石金杰 劉宏瀟

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)2019級碩士研究生,北京 100029；2.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院風(fēng)濕病科，北京 100053)

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)多發(fā)生于青壯年男性群體，是以中軸關(guān)節(jié)附著點(diǎn)炎癥為主要表現(xiàn)的慢性免疫性炎性疾病，嚴(yán)重者可引起脊柱強(qiáng)直和纖維化，造成不同程度多系統(tǒng)病變。我國AS患病率約為0.3%，具有遺傳性，有較高的致殘率，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，晚期發(fā)生脊柱強(qiáng)直、關(guān)節(jié)畸形后病情不可逆轉(zhuǎn)，因此減少致殘率的關(guān)鍵在于早診斷、早治療[1-3]?，F(xiàn)代生物制劑雖可有效抑制炎癥，但價格高，不易儲存，且在新骨形成方面的作用不甚理想。大量研究表明，中醫(yī)藥治療AS有一定的特色和優(yōu)勢，可從整體出發(fā)，辨證論治，因其個體化方案、多靶點(diǎn)、副作用少、價格居中的特點(diǎn)，逐漸成為當(dāng)今研究治療AS新型藥物的重要方向。

淫羊藿始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為小檗科植物，性溫，味辛、甘，入腎、肝經(jīng)，有溫腎壯陽、強(qiáng)筋健骨、祛風(fēng)除濕作用[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，淫羊藿具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理活性[5]，作為補(bǔ)腎類代表性藥物，臨床治療AS療效明確。因此，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度出發(fā)，探討淫羊藿治療AS的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 淫羊藿活性成分和作用靶點(diǎn)的查詢與篩選 運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，搜索關(guān)鍵詞“淫羊藿”，設(shè)定口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18，進(jìn)一步篩選其活性成分及對應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)。為標(biāo)準(zhǔn)化靶點(diǎn)信息，利用Perl軟件和Uniprot(https://www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫，將活性成分作用的靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范，獲取淫羊藿靶點(diǎn)。

1.2 AS疾病靶點(diǎn)篩選 以“Ankylosing Spondylitis”為檢索詞分別在GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行疾病基因靶點(diǎn)的查詢篩選，獲取AS目前確定的疾病靶點(diǎn)。

1.3 淫羊藿-AS交集靶點(diǎn)獲取及藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用韋恩在線繪制網(wǎng)站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲得淫羊藿靶點(diǎn)與AS疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)。將淫羊藿活性成分及淫羊藿與AS的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，進(jìn)行藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化，并進(jìn)行拓?fù)浞治?，再次篩選淫羊藿治療AS的主要活性成分。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將交集靶點(diǎn)輸入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)構(gòu)建 PPI網(wǎng)絡(luò)模型，生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，設(shè)置medium confidence參數(shù)為0.9，去除邊緣游離蛋白，其余設(shè)置均為默認(rèn)設(shè)置。利用Cytoscape 3.7.1軟件的分析插件MCODE對PPI網(wǎng)絡(luò)圖的拓?fù)鋵傩苑治龊凸δ苣K進(jìn)行分析，得到淫羊藿治療AS的核心靶點(diǎn)。

1.5 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 利用Metascape(https://metascape.org)平臺，將獲得的交集靶點(diǎn)輸入該平臺，以P<0.05為篩選條件，得到GO、KEGG富集分析結(jié)果，最終借助微生信平臺(https://www.bioinformatics.com.cn/)可視化。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿活性成分及作用靶點(diǎn)的獲取 經(jīng)藥代動力學(xué)[吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代謝(Metabolism)、排泄(Excretion)，ADME]分析后，獲取淫羊藿活性成分23種(見表1)，淫羊藿作用靶點(diǎn)201個。

2.2 AS疾病靶點(diǎn)的獲取 合并GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫得到的疾病靶點(diǎn)，并刪除重復(fù)靶點(diǎn)，最終得到2771個AS疾病靶點(diǎn)。

2.3 淫羊藿-AS交集靶點(diǎn)獲取及藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖 將篩選的淫羊藿與AS交集靶點(diǎn)繪制韋恩圖，最終得到68個交集靶點(diǎn)(見圖1)。運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件獲得藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖及可視化(見圖2)，深藍(lán)色橢圓形表示中藥淫羊藿，藍(lán)色菱形表示AS，黃色方形表示淫羊藿的活性成分，綠色橢圓形表示AS與淫羊藿的交集靶點(diǎn)。運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件中Network Analyzer工具對其進(jìn)行拓?fù)浞治?，得到連接度(Degree)、緊密度 (closeness centrality, CC) 及介度 (betweeness centrality,BC)結(jié)果。靶點(diǎn)之間邊的數(shù)量為靶點(diǎn)的Degree值，篩選Degree值前5的活性成分為淫羊藿治療AS的核心活性成分(見表2)。

表1 淫羊藿活性成分

圖1 淫羊藿-AS交集靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

表2 淫羊藿治療AS的核心活性成分

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將68個交集靶點(diǎn)輸入到STRING 11.0平臺，得到PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖3)。運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件對其進(jìn)行拓?fù)浞治鯠egree值，以Degree值為標(biāo)準(zhǔn)，圖中節(jié)點(diǎn)顏色越深、大小越大表示該靶點(diǎn)的Degree值越高，與其他靶點(diǎn)相關(guān)性越大,篩選Degree值前10的靶點(diǎn)為淫羊藿治療AS的核心靶點(diǎn)，即白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、CXC趨化因子配體8(CXCL8)、IL-1β、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、CC趨化因子配體2(CCL2)、IL-10、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、表皮生長因子受體(EGFR)為PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的核心靶點(diǎn)。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 將上述68個交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，將所得結(jié)果可視化。獲得1070條GO功能條目(P<0.05)，包括1291個生物過程(BP)、56個細(xì)胞組分(CC)、82個分子功能(MF)；KEGG通路富集分析獲得240條通路。以P值為標(biāo)準(zhǔn)，-LogP值越大表明富集程度越大，篩選每部分顯著性前10的條目繪制GO功能富集分析條形圖(見圖4)和顯著性前20的通路繪制KEGG通路富集分析條形圖(見圖5)。

由上述結(jié)果可知，BP與對脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、對細(xì)菌起源的分子的反應(yīng)(response to molecule of bacterial origin)、對細(xì)菌的反應(yīng)(response to bacterium)、炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)(regulation of inflammatory response)、防御反應(yīng)調(diào)節(jié)(regulation of defense response)等相關(guān)，CC與囊泡腔(vesicle lumen)、薄膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、分泌顆粒腔(secretory granule lumen)、胞質(zhì)囊腔(cytoplasmic vesicle lumen)等相關(guān)，MF與細(xì)胞因子活性(cytokine activity)、細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、受體配體活性(receptor ligand activity)、信號受體激活劑活性(signaling receptor activator activity)、信號受體調(diào)節(jié)劑活性(signaling receptor regulator activity)等相關(guān)，推測淫羊藿的活性成分主要通過調(diào)節(jié)以上功能來治療AS。

KEGG通路富集分析結(jié)果主要富集在IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(AGE-RAGE)信號通路、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、利什曼病(Leishmania infection)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)。此外與AS相關(guān)的通路還有輔助性T 淋巴細(xì)胞17(Th17)細(xì)胞分化信號通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號通路、T細(xì)胞受體信號通路等通路。

圖4 GO功能富集分析條形圖

圖5 KEGG通路富集分析條形圖

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AS屬腎痹、骨痹、大僂范疇。腎主骨生髓，若先天稟賦不足，腎氣虛衰，風(fēng)、寒、濕等外邪深侵腎督，督脈失養(yǎng)，阻滯經(jīng)絡(luò)、脊柱、關(guān)節(jié)等處，則發(fā)而為痹[6]，臨床可表現(xiàn)為關(guān)節(jié)屈伸不利、腰背疼痛、行動不便等癥狀。腎為先天之本，補(bǔ)腎類藥物可調(diào)節(jié)人體免疫，平衡免疫網(wǎng)絡(luò)。AS根本病機(jī)以腎虛為本，補(bǔ)腎強(qiáng)督法為基本治則貫穿始終。淫羊藿溫腎壯陽，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕，是治療AS補(bǔ)腎方中的代表藥物。

炎癥損傷和新骨形成是AS發(fā)病甚至致殘的重要機(jī)制，因此控制炎癥、延緩新骨形成具有重要的臨床意義，也是治療AS的首要目標(biāo)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿可通過調(diào)節(jié)Th17的分化及IL-17的表達(dá)水平,達(dá)到控制AS炎癥的作用[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿主要通過槲皮素、木犀草素、山奈酚、8-(3-甲基丁-2-烯基)-2-苯基色酮、脫水淫羊藿素、“C-Homoerythrinan,1,6-didehydro-3,15,16-trimethoxy-,(3-beta.)-”、淫羊藿苷等核心活性成分作用于IL-6、TNF、趨化因子CXCL8、IL-1β、VEGFA、MAPK1、CCL2、IL-10、ICAM-1、EGFR等核心靶點(diǎn)，從而達(dá)到發(fā)揮抑制炎癥、抗纖維化、保護(hù)軟骨的作用[8]。細(xì)胞因子在免疫反應(yīng)中交織成網(wǎng)絡(luò)并影響和調(diào)節(jié)細(xì)胞間的免疫應(yīng)答，大量研究表明，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)異常是AS病理機(jī)制的關(guān)鍵，在AS病理進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用[9]。TNF及處于其下游的IL-6是各類脊柱關(guān)節(jié)病的主要炎癥介質(zhì)，VEGF、IL-10、IL-1等細(xì)胞因子與AS疾病活動均相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素、木犀草素、山奈酚可通過抑制IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表達(dá)水平發(fā)揮抗炎作用[10-11]。木犀草素能降低由 TNF介導(dǎo)的IL-6、IL-8 、VEGF的表達(dá)，也可能通過NF-κB信號通路從而抑制免疫而產(chǎn)生抗炎作用[12]。吳漢軍等[13]研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素抑制小鼠T淋巴細(xì)胞增殖和活化的作用機(jī)制可能與抑制IL-2 mRNA、干擾素γ(INF-γ)mRNA的表達(dá)有關(guān)。淫羊藿苷在控制炎癥和延緩新骨形成方面發(fā)揮著重要作用，首先在控制炎癥方面，淫羊藿苷可以影響T淋巴細(xì)胞的功能,抑制Th1/Th17軸應(yīng)答而控制炎癥發(fā)展；在延緩新骨形成方面，淫羊藿苷可以通過調(diào)控細(xì)胞因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)而影響成纖維細(xì)胞向成骨型的分化[14]。

GO功能富集展示了淫羊藿治療AS的靶蛋白在細(xì)胞內(nèi)的存在位點(diǎn)、潛在分子及生物學(xué)過程。KEGG通路富集分析顯示，淫羊藿治療AS的生物學(xué)通路主要作用于IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、NF-κB信號通路、Th17細(xì)胞分化信號通路等。Th17/IL-17炎癥軸在AS炎癥中發(fā)揮了十分重要的作用[15-16]。炎癥細(xì)胞因子IL-17通過IL-6積累中性粒細(xì)胞，促使急性炎癥的發(fā)生，且有研究證實(shí)男性AS患者IL-17水平比女性患者高表達(dá)[17]。AGE-RAGE 的相互作用也在IL-17免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用，AGE 通過介導(dǎo) RAGE 表達(dá)上調(diào)，使IL-17A的分泌增加，從而促進(jìn)炎癥的發(fā)生[18]。TNF-α在AS患者的外周血中高表達(dá)，可造成患者關(guān)節(jié)局部一系列炎癥反應(yīng)，而IL-17A已被證明能增強(qiáng)TNF介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥和組織破壞能力，加強(qiáng)破骨細(xì)胞的活性和溶骨作用，從而損害關(guān)節(jié)[19]。多項(xiàng)研究證實(shí)，AS患者的血液呈高凝狀態(tài)，主要機(jī)制與TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17等細(xì)胞因子紊亂和NF-κB信號通路之間的相互作用相關(guān)[20]。

本研究從淫羊藿的物質(zhì)基礎(chǔ)出發(fā)，從生物信息學(xué)角度預(yù)測分析其核心活性成分槲皮素、木犀草素、山奈酚、淫羊藿苷等潛在活性成分可通過調(diào)控IL-17信號通路、TNF信號通路、NF-κB信號通路等多靶點(diǎn)、多途徑影響AS疾病進(jìn)展，可為中藥新藥的研發(fā)和臨床治療AS提供研究基礎(chǔ)和創(chuàng)新思路。