李建勇，王英超，李曉明，陳晞,張歡歡，張衛(wèi)華

（1.濟(jì)南海關(guān)技術(shù)中心，山東 濟(jì)南 250014；2.青島海關(guān)技術(shù)中心，山東 青島 266002；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014）

在口岸檢疫中，存在植物病原細(xì)菌分子檢測(cè)采用分子進(jìn)化標(biāo)記單一；種傳病害中致病菌的含量低而難以施檢；有些病原細(xì)菌的致病變種不能很好的區(qū)分；很多致病性細(xì)菌基因水平研究不夠深入，并且病原細(xì)菌在不同狀態(tài)下很容易發(fā)生變異，致使很多疾病在其發(fā)病早期無法檢測(cè)到或是被漏檢等問題，因此在植物檢疫領(lǐng)域，建立基于SELEX技術(shù)的植物病原細(xì)菌特異性寡核苷酸適配體的篩選，通過篩選到的寡核苷酸適配體，結(jié)合磁珠富集技術(shù)、表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface enhanced raman spectroscopy,SERS)技術(shù)進(jìn)行致病菌快速、高通量檢測(cè)，并形成體系[1]。表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）的檢測(cè)結(jié)果具有很好的特異性和準(zhǔn)確性，被廣泛用于不同生物分析以及完整細(xì)菌細(xì)胞的種屬和品系的鑒定。通過拉曼光譜儀檢測(cè)出分子的特征電磁波，省去微生物鑒定中的預(yù)增菌、提取和純化等步驟，從而節(jié)省時(shí)間。表面增強(qiáng)拉曼光譜增強(qiáng)基底有金納米顆粒、銀納米顆粒、其他重金屬納米顆粒，以及多樣的核/殼結(jié)構(gòu)納米顆粒、硅片和復(fù)合材料等。本研究主要是利用已經(jīng)獲得的丁香假單胞菌豌豆致病變種特異性核酸適配體Ppi1，分別生物素化和巰基化后得到生物素化和巰基化的Ppi1。以適配體修飾的磁性納米顆粒（四氧化三鐵）作為捕獲探針，巰基苯甲酸與丁香假單胞菌豌豆致病變種(Pseudomonas syringae pv.Pisi)適配體同時(shí)修飾的金納米顆粒作為信號(hào)探針，利用表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)實(shí)現(xiàn)丁香假單胞菌豌豆致病變種(Pseudomonas syringae pv.Pisi)檢疫鑒定；不僅為植物病原細(xì)菌致病變種和植原體病害的快速檢測(cè)方法建立奠定基礎(chǔ)，而且實(shí)現(xiàn)了植物病原菌快速檢測(cè)的整套解決方案。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Progeny便攜式增強(qiáng)拉曼光譜儀（Rigaku）；恒溫震蕩培養(yǎng)箱；高壓滅菌器（三洋）；低溫冰箱；培養(yǎng)皿；日立高速冷凍離心機(jī)（CF16RXⅡ）；超聲波清洗儀；PCR管；微量可調(diào)加樣器（2微升，10微升，20 微升，100 微升，200 微升，1000 微升）；加樣器槍頭（2-20微升，20-200微升，200-1000微升）。

1.2 供試實(shí)驗(yàn)材料和主要試劑

豌豆細(xì)菌性疫病菌捕獲探針采用巰基化的Ppi1適配體：

5‘SH-AGGTCAGATGTCACGCCCGCTCACT CCCGCCTGTTGTCCCCTCGCTCCCCCCTATGCGT-3’，大連寶生物合成。金納米顆粒，燕山大學(xué)劉志偉老師惠贈(zèng)；90%4-巰基苯甲酸；PBS緩沖液；

1.3 捕獲探針的制備

生物素化豌豆細(xì)菌性疫病菌適配體與親和素化磁性納米顆粒的結(jié)合，獲得捕獲探針。首先，取1 mL親和素化磁性納米顆粒于2 mL離心管中，加入10 μL，10μmol/L生物素化豌豆細(xì)菌性疫病菌適配體，在27℃搖床中反應(yīng)12 h，得到的產(chǎn)物用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液清洗三遍，儲(chǔ)存在4℃冰箱備用。

1.4 信號(hào)探針的設(shè)計(jì)和制備

巰基化豌豆細(xì)菌性疫病菌適配體、4-巰基苯甲酸修飾的金納米顆粒的制備。在1毫升的金納米顆粒溶液中加入0.1 mL，1 mmol/L 4-巰基苯甲酸。在搖床中反應(yīng)24 h（27℃，260 rpm）。離心去除未反應(yīng)的4-巰基苯甲酸，將沉淀分散在1 mL，10 mmol/LPBS緩沖液中，然后向該溶液中加入2 μL巰基化豌豆細(xì)菌性疫病菌適配體溶液在搖床中反應(yīng)24 h（27℃，260 rpm）。最后12,000 rpm離心25 min，去除未反應(yīng)的適配體，得到4-巰基苯甲酸修飾的金納米顆粒，放在4℃冰箱備用。

1.5 鑒定方法步驟

將培養(yǎng)的豌豆細(xì)菌性疫病菌(OD=0.4)菌液進(jìn)行梯度稀釋，取4個(gè)梯度進(jìn)行檢測(cè)，分別編號(hào)為L(zhǎng)M1、LM2、LM3、LM4，同時(shí)對(duì)每個(gè)梯度進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。將1.3得到的捕獲探針重分散于10 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，取100μL加入到2 mL離心管中，然后加入50 μL三個(gè)不同濃度的豌豆細(xì)菌性疫病菌菌液，充分混勻，置于搖床（27℃，260 rpm）中反應(yīng)60 min。生產(chǎn)的混合物通過外加磁場(chǎng)分離出來，用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液清洗三遍，重分散于50 μL 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，再向該反應(yīng)體系加入100μL信號(hào)探針，混合均勻，置于搖床（27℃，260 rpm）中反應(yīng) 60 min。 最后在磁場(chǎng)作用下分離，用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液清洗三遍，重分散于50 μL 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜測(cè)試。拉曼儀器參數(shù)中，影響拉曼信號(hào)主要為掃描功率和掃描時(shí)間，綜合考慮，拉曼儀器參數(shù)設(shè)置為：儀器功率1000nm，掃描功率280 mW；掃描時(shí)間10 s。以不加豌豆細(xì)菌性疫病菌為空白對(duì)照、加西瓜細(xì)菌性果斑病菌、十字花科黑斑病菌的為陰性對(duì)照，看其特異性。

2 結(jié)果與分析

由圖1-4可知，以適配體修飾的磁性納米顆粒（四氧化三鐵）作為捕獲探針，巰基苯甲酸與丁香假單胞菌豌豆致病變種 (Pseudomonas syringae pv.Pisi)適配體同時(shí)修飾的金納米顆粒作為信號(hào)探針，能夠利用表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)實(shí)現(xiàn)丁香假單胞菌豌豆致病變種(Pseudomonas syringae pv.Pisi)檢疫鑒定，在580cm-1和930 cm-1出現(xiàn)特征峰，而空白對(duì)照（參見圖7）和陰性對(duì)照（參見圖5和圖6）均未出現(xiàn)上述特征峰。在其他條件不變的情況下，隨著濃度的遞減，拉曼信號(hào)也逐漸減弱，根據(jù)平板計(jì)數(shù)結(jié)果，LM1、LM2、LM3、LM4 的濃度分別為 105cfu/ml、104cfu/ml、103cfu/ml、102cfu/ml。

圖1 豌豆細(xì)菌性疫病菌LM1 SERS光譜圖

圖2 豌豆細(xì)菌性疫病菌LM2 SERS光譜圖

圖3 豌豆細(xì)菌性疫病菌LM3 SERS光譜圖

圖4 豌豆細(xì)菌性疫病菌LM4 SERS光譜圖

圖5 西瓜細(xì)菌性果斑病菌SERS光譜圖

圖6 十字花科黑斑病菌SERS光譜圖

圖7 對(duì)照SERS光譜圖

3 結(jié)論與討論

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)豌豆細(xì)菌性疫病菌分子檢測(cè)方面的報(bào)道，主要集中在普通PCR、實(shí)時(shí)熒光技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）、紅外光譜檢測(cè)技術(shù)等技術(shù)[2-7]。而基于SELEX技術(shù)篩選豌豆細(xì)菌性疫病菌特異性的核酸適配體，并且將核酸適配體結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)進(jìn)行豌豆細(xì)菌性疫病菌菌的鑒定還鮮有報(bào)道。因此，本研究具有一定的創(chuàng)新性。

本研究基于豌豆細(xì)菌性疫病菌適配體修飾的磁性納米顆粒（四氧化三鐵）作為捕獲探針，巰基苯甲酸與豌豆細(xì)菌性疫病菌適配體同時(shí)修飾的金納米顆粒作為信號(hào)探針，能夠利用表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)實(shí)現(xiàn)豌豆細(xì)菌性疫病菌的檢疫鑒定；并且具有一定的特異性。該方法具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單、快速，周期短，僅耗時(shí)幾十秒左右。能夠較好的滿足口岸檢疫及“大通關(guān)”工程的需要，為保護(hù)我國(guó)的農(nóng)產(chǎn)品出口安全提供了強(qiáng)有力的技術(shù)保障。

由于時(shí)間和經(jīng)費(fèi)所限，本研究后續(xù)工作還需要對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，選擇更多的對(duì)照菌驗(yàn)證方法的特異性，比較該方法與常規(guī)檢測(cè)方法的靈敏度存在的差別；在復(fù)雜環(huán)境下，在不分離純化細(xì)菌條件下鑒定出目標(biāo)菌等；進(jìn)一步提高該方法的適用性，靈敏度，重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。