郭嚴冬 張明霞 周義峰 戴錫玲 王全喜 曹建國*

（1. 江蘇省中國科學院植物研究所，南京210014；2. 上海師范大學生命科學學院，上海200234）

近些年，結合其他技術對蕨類植物的研究有所增多。通過顯微鏡和切片技術可以觀察到植物各器官的組織結構和發(fā)育過程，但細胞內(nèi)一些細胞器以及糖類和脂類等生物大分子隨發(fā)育發(fā)生的一些動態(tài)變化以及分布情況則需要結合組織化學染色等手段進行深入研究。早期，組織化學多用于醫(yī)學藥學方面的研究，如張作干對核蛋白分化染色的改變進行了觀察；胡適宜等利用光鏡結合組織化學染色對環(huán)氧樹脂厚切片中多糖、蛋白質和脂類進行了鑒定。目前，利用組織化學方法鑒定細胞內(nèi)的糖類、蛋白質和脂類等大分子物質已日益完善，成為了研究細胞內(nèi)組織化學成分分布和動態(tài)變化的重要方法。將組織化學染色應用于蕨類植物卵發(fā)生過程的研究，可以定性和定位蕨類植物性器官發(fā)生過程中細胞器以及一些重要的大分子物質，為蕨類植物生殖生物學的深入研究奠定基礎。

Bell等的研究結果顯示：蕨（var.（Desv.）Underw. ex Heller）從配子體發(fā)育至卵細胞成熟經(jīng)歷了初生細胞階段、中央細胞階段、幼卵階段和發(fā)育卵階段4 個階段。相關研究結果還顯示一些原始種類如雙扇蕨（（Kaulf.）Reinw.）等的卵在卵發(fā)生過程中始終含有豐富的淀粉粒，并且不產(chǎn)生核外突。Cao 等的研究結果顯示：蕨類植物卵膜主要是由嗜鋨性的囊泡和內(nèi)質網(wǎng)片層堆疊于卵細胞質膜上表面形成的。這些研究表明不同類型蕨類植物卵細胞結構有所不同，且細胞器的發(fā)育也存在差異。

海金沙（（Thunb.）Sw.）演化地位特殊，且具有重要的藥用價值和觀賞價值。目前有關海金沙形態(tài)學和化學成分方面的研究已較為完善。而有關海金沙生殖生物學方面的報道并不多，對卵發(fā)生的細胞學研究內(nèi)容也不夠全面。并且，在海金沙卵發(fā)生過程中是如何產(chǎn)能與耗能的，一些主要的生物大分子在發(fā)育的各階段的分布情況等諸多問題還有待深入的探索。鑒于此，本文以海金沙為材料，采用組織化學的方法對其卵發(fā)生過程中細胞中糖類和脂類的變化進行研究，以期為闡明海金沙有性生殖的機制及蕨類有性生殖的演化過程提供科學證據(jù)。

1 材料與方法

供試海金沙配子體包埋塊由上海師范大學生命科學學院制備。使用PowerTome-XL 超薄切片和Hitachi-600 電鏡對頸卵器的位置和發(fā)育階段進行定位，卵發(fā)育每個階段定位后切取切片3～6片（切片厚度70 nm）用于組織化學實驗。采用Nikon E800光學顯微鏡觀察并照相。

取1～3 片切片放于培養(yǎng)皿，加入水（自來水）浸泡1 min，后經(jīng)質量體積分數(shù)1%的高碘酸氧化30 min，水沖洗1～2 次，加入錫夫試劑染色30 min，然后用水沖洗1 min，亞硫酸鈉漂洗液漂洗3次、每次2 min，再次用水沖洗3 min，最后用蒸餾水經(jīng)過；自然干燥后置于顯微鏡下觀察卵發(fā)育各階段的高碘酸-錫夫反應（PAS反應）情況。

將1～3 片切片置于體積分數(shù)70%乙醇中1～2 min，用體積分數(shù)0.3%蘇丹黑B 液（體積分數(shù)70%乙醇新鮮配制）染色，置于40 ℃條件下染色30 min；之后用體積分數(shù)70%乙醇分色1 min，水沖洗，蒸餾水經(jīng)過，自然干燥后置于顯微鏡下觀察卵發(fā)育各階段的蘇丹黑B染色反應情況。

2 結果和分析

PAS 反應檢測多糖類物質，染色呈紅色，海金沙卵發(fā)生的PAS 反應結果（圖版Ⅰ）顯示：原始細胞時期，頸卵器細胞內(nèi)出現(xiàn)紅色淀粉粒（圖版Ⅰ：1），但數(shù)量較少，周圍營養(yǎng)細胞中紅色淀粉粒數(shù)量較多。初生細胞時期，細胞內(nèi)的淀粉粒數(shù)量變少（圖版Ⅰ：2～3）。中央細胞至產(chǎn)生新卵，頸卵器細胞內(nèi)的淀粉粒數(shù)量逐漸增加，卵細胞中淀粉粒體積較頸溝和腹溝細胞的大（圖版Ⅰ：4～6）。卵發(fā)育時期，頸溝和腹溝細胞從邊緣開始慢慢退化，退化形成的物質呈紅色（圖版Ⅰ：7～8），說明這些退化的絮狀物質主要為多糖類物質。在卵細胞與腹溝細胞間形成分離腔和孔區(qū)時，卵細胞邊緣也出現(xiàn)了一定程度的退化，但PAS 反應顏色較淺（圖版Ⅰ：9～10），說明雖然卵細胞退化產(chǎn)生了一些多糖類物質，但沒有頸溝和腹溝細胞多。頸溝和腹溝細胞隨發(fā)育進一步退化，PAS 反應顏色較卵細胞周圍的顏色深，此時卵細胞上表面的細胞質膜處未觀察到有明顯的顏色加深，即未有多糖類物質積累在細胞質膜處。卵內(nèi)的淀粉粒已基本退化完全，壁細胞中仍有部分存在（圖版Ⅰ：9～11）。卵成熟時期，頸溝和腹溝細胞退化完全，大量絮狀物質充斥在細胞原有的位置，此時2個細胞間的界限還比較清晰，但卵細胞與周圍壁細胞間出現(xiàn)空腔，空腔中含有多糖類物質，而卵細胞中不含有淀粉粒。卵細胞上孔區(qū)消失，此時卵細胞上方細胞膜處仍未有多糖類物質出現(xiàn)（圖版Ⅰ：12～13）。隨后退化的物質會從頸溝處排出頸卵器外，卵細胞變形嚴重，卵細胞內(nèi)產(chǎn)生了一些PAS 反應為陽性的含多糖類物質的膜性結構，卵細胞上方形成空腔（圖版Ⅰ：14）。

圖版Ⅰ 海金沙卵發(fā)生的PAS反應1.原始細胞時期；2～3.初生細胞時期；4～5.中央細胞時期；6.幼卵時期；7～11.發(fā)育卵時期；12～14.成熟卵時期PlateⅠPAS reaction in the oogenesis of L.japonicum（Thunb.）Sw.1.Initial cell period；2?3.Primary cell period；4?5.Central cell period；6.Young egg period；7?11.Developmental egg period；12?14.Mature egg period

蘇丹黑B 反應檢測脂類物質，染色呈黑色，海金沙卵發(fā)生的蘇丹黑B 反應結果（圖版Ⅱ）顯示：初生細胞至新卵時期，頸卵器內(nèi)細胞基本無脂類的積累，壁細胞中出現(xiàn)了一些黑色的顆粒（圖版Ⅱ：1～3）。頸溝和腹溝細胞逐漸退化形成黑色絮狀物質，表明退化的物質中含有脂類物質，卵細胞內(nèi)的物質蘇丹黑B 染色呈陰性，說明此時卵細胞內(nèi)基本不含有脂類物質（圖版Ⅱ：4～5）。隨孔區(qū)及分離腔的形成，頸溝和腹溝細胞基本退化完全，卵細胞中出現(xiàn)了一些黑色顆粒。壁細胞中黑色顆粒數(shù)量有所減少（圖版Ⅱ：6～7）。成熟卵細胞變形嚴重，大部分細胞質和細胞器消失，體積減小，其中的黑色顆粒消失，卵細胞上方質膜并觀察到有脂類物質的積累（圖版Ⅱ：8～9）。

圖版Ⅱ 海金沙卵發(fā)生的蘇丹黑B反應1.初生細胞時期；2.中央細胞時期；3.幼卵時期；4～7.發(fā)育卵時期；8～9.成熟卵時期Plate Ⅱ Sudan black B reaction in the oogenesis of L.japonicum（Thunb.）Sw.1.Primary cell period；2.Central cell period；3.Young egg period；4?7.Developmental egg period；8?9.Matureegg perio d

總體上看，隨著海金沙卵細胞發(fā)育直至形成新卵，質體中淀粉粒逐漸積累；但從新卵發(fā)育到成熟卵，質體中淀粉粒體積逐漸減小、消失，說明分離腔、孔區(qū)的產(chǎn)生以及細胞核的變形等都是一個耗能的過程。觀察結果也顯示一些脂類顆粒也出現(xiàn)在孔區(qū)及分離腔的形成后的卵細胞中。

3 討論和結論

電鏡觀察結果顯示：海金沙成熟卵細胞上的分離腔中均會有絮狀物質出現(xiàn)，但隨發(fā)育這些絮狀物質會消失，形成空腔；且整個發(fā)育過程中均沒有典型卵膜的出現(xiàn)（另文發(fā)表）。本研究結果表明：在海金沙卵細胞發(fā)生早期細胞均含有質體，內(nèi)含淀粉粒，隨發(fā)育卵細胞以及頸溝和腹溝細胞內(nèi)淀粉粒數(shù)量和體積均有所減少，直至最后退化消失，其中，質體以及頸溝和腹溝細胞外產(chǎn)生的絮狀物質的PAS 反應均呈紅色，顯示為多糖類物質。但蘇丹黑B 研究表明：海金沙頸溝和腹溝細胞外產(chǎn)生的黏性物質也含有脂類物質，而卵細胞內(nèi)并未有明顯脂類物質產(chǎn)生。這從組織化學角度去驗證了這些絮狀物質的主要組成成分，也說明從卵細胞成熟至受精作用開始之前經(jīng)歷了較為復雜的能量產(chǎn)生與消耗過程。

問荊（Linn.）的組織化學研究結果表明：在問荊頸卵器發(fā)育早期，卵細胞以及腹溝和頸溝細胞中均含有淀粉粒；卵發(fā)育中期至后期，溝細胞中淀粉粒數(shù)量有所減少，但此階段會有脂類物質出現(xiàn)。Bao等對分株紫萁（Linn. var.Fernald）卵發(fā)生進行了觀察，發(fā)現(xiàn)卵細胞中造粉體中充滿著形狀不一的淀粉粒，但并未有孔區(qū)和典型卵膜的形成。本研究中，海金沙中多糖類和脂類物質出現(xiàn)時期以及動態(tài)變化基本與問荊類似，僅是淀粉數(shù)量及脂類含量略有差異。而其卵細胞呈現(xiàn)不典型卵膜的特征與分株紫萁相似，而孔區(qū)和分離腔的產(chǎn)生又類似于進化蕨類水蕨（（Linn.）Brongn.）。說明海金沙卵發(fā)生既具有原始蕨類的發(fā)育特征，又具有進化蕨類的發(fā)育特征。

綜上所述，海金沙卵發(fā)生過程中卵細胞內(nèi)的多糖類物質先增多再隨發(fā)育逐漸減少，說明卵發(fā)生也是一個逐漸消耗能量的過程，腹溝和頸溝細胞的退化物質（多糖類和脂類物質）還為可能對精子具有吸引作用。卵細胞質膜處并沒有糖類或脂類物質的積累。本研究從組織化學角度佐證了海金沙特殊的進化地位，即既有進化蕨類的卵發(fā)生特征（有孔區(qū)和分離腔形成），又有原始蕨類無典型卵膜的特征。