特征包括性激素水平異常、胰島素抵抗(insulin resistance,IR)、卵巢多囊樣改變、慢性亞臨床炎癥等。

IR是指細(xì)胞對(duì)胰島素的反應(yīng)不充分，導(dǎo)致葡萄糖攝取和利用受損的一種病理狀態(tài)[2]。在過(guò)去的30年內(nèi)，IR的患病率顯著增加[3]。IR是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的核心環(huán)節(jié)，也是其關(guān)鍵病理生理特征之一[4]，亦屬PCOS的重要病理變化，更是高血壓、糖脂異常、心腦血管病等多種慢性疾病的基礎(chǔ)[5]。據(jù)調(diào)查，約50%～70%的PCOS患者合并IR[6]。在IR狀態(tài)下，機(jī)體會(huì)代償性地增加胰島素的分泌以維持相對(duì)正常的血糖水平，升高的胰島素會(huì)通過(guò)多種途徑引起雄激素水平上升，亦可導(dǎo)致卵泡發(fā)育障礙和生殖功能異常；高水平的胰島素還會(huì)影響脂肪的儲(chǔ)存及膽固醇、脂蛋白等物質(zhì)的正常代謝過(guò)程，進(jìn)而誘發(fā)代謝性疾病[7]。因此，IR是PCOS患者發(fā)生生殖功能紊亂和代謝異常的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，干預(yù)IR對(duì)于改善PCOS及預(yù)防糖脂代謝異常等遠(yuǎn)期并發(fā)癥具有重要意義。

半夏瀉心湯源自《傷寒論》，原文有言“滿而不痛者，此為痞，柴胡不中與之，宜半夏瀉心湯”“嘔而腸鳴，心下痞者，半夏瀉心湯主之”，該方有苦降辛開(kāi)、消痞散結(jié)的功效，主治寒熱錯(cuò)雜之痞證[8]?，F(xiàn)代常用于治療胃腸炎[9]、糖尿病[10]等證屬胃強(qiáng)脾弱、寒熱錯(cuò)雜者。實(shí)驗(yàn)證實(shí)該方具有降低T2DM大鼠血糖、改善血脂代謝的作用，同時(shí)可以改善IR水平[11]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PCOS-IR患者多表現(xiàn)為月經(jīng)后錯(cuò)、肥胖、多食、易饑、食后脘痞、早飽、便溏等癥狀，辨證多屬于脾虛胃熱型[12]；使用半夏瀉心湯加減治療超重合并IR的PCOS患者，結(jié)果顯示半夏瀉心湯加減可顯著降低PCOS IR患者餐后2小時(shí)胰島素、胰島素曲線下面積，同時(shí)提高患者的基礎(chǔ)體溫周期雙相率及累計(jì)妊娠率[13]。提示半夏瀉心湯加減具有恢復(fù)排卵和自主月經(jīng)、增強(qiáng)胰島素敏感性、改善糖代謝的作用，是治療PCOS-IR的有效方劑。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，半夏瀉心湯加減在改善脾虛胃熱型PCOS-IR患者的生殖內(nèi)分泌水平、提高妊娠率及胰島素敏感性等方面存在時(shí)效關(guān)系[14]。然而，半夏瀉心湯加減治療PCOS合并IR的作用機(jī)制的研究較少。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門新興學(xué)科，它從生物信息網(wǎng)絡(luò)的角度闡釋疾病、藥物作用的相關(guān)機(jī)制[15-16]，其基于整體角度分析中藥復(fù)方作用機(jī)制的理念切合中醫(yī)整體論的思想[17]。本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，對(duì)半夏瀉心湯加減治療PCOS及IR可能的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行探討并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證，試從“異病同治”角度探究該方治療PCOS及IR的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 半夏瀉心湯加減的相關(guān)靶點(diǎn)篩選

通過(guò)TCMSP平臺(tái)[18]查找清半夏、黃芩、黃連、干姜、黨參、甘草、大棗、仙靈脾、枸杞子等中藥的化學(xué)組成成分，按照口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性(drug likeness，DL)≥0.18設(shè)置藥代動(dòng)力學(xué)的屬性值并進(jìn)行活性成分初步篩選以獲得上述藥物的活性化合物及其作用蛋白的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。使用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)(https://www.uniprot.org)檢索靶點(diǎn)信息，將化合物作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的基因名稱。

1.2 PCOS及IR疾病靶點(diǎn)篩選

以“polycystic ovary syndrome”及“insulin resistance”為關(guān)鍵詞，分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)、Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org/)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://go.drugbank.com/)檢索PCOS及IR相關(guān)的基因信息，檢索物種設(shè)定為“人類(Homo sapiens)”。其中GeneCards檢索的基因按照相關(guān)性得分(Relevance score)進(jìn)行中位值篩選以獲取較相關(guān)的靶點(diǎn)。將各數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得的基因數(shù)據(jù)取并集，并篩除重復(fù)值，獲得PCOS及IR的疾病相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)。

1.3 半夏瀉心湯加減治療PCOS及IR的作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

使用Venny2.1.0將篩選出的藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)分別與PCOS及IR疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)取交集得到共有靶點(diǎn)，分別獲得半夏瀉心湯加減治療PCOS及IR的作用靶點(diǎn)，將半夏瀉心湯加減治療PCOS的靶點(diǎn)和半夏瀉心湯加減治療IR的靶點(diǎn)取交集獲得治療兩疾病的共有靶點(diǎn)，進(jìn)行后續(xù)分析。

1.4 蛋白相互作用(Protein-Protein Interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將藥物與疾病的共有靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，設(shè)置隱藏游離點(diǎn)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將從String數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的tsv文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化分析，使用Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?，以連接度(degree)、介度(betweenness centrality)、緊密度(closeness centrality)等參數(shù)為參考條件，按照degree值由高至低進(jìn)行排序，選取分值大于中位數(shù)的基因作為關(guān)鍵靶點(diǎn)。使用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，對(duì)其網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，并設(shè)置節(jié)點(diǎn)(node)大小和顏色用于反映degree的大小。

1.5 基因本體(gene ontology，GO)富集分析、京都基因和基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析

將篩選出的核心靶標(biāo)輸入DAVID 6.8 (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，Bonferroni法校正原始P值得到校正P值(adjP)，以adjP<0.01及錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)<0.01作為條件，篩選關(guān)鍵核心靶標(biāo)最顯著富集的生物過(guò)程和通路信息，以期得到藥物靶點(diǎn)主要的生物學(xué)注釋和藥理作用通路。

1.6 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.6.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 21日齡雌性SD大鼠18只，由北京華阜康生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可號(hào)：SCXK(京)2019-0008。飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，喂養(yǎng)飼料分普通飼料(供能比：蛋白質(zhì)22.47%，脂肪12.11%，碳水化合物65.42%)與高脂飼料(供能比：蛋白質(zhì)19.5%，脂肪23.8%，碳水化合物56.7%)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行(批號(hào)IACUC-GAMH-2017-002)。

1.6.2 藥物及試劑 半夏瀉心湯加減(清半夏、黃芩、黃連、干姜、黨參、甘草、大棗、仙靈脾、枸杞子)由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院中藥新藥制劑研發(fā)中心提供；來(lái)曲唑片(弗隆)(規(guī)格：2.5mg/片)，購(gòu)自諾華制藥有限公司；羧甲基纖維素鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)：20181203)；白細(xì)胞介素-6 (interleukin- 6,IL-6)ELISA試劑盒(欣博盛生物有限公司，貨號(hào)：ERC003.96)；IL-6抗體(RD SYSTEMS公司，貨號(hào)：MAB5061-100)。

1.6.3 分組、造模及給藥 SD 大鼠隨機(jī)分為空白組(A組)、模型組(B組)及中藥組(C組)，每組各6只，空白組予普通飼料喂養(yǎng)，其余各組給予高脂飼料聯(lián)合來(lái)曲唑造模，造模后大鼠血清睪酮 (testosterone, T)、黃體生成素(luteinizing hormone, LH)/卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)比值升高，卵巢病理切片示卵巢出現(xiàn)多囊樣改變，血清胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model of assessment for insulin resistence index,HOMA-IR)顯著高于空白對(duì)照組則提示PCOS-IR大鼠造模成功[19]。造模成功后，中藥組使用半夏瀉心湯加減進(jìn)行干預(yù)14天。給藥期間空白對(duì)照組予普通飼料，余組予高脂飼料。

1.6.4 標(biāo)本采集及實(shí)驗(yàn)方法 給藥結(jié)束后，各組大鼠禁食12小時(shí)進(jìn)行取材。血液標(biāo)本冰上靜置，離心，分離血清進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)實(shí)驗(yàn)。取大鼠卵巢組織進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(western blot,WB)實(shí)驗(yàn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 半夏瀉心湯加減活性成分篩選與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

半夏瀉心湯加減的成分收集自TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，其中半夏中含有116個(gè)，黃芩中含有143個(gè)，黃連中含有48個(gè)，干姜中含有148個(gè)，黨參中含134個(gè)，甘草中含有280個(gè)，大棗中含有133個(gè)，淫羊藿中含有130個(gè)，枸杞子中含有188個(gè)。依根據(jù)藥物代謝動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)，將口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(drug likeness,DL)≥0.18為選擇條件[20]，運(yùn)用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的活性成分對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)信息進(jìn)行檢索，規(guī)范靶點(diǎn)基因名，剔除無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)成分并去重。結(jié)果共收集到82個(gè)生物活性成分。其中半夏7個(gè)、黃芩14個(gè)、黃連8個(gè)、干姜5個(gè)、黨參11個(gè)、甘草22個(gè)、大棗16個(gè)、淫羊藿12個(gè)、枸杞子10個(gè)。通過(guò)對(duì)82個(gè)活性化合物構(gòu)建中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖1)，并依據(jù)節(jié)點(diǎn)的degree值進(jìn)行節(jié)點(diǎn)大小的調(diào)節(jié)。82個(gè)活性化合物共有286個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)最多的五個(gè)化合物分別為槲皮素(E1)、β-谷甾醇(E2)、山奈酚(B2)、木犀草素(B1)、豆甾醇(E3)。見(jiàn)圖1、表1及表2。

注：九個(gè)圓形粉色節(jié)點(diǎn)代表九味中藥；淺藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表藥物對(duì)應(yīng)的活性成分；深藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表中藥成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)；左右兩列的六邊形節(jié)點(diǎn)代表多個(gè)中藥共有的活性成分。中藥簡(jiǎn)稱-全稱對(duì)應(yīng)關(guān)系見(jiàn)表1，中藥共有的活性成分對(duì)應(yīng)全稱見(jiàn)表2。

表1 中藥簡(jiǎn)稱-全稱對(duì)應(yīng)關(guān)系

表2 中藥共有的活性成分對(duì)應(yīng)全稱

2.2 PCOS及IR的疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果

PCOS在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得4847條相關(guān)基因，Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得32條相關(guān)基因，Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)獲得988個(gè)基因。IR在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得8707條相關(guān)基因，Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)獲得162個(gè)基因。靶點(diǎn)過(guò)多則設(shè)置選取Relevance score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)。將上述數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得的基因數(shù)據(jù)匯總并刪重后，共獲得2851個(gè)PCOS疾病相關(guān)基因、4362個(gè)IR疾病相關(guān)基因。

2.3 半夏瀉心湯加減治療PCOS及IR靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

將篩選出的藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)輸入Venny 2.1.0軟件，獲得藥物與PCOS及IR的交集靶點(diǎn)數(shù)目分別為195、252個(gè)，作為藥物作用于疾病的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。將上述195個(gè)PCOS的靶點(diǎn)和252個(gè)IR的靶點(diǎn)再取交集獲得191個(gè)半夏瀉心湯加減治療PCOS與IR的共有靶點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

圖2 半夏瀉心湯加減治療PCOS與IR共有靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 半夏瀉心湯加減治療PCOS及IR潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述獲得的191個(gè)共有靶點(diǎn)輸入String平臺(tái)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，物種選擇“Homo sapiens”，隱藏游離節(jié)點(diǎn)后包含190個(gè)節(jié)點(diǎn)，4358條邊，平均degree為45.9，見(jiàn)圖3。將PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2中進(jìn)行拓?fù)涮卣鞣治?，按照degree值由高至低進(jìn)行排序，選取分值大于中位數(shù)的基因作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，根據(jù)該原則進(jìn)行一次篩選，最后得到半夏瀉心湯加減治療PCOS及IR關(guān)鍵靶點(diǎn)。degree越大，節(jié)點(diǎn)圖形面積越大，顏色越暖；節(jié)點(diǎn)間相互作用強(qiáng)度越大，節(jié)點(diǎn)連線越粗，顏色越暖。degree得分最高的前5位分別為ALB、AKT1、TNF、IL6、TP53。見(jiàn)圖4。

圖3 半夏瀉心湯加減治療PCOS及IR的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 篩選后的半夏瀉心湯加減治療PCOS及IR的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO富集分析及KEGG通路富集分析結(jié)果

2.5.1 GO富集分析結(jié)果 GO富集分析是注釋基因及其表達(dá)產(chǎn)物的常用方法。它主要分為生物過(guò)程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細(xì)胞組分(Cell components,CC)三部分。通過(guò)GO分析有助于了解藥物靶點(diǎn)的生物學(xué)功能、作用方式及細(xì)胞定位等[21]。利用生物學(xué)信息注釋(database for annotation, visualization and integrated discovery,DAVID)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)藥物疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，共富集到783條生物過(guò)程相關(guān)條目，89條分子功能相關(guān)條目，141條細(xì)胞組分相關(guān)條目。根據(jù)參與分子數(shù)分別選取前20位的生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能并使用微生信(Heatmap was plotted by http://www.bioinformatics.com.cn, a free online platform for data analysis and visualization.)繪制條形圖(見(jiàn)圖5)。涉及的生物學(xué)過(guò)程主要包括RNA聚合酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、藥物反應(yīng)(response to drug)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控(negative regulation of apoptotic process)、細(xì)胞增殖的正調(diào)控(positive regulation of cell proliferation)等；細(xì)胞組分主要包括細(xì)質(zhì)膜(plasma membrane)、細(xì)胞核(nucleus)、胞液(cytosol)、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)、細(xì)胞外間隙(extracellular space)等；分子功能主要包括蛋白結(jié)合(protein binding)、酶位點(diǎn)結(jié)合(enzyme binding)、相同的蛋白結(jié)合(identical protein binding)、蛋白同源二聚體化活性(protein homodimerization activity)、ATP結(jié)合(ATP binding)等。

圖5 預(yù)測(cè)靶點(diǎn)基因功能富集圖

2.5.2 KEGG通路富集分析結(jié)果 KEGG通路富集分析可以分析藥物靶標(biāo)(或差異表達(dá)基因)的信號(hào)通路，便于了解在疾病過(guò)程中發(fā)生變化的信號(hào)通路，在探索疾病治療上具有重要意義[17]。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)藥物疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，選擇校正后P≤0.05的條目，共富集到125條信號(hào)通路。選擇參與分子數(shù)排名前20位的通路并使用微生信(Heatmap was plotted by http://www.bioinformatics.com.cn, a free online platform for data analysis and visualization.)繪制條形圖(見(jiàn)圖6)。參與的通路主要包括癌癥通路(pathways in cancer)、乙型肝炎(Hepatitis B)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、癌癥中的蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、人類嗜T細(xì)胞病毒感染(HTLV-I infection)、粘著斑(Focal adhesion)、癌癥中的MicroRNA(MicroRNAs in cancer)、FoxO信號(hào)通路(FoxO signaling pathway)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)等。

圖6 預(yù)測(cè)靶點(diǎn)信號(hào)通路富集圖

2.6 ELISA法檢測(cè)大鼠血清IL-6水平的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

IL-6是半夏瀉心湯加減治療PCOS及IR潛在靶點(diǎn)中degree值排名前五的靶點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)造模后，與空白組相比，模型組大鼠血清IL-6水平明顯上升(P<0.05)，使用半夏瀉心湯給藥干預(yù)后，中藥組大鼠血清IL-6水平明顯下降(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清IL-6水平的比較

2.7 WB法檢測(cè)大鼠卵巢組織IL-6蛋白表達(dá)情況的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠卵巢組織IL-6蛋白的表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)，使用半夏瀉心湯給藥干預(yù)后，中藥組大鼠卵巢組織IL-6蛋白的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。見(jiàn)圖7、表4。

圖7 Western blot法檢測(cè)大鼠卵巢組織IL-6的表達(dá)水平

表4 各組大鼠卵巢組織IL-6蛋白的表達(dá)情況比較

3 討論

PCOS是涉及多個(gè)系統(tǒng)的常見(jiàn)婦科疾病，在育齡期婦女中的患病率可達(dá)8%～13%，是導(dǎo)致育齡期婦女不孕的主要原因[22]，嚴(yán)重危害女性的身心健康，且其遠(yuǎn)期并發(fā)癥多[23-24]。IR在多種內(nèi)分泌代謝類疾病中廣泛存在，屬于T2DM、代謝綜合征(metabolic syndrome, MetS)、非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic Fatty Liver Disease，NFALD)、肥胖癥(Obesity Syndrome，OS)等代謝性疾病的重要發(fā)病機(jī)制之一[25]。因此，IR不僅是PCOS患者發(fā)生生殖功能紊亂及代謝異常的重要環(huán)節(jié)，且IR的疾病進(jìn)展與PCOS的遠(yuǎn)期并發(fā)癥存在交集。因此，應(yīng)盡早干預(yù)以防PCOS及IR患者內(nèi)分泌紊亂的程度加劇。

中醫(yī)中藥在治療PCOS及IR等方面療效顯著，具有廣闊的發(fā)展前景。研究表明，滋腎清熱利濕化瘀方具有改善PCOS患者自發(fā)排卵、降低血清T的作用[26]；姜黃聯(lián)用二甲雙胍能改善PCOS IR患者的生殖激素紊亂狀態(tài)及胰島素敏感性[27]；固本化瘀法具有改善肥胖型PCOS大鼠卵泡發(fā)育及IR的作用[28]；半夏瀉心湯能改善PCOS患者生殖功能紊亂的狀況[29]，也能改善糖尿病大鼠血糖及IR水平[30]。

本研究通過(guò)TCMSP平臺(tái)篩選后得到半夏瀉心湯加減的82個(gè)活性化合物，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)最多的五個(gè)化合物分別為槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、木犀草素、豆甾醇。槲皮素是一種類黃酮化合物，廣泛存在于多種中藥內(nèi)，具有清除氧自由基、調(diào)節(jié)血糖等生物活性。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以增加PCOS大鼠治療后的正常卵泡數(shù)目，恢復(fù)正常卵巢組織結(jié)構(gòu)，改善IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎癥因子的水平；同時(shí)可降低PCOS患者血清T、LH水平。此外，槲皮素有較好的降糖作用，能夠改善高胰島素血癥及IR水平[31-32]；其改善IR的作用可能是通過(guò)增加骨骼肌GLUT4表達(dá)，降低JNK磷酸化、TNF-α和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)達(dá)到的[33]。β-谷甾醇具有抗炎[34]、抗氧化應(yīng)激[35]及抗腫瘤[36-37]的功效；能顯著改善PCOS組大鼠的子宮和卵巢結(jié)構(gòu)，還可以協(xié)調(diào)大鼠的性激素水平、調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)。山奈酚能降低T2DM大鼠空腹血糖、提高胰島素敏感性、改善糖脂代謝紊亂；同時(shí)可以抵抗機(jī)體的炎癥反應(yīng)，且炎癥因子水平與PCOS雄激素水平存在正相關(guān)關(guān)系[38]，因此山奈酚也能在一定程度上改善PCOS癥狀。木犀草素可以使PCOS大鼠發(fā)情周期正?；?，減少囊狀擴(kuò)張卵泡及黃體丟失、降低LH和T水平；能通過(guò)上調(diào)PI3K p85α及pAKT蛋白水平、改善IR；還能恢復(fù)Nrf2通路、增強(qiáng)大鼠的抗氧化反應(yīng)，在治療PCOS方面具有一定潛力[39]。豆甾醇能顯著減輕T2DM小鼠的IR水平、改善空腹血糖及血脂。此外，豆甾醇改善IR可能與增強(qiáng)小鼠骨骼肌和白色脂肪組織中的GLUT4的表達(dá)有關(guān)[40]。綜上，半夏瀉心湯加減改善PCOS及IR是通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑的。

本研究PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，半夏瀉心湯加減治療PCOS及IR的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)包括ALB、AKT1、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、IL-6、TP53等。Akt1即蛋白激酶 B(AKT/PKB)的亞型之一，在多種組織中表達(dá)，是PI3K/AKT信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，活化的Akt可通過(guò)多種途徑調(diào)控胰島素的代謝，PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙在IR及PCOS的發(fā)生、發(fā)展中具有重要影響[41]。研究發(fā)現(xiàn)肥胖、MetS及PCOS患者體內(nèi)存在慢性炎癥反應(yīng)，促炎因子TNF-α、IL-6等又可以誘導(dǎo)IR的發(fā)生，IR屬于PCOS的重要病理表現(xiàn)[42-43]。PCOS大鼠模型血清中TNF-α、IL-6水平較正常組明顯升高[44]。高水平的IL-6 水平會(huì)刺激PCOS大鼠的脂肪細(xì)胞，激活A(yù)KT/STAT3 信號(hào)通路，促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖，加重代謝紊亂[45-46]。由此推測(cè)半夏瀉心湯加減可能是通過(guò)改善TNF-α、IL-6等炎癥因子、調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路達(dá)到治療PCOS及IR的目的。有研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者的胰島素、ALB等水平升高，但ALB與PCOS、IR之間的關(guān)系尚缺乏研究證據(jù)，需進(jìn)一步觀察探索[47]。抑癌基因TP53位于17號(hào)染色體的短臂上(17p13)。癌癥中普遍存在TP53體細(xì)胞突變及TP53蛋白(p53)失活。多達(dá)50%的人類腫瘤存在兩個(gè)TP53等位基因的突變。PCOS及IR患者與TP53基因的關(guān)系仍有待深入研究[48]。因此，半夏瀉心湯加減調(diào)控PCOS及IR的生物過(guò)程可能有TNF-α、IL-6、AKT1等因子的參與。本研究采用實(shí)驗(yàn)證實(shí)半夏瀉心湯加減能夠降低PCOS IR大鼠血清IL-6的表達(dá)及大鼠卵巢組織的IL-6蛋白表達(dá)水平。從分子機(jī)制為半夏瀉心湯加減改善PCOS IR提供了依據(jù)。

KEGG通路分析顯示，半夏瀉心湯加減可調(diào)控癌癥、乙型肝炎、PI3K-Akt、MAPK、TNF等信號(hào)通路。PCOS患者存在子宮內(nèi)膜孕激素抵抗現(xiàn)象，可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性下降，顯著增加子宮內(nèi)膜不典型增生和癌癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[49]。有研究觀察了423例代謝綜合征的患者，其中，感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)患者的空腹血糖(fasting blood glucos,FBG)、HOMA-IR高于未感染HBV的患者，提示HBV感染可能與IR發(fā)生有關(guān)[50]；但乙型肝炎與PCOS的聯(lián)系還有待研究。TNF可參與全身的炎癥反應(yīng)，多由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，TNF與受體結(jié)合后會(huì)觸發(fā)NF-κB等途徑的激活。NF-κB及MAPK信號(hào)通路與IR的發(fā)生有關(guān)[51]，同時(shí)，PCOS患者也存在NF-κB、MAPK等信號(hào)通路傳導(dǎo)異常的狀態(tài)[52-53]。分析結(jié)果說(shuō)明半夏瀉心湯加減可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、糖代謝等過(guò)程改善PCOS及IR。

綜上所述，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與生物信息學(xué)等從“異病同治”角度探討了半夏瀉心湯加減治療PCOS和IR的共同機(jī)制，結(jié)果提示中醫(yī)藥改善疾病具有多靶點(diǎn)、多通路的途徑，為臨床運(yùn)用半夏瀉心湯加減治療PCOS和IR提供了一定的依據(jù)。但是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法論仍存在局限性，如不同數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)容的差異、中藥成分在煎煮時(shí)發(fā)生的復(fù)雜變化等。因此，后續(xù)仍需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究來(lái)明晰半夏瀉心湯加減治療PCOS和IR的具體作用機(jī)制。