施韻 張玉娟

【摘要】目的：探討不同 pH 環(huán)境對(duì)胃上皮細(xì)胞系 GES-1蛋白質(zhì)組的影響。方法：購(gòu)置胃上皮細(xì)胞 GSE-1系，分別放置在不同試管中，完成分組、標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)組試管細(xì)胞使用由濃鹽酸（HCl）、氫氧化鈉（NaOH）將培養(yǎng)基pH.調(diào)節(jié)至6.8（酸性）、9.4（堿性），未經(jīng)調(diào)配的 RPMI.1640（pH.7.4）作為對(duì)照組，將 GES-1置于酸性、對(duì)照組、堿性3種pH.下培養(yǎng)。完成三組細(xì)胞總蛋白的提取，用 TMT（Tandem.Mass.Tags）技術(shù)對(duì) GSE-1細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析。借助搜庫(kù)軟件 Proteome.Discoverer.2.4（PD2.4，Thermo）檢索不同 run 的圖譜，根據(jù)檢索結(jié)果實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的鑒定與定量。結(jié)果：相同初始細(xì)胞量的GES-1在pH.6.8、.pH.7.4（CK）、pH.9.4條件下培養(yǎng)7.d后，細(xì)胞狀態(tài)呈現(xiàn)出明顯差異。而在 pH.9.4中培養(yǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)略微變圓，細(xì)胞密集度與對(duì)照組比有所下降，但總體來(lái)說(shuō)生長(zhǎng)狀況良好。與對(duì)照組比，在堿性環(huán)境中鑒定出的差異表達(dá)蛋白僅19個(gè)，其中只有1個(gè)為下調(diào)蛋白; GES-1在弱酸性環(huán)境下培養(yǎng)7.d 后蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生了較大變化，與對(duì)照組比共鑒定到136個(gè)差異表達(dá)蛋白，包含96個(gè)上調(diào)蛋白和40個(gè)下調(diào)蛋白。結(jié)論：胃上皮細(xì)胞 GES-1最適合在 pH.7.4的環(huán)境中生存，但是對(duì)堿性的耐受能力非常強(qiáng)，能在 pH.9.4的強(qiáng)堿性條件下保持較好的狀態(tài);而細(xì)胞對(duì)酸的耐受力相形見(jiàn)絀，僅僅在 pH.6.8的影響下便難以維持正常的生命活動(dòng)，多與不同環(huán)境下細(xì)胞的功能等有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】環(huán)境 pH;胃上皮細(xì)胞; TMT 定量蛋白質(zhì)組

【中圖分類(lèi)號(hào)】R573【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-5249（2022）06-0183-04

作為人體重要的消化器官，胃的重要性不言而喻。泌酸是胃消化過(guò)程中獨(dú)特而重要的環(huán)節(jié)[1]，與人體其他部位比，胃部環(huán)境 pH 波動(dòng)幅度大（pH 參考值2.0～7.4）[2]，某些物質(zhì)或藥物可破壞胃黏膜屏障， H+迅速向黏膜內(nèi)侵襲，引起一系列病理：當(dāng)人體胃部組織中分泌的胃酸過(guò)多，則會(huì)引起胃受損，增加胃潰瘍等疾病發(fā)生率;而胃酸缺乏，細(xì)菌容易在胃內(nèi)過(guò)度繁殖，進(jìn)而引發(fā)各種慢性胃黏膜炎病變[3]。同時(shí)，多種胃部疾病反過(guò)來(lái)也會(huì)影響胃酸分泌。胃癌屬于發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤，且近年來(lái)疾病發(fā)生率呈上升趨勢(shì)。既往研究表明，造成我國(guó)胃癌高發(fā)的主要原因包括幽門(mén)螺桿菌感染（HP）、遺傳因素、飲食習(xí)慣、長(zhǎng)期精神壓力大等?，F(xiàn)有研究表明，胃癌發(fā)生與胃內(nèi)低酸環(huán)境相關(guān)[4]，隨胃癌病期進(jìn)展，腫瘤增大，各種亞型的胃癌無(wú)酸率均逐漸升高[5]。胃酸改變是胃部疾病的重要特征，因此，本研究在體外模擬了酸堿度改變后人胃黏膜上皮細(xì)胞株（GES-1）蛋白質(zhì)組表達(dá)情況的變化，以期從分子角度揭示胃酸對(duì)胃黏膜細(xì)胞的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與設(shè)備

二氯化鈷，購(gòu)自于Sigma 公司;胎牛血清、 DMEM 培養(yǎng)液，購(gòu)自于 Gibco公司;臺(tái)式高速低溫離心機(jī)，購(gòu)自于德國(guó)Herolab公司; Bradford 蛋白質(zhì)定量試劑盒，購(gòu)自于碧云天;基因擴(kuò)增儀，型號(hào)Proflex，購(gòu)自于 Life? Technologies 公司; Qubit 熒光計(jì)，型號(hào)： Qubit3.0，購(gòu)自于 Life Technologies 公司;臺(tái)式高速低溫離心機(jī)，購(gòu)自于德國(guó)Herolab公司;離心濃縮系統(tǒng)， DNA120，購(gòu)自于德國(guó) LEICA公司;蛋白酶抑制劑、 HPLC 水、能量吸收分子-芥子酸，購(gòu)自于美國(guó) Sigma 公司;細(xì)胞培養(yǎng)基，含有5%胎牛血清、1%間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、1%青鏈霉素雙抗，購(gòu)自于美國(guó)ScienCell公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

胃上皮細(xì)胞 GSE-1來(lái)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC），在添加有10%胎牛血清、100×青霉素-鏈霉素的RPMI 1640（pH 7.4）培養(yǎng)基中于37℃、5%CO2中培養(yǎng)，將細(xì)胞分別放置在不同試管中，完成分組、標(biāo)記。

實(shí)驗(yàn)組試管細(xì)胞使用由濃鹽酸（HCl）、氫氧化鈉（NaOH）將培養(yǎng)基 pH 調(diào)節(jié)至6.8（酸性）、9.4（堿性），未經(jīng)調(diào)配的RPMI 1640（pH 7.4）作為對(duì)照組，將 GES-1置于酸性、對(duì)照組、堿性3種 pH 下培養(yǎng)，每種 pH 各3個(gè)重復(fù)，7 d 后用胰酶消化，收集細(xì)胞沉淀進(jìn)行蛋白質(zhì)組測(cè)序，上述所有操作嚴(yán)格遵循儀器與試劑盒說(shuō)明書(shū)完成。

1.3總蛋白提取

從-80°C冰箱取出樣本，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，胰酶消化后收集細(xì)胞，采用冰預(yù)冷PBS 完成細(xì)胞2次清洗，向細(xì)胞中加入100μL Western 及 IP裂解液，并加入預(yù)先配制好的DB蛋白溶解液（pH=8.5）;充分振蕩后混合均勻;待上述操作完畢后，放置在超聲冰水浴中，連續(xù)完成裂解5 min，離心15 min，速度為12000 g，設(shè)定離心溫度為4℃，操作結(jié)束后取上清，加入DTT10 mM，在56℃下完成1 h反應(yīng)，加入足量IAM，1 h避光反應(yīng)[6-8]。使用 Bradford 蛋白質(zhì)定量試劑盒（購(gòu)自碧云天）進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，上述所有操作均按照Thermo? BCA Protein Assay 蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，并于96孔板中制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，保證線性系數(shù)在0.95以上，待測(cè)樣品設(shè)置兩個(gè)復(fù)孔，于37℃恒溫箱中連續(xù)進(jìn)行30min 孵育，然后于酶標(biāo)儀中570 nm 波長(zhǎng)下讀取吸亮度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出蛋白樣品濃度。

1.4蛋白質(zhì)組分析

用 TMT（Tandem Mass Tags）技術(shù)對(duì)GSE-1細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析。取蛋白樣品，酶切后標(biāo)記TMT（購(gòu)自Thermo）[9]。使用 L-3000 HPLC 系統(tǒng)進(jìn)行餾分分離，色譜柱為Waters BEH C18（4.6×250 mm，5μm），柱溫設(shè)為45°C。液質(zhì)檢測(cè)使用 Q ExactiveTM HF-X質(zhì)譜儀（購(gòu)自Thermo），NanosprayFlexTM（ESI）離子源，設(shè)定離子噴霧電壓為2.1 kV，離子傳輸管溫度為320°C。選取全掃描中離子強(qiáng)度TOP 40的母離子使用高能碰撞裂解（HCD）方法碎裂，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)，二級(jí)質(zhì)譜分辨率設(shè)為30000（200 m/z），C-trap最大容量為5×104，C-trap最大注入時(shí)間為54 ms，肽段碎裂碰撞能量設(shè)為32%，閾強(qiáng)度設(shè)為1.2×105，動(dòng)態(tài)排阻范圍設(shè)為20 s。

1.5蛋白質(zhì)鑒定與定量

借助搜庫(kù)軟件Proteome Discoverer 2.4（PD2.4，Thermo）檢索不同 run 的圖譜，根據(jù)檢索結(jié)果實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的鑒定與定量。對(duì)于檢索可信度>99%的譜肽（PSMs）稱(chēng)為可信PSMs。可信PSMs 中需至少包括一個(gè)特有肽段的蛋白質(zhì)（稱(chēng)為可信蛋白）。保留可信譜肽和可信蛋白并進(jìn)行驗(yàn)證;去除不符合要求的肽段和蛋白。借助T-tes t 檢驗(yàn)完成蛋白質(zhì)的定量分析，對(duì)于兩組定量存在差異的蛋白稱(chēng)為差異表達(dá)蛋白（DEP）。本實(shí)驗(yàn)選擇FC≥1.5（P ≤0.05）的蛋白為上調(diào)表達(dá)蛋白， FC≤0.67（P ≤0.05）的蛋白為下調(diào)表達(dá)蛋白，同時(shí)使用interproscan軟件對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO富集分析[10-11]。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

采用 SPSS 24.0軟件處理。計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，采用[ n（%）]表示;計(jì)量資料行 t 檢驗(yàn)，采用（±s）表示。若 P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同pH條件下GES-1的生長(zhǎng)狀態(tài)

相同初始細(xì)胞量的 GES-1在 pH 6.8、pH 7.4（CK）、 pH 9.4條件下培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞狀態(tài)呈現(xiàn)出明顯差異。見(jiàn)圖1。

RPMI 1640原本的 pH 值為7.4，以此作為對(duì)照組，在該條件下，胃上皮細(xì)胞形態(tài)正常，生長(zhǎng)狀況良好，細(xì)胞密集度較高。而在 pH 9.4中培養(yǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)略微變圓，細(xì)胞密集度與對(duì)照組比有所下降，但總體來(lái)說(shuō)生長(zhǎng)狀況良好。相比之下，細(xì)胞在 pH 6.8中培養(yǎng)后形態(tài)變化巨大，與兩外兩種條件下的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況比有肉眼可見(jiàn)的差異，細(xì)胞狀態(tài)整體較差，大部分細(xì)胞趨近于變圓、死亡，細(xì)胞數(shù)量也更少。這一結(jié)果表明，胃上皮細(xì)胞 GES-1最適合在 pH 7.4的環(huán)境中生存，但是對(duì)堿性的耐受能力非常強(qiáng)，能在 pH 9.4的強(qiáng)堿性條件下保持較好的狀態(tài);同時(shí)，細(xì)胞對(duì)酸的耐受力相形見(jiàn)絀，僅僅在 pH 6.8的影響下便難以維持正常的生命活動(dòng)，這一現(xiàn)象佐證了胃癌發(fā)生與胃內(nèi)低酸環(huán)境相關(guān)。

2.2 TMT定量質(zhì)譜分析

TMT技術(shù)利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白多肽N 末端或賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán)，經(jīng)高精度質(zhì)譜儀串聯(lián)分析，共鑒定出7564個(gè)蛋白質(zhì)，差異表達(dá)蛋白如火山圖所示，見(jiàn)圖2。與對(duì)照組比，在堿性環(huán)境中鑒定出的差異表達(dá)蛋白僅19個(gè)，其中只有1個(gè)為下調(diào)蛋白; GES-1在弱酸性環(huán)境下培養(yǎng)7 d后蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生了較大變化，與對(duì)照組比共鑒定到136個(gè)差異表達(dá)蛋白，包含96個(gè)上調(diào)蛋白和40個(gè)下調(diào)蛋白。以上定量質(zhì)譜結(jié)果與細(xì)胞在三種環(huán)境下的生長(zhǎng)狀態(tài)相符合。

2.3差異蛋白GO富集分析

分別對(duì)在堿性、酸性環(huán)境中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行 GO 功能富集分析。在堿性環(huán)境中差異表達(dá)的蛋白與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物大分子的合成、運(yùn)輸、加工有關(guān);在酸性環(huán)境中差異表達(dá)的蛋白傾向于膜蛋白，功能上通過(guò)改變氧化還原酶的活性來(lái)調(diào)控氧化還原過(guò)程，也與細(xì)胞的免疫應(yīng)激相關(guān)，見(jiàn)圖3。

3 討論

酸堿平衡是人體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素。對(duì)于正常細(xì)胞而言，細(xì)胞外液 pH 值為7.35～7.45[12]。但是，在一些病理或生理?xiàng)l件下，如：組織缺氧、酸中毒或堿中毒時(shí)， pH 能在6.5～8.1波動(dòng)，并由此引起血管張力改變，增加疾病發(fā)生率。既往研究表明， pH 是通過(guò)細(xì)胞內(nèi) pH 值影響細(xì)胞代謝及信號(hào)傳遞途徑，改變細(xì)胞的功能。胃是人體重要的消化器官，近年來(lái)隨著人們生活方式的改變，導(dǎo)致胃癌發(fā)生率呈上升趨勢(shì)。目前，胃癌是危害我國(guó)公共健康較為嚴(yán)重的惡性腫瘤之一，而我國(guó)最為胃癌高發(fā)國(guó)家，全球每年新發(fā)病例中，42%新發(fā)病例來(lái)自我國(guó)，發(fā)病人數(shù)超過(guò)40萬(wàn)人。多數(shù)胃癌由于癥狀不明顯，確診時(shí)常為晚期，導(dǎo)致患者臨床治療難度較大。因此，加強(qiáng)胃癌患者早期診斷及治療成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。

國(guó)外學(xué)者研究表明[13]，胃癌的發(fā)生是一個(gè)多因素過(guò)程，除了與遺傳因素有關(guān)外，亦與環(huán)境、生活方式存在緊密的聯(lián)系。既往研究表明，腫瘤微環(huán)境是適合腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的內(nèi)環(huán)境，環(huán)境中PH值等能直接參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。因此，研究不同 pH 值環(huán)境對(duì)位上皮細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)組的影響，能為臨床制定干預(yù)措施提供參考依據(jù)。目前，臨床上常見(jiàn)的胃部疾病較多，包括：胃潰瘍、胃癌等，發(fā)病后部分患者伴有出血。但是，由于患者發(fā)病后胃酸分泌量較多，能對(duì)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)的內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生影響[14]。本研究中，比較不同 pH 值下胃上皮細(xì)胞GES-1的生長(zhǎng)狀態(tài)，結(jié)果表明：胃上皮細(xì)胞 GES-1最適合在 pH 7.4的環(huán)境中生存，但是對(duì)堿性的耐受能力非常強(qiáng)，能在 pH 9.4的強(qiáng)堿性條件下保持較好的狀態(tài);同時(shí)，細(xì)胞對(duì)酸的耐受力相形見(jiàn)絀，僅僅在 pH 6.8的影響下便難以維持正常的生命活動(dòng)。從本研究結(jié)果看出，胃癌的發(fā)生多與胃內(nèi)低酸環(huán)境有關(guān)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象主要是由于，酸性環(huán)境下回破壞抗原抗體反應(yīng)的穩(wěn)定性，能破壞紅細(xì)胞的細(xì)胞膜，引起血紅蛋白抗原消失，并對(duì)胃上皮細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生突變，增加胃癌發(fā)生率。

定量蛋白質(zhì)組學(xué)（TMT技術(shù)）屬于是一種新型的技術(shù)，能實(shí)現(xiàn)基因組表達(dá)的全部蛋白，精準(zhǔn)的鑒定、測(cè)量混合體系內(nèi)的所有蛋白。目前， TMT技術(shù)廣泛用于尋找或篩選差異性表達(dá)蛋白，揭示不同細(xì)胞的病理和生理功能與作用[15]。為了進(jìn)一步分析不同 pH 環(huán)境對(duì)正常胃上皮細(xì)胞系 GES-1細(xì)胞蛋白質(zhì)組的影響，本研究中引入TMT技術(shù)，結(jié)果表明：與對(duì)照組比，在堿性環(huán)境中鑒定出的差異表達(dá)蛋白僅19個(gè)，其中只有1個(gè)為下調(diào)蛋白; GES-1在弱酸性環(huán)境下培養(yǎng)7 d后蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生了較大變化，與對(duì)照組比共鑒定到136個(gè)差異表達(dá)蛋白，包含96個(gè)上調(diào)蛋白和40個(gè)下調(diào)蛋白。以上定量質(zhì)譜結(jié)果與細(xì)胞在三種環(huán)境下的生長(zhǎng)狀態(tài)相符合，從本研究結(jié)果看出，弱酸性環(huán)境下，胃上皮細(xì)胞 GES-1蛋白發(fā)生明顯的變化，而堿性環(huán)境中蛋白發(fā)生變化相對(duì)較少。此外，本研究中分別對(duì)在堿性、酸性環(huán)境中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行 GO功能富集分析，進(jìn)一步驗(yàn)證不同 pH 環(huán)境下蛋白變化的原因，結(jié)果表明：對(duì)于堿性環(huán)境下胃上皮細(xì)胞 GES-1中差異蛋白相對(duì)較少，其蛋白差異可能與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等大分子的運(yùn)輸、合成及加工等有關(guān)。但是，在酸性環(huán)境下，差異蛋白數(shù)量較多，其功能亦發(fā)生明顯變化，多與細(xì)胞在該環(huán)境下細(xì)胞免疫應(yīng)激有關(guān)。

綜上所述，胃上皮細(xì)胞GES-1最適合在 pH 7.4的環(huán)境中生存，但是對(duì)堿性的耐受能力非常強(qiáng)，能在 pH 9.4的強(qiáng)堿性條件下保持較好的狀態(tài);而細(xì)胞對(duì)酸的耐受力相形見(jiàn)絀，僅僅在pH 6.8的影響下便難以維持正常的生命活動(dòng)，多與不同環(huán)境下細(xì)胞的功能等有關(guān)。

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（收稿日期：2021-11-15）