張陽，高聰聰，程玉豆，張曉宇，張立新*，關(guān)軍鋒*

（1.河北省農(nóng)林科學院生物技術(shù)與食品科學研究所，河北 石家莊 050051；2.河北省植物轉(zhuǎn)基因中心重點實驗室，河北石家莊 050051；3.山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院/農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所，山西 太原 030031）

‘紅香酥’梨是由‘庫爾勒香梨’和‘鵝梨’雜交培育而成的新品種，因其果實品質(zhì)上乘，果肉白嫩、多汁、香甜，深受消費者青睞，具有較高的食用和商業(yè)價值［1］。隨著其栽培面積逐漸擴大，加強貯藏保鮮意義重大。近年來，在河北省、山西省等冷庫發(fā)現(xiàn)，貯藏后期‘紅香酥’梨果實腐爛時有發(fā)生，對貯藏企業(yè)造成了一定的經(jīng)濟損失。因此，為了更好地采取有效措施減輕或控制‘紅香酥’梨采后腐爛，進行梨果實貯藏期間致腐病原物的鑒定和發(fā)病規(guī)律研究十分必要。

研究表明，果實貯藏病害主要以真菌為主，其中半知菌亞門真菌占據(jù)大多數(shù)，少量歸屬鞭毛菌亞門、接合菌亞門和子囊菌亞門［2］。目前關(guān)于梨果實貯藏期常發(fā)病害主要包括以下幾種類型：由半知菌亞門真菌Penicillium expansum導致的青霉病［3-4］，半知菌亞門真菌Alternaria alternate導致的黑斑病［5］、半知菌亞門真菌Botrytis cinerea導致的灰 霉 病［6］和 子 囊 菌 亞 門 真 菌Botryosphaeria do?thidea導致的輪紋?。?］等。然而，關(guān)于‘紅香酥’梨果實采后病害研究尚不夠系統(tǒng)。本研究在河北省代表性冷庫中進行‘紅香酥’梨果實病害調(diào)查和取樣，采用組織分離法對典型病斑進行真菌的純化，通過致病性檢測明確了病原菌，進一步運用形態(tài)學和分子學手段對病原菌進行分類學鑒定，確定其分類地位，最后研究病原菌的生物學特性，為‘紅香酥’梨果實采后病害的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病果的采集與病原菌分離純化

于2021年3 月采自河北省石家莊市趙縣（114°58'28″ E，37°47'3″ W）、晉 州（115°3'4″ E，38°1'44″W）和辛集市（115°13'22″ E，37°56'13″ W），從各地冷庫中采集‘紅香酥’梨腐爛果樣品后，在取樣袋2 h 內(nèi)運回實驗室進行分離試驗。參考方中達《植病研究方法第三版》［8］中的組織分離法，對典型病斑進行病原菌分離。從病斑處切取邊長約為5 mm的小塊方形果實組織（果皮帶果肉），在70%酒精中浸泡幾秒鐘，轉(zhuǎn)移至0.1%的酸性升汞中浸泡3 min 用無菌水洗3次，隨后置于PDA 培養(yǎng)基。培養(yǎng)3～5 d 后，從菌落邊緣挑取菌絲體轉(zhuǎn)移到新的PDA 培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)，如此純化2～3次，經(jīng)顯微鏡檢查證實無雜菌污染后即可確認為是單一的純菌落。將純化后的菌落接種到PDA 斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2 d 后置于4 ℃進行保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 柯赫氏法則驗證病原菌

使用10 mmol L-1PBS 緩沖液（生工生物工程股份有限公司，上海）將分離純化的菌株重懸混勻，用四層紗布過濾后得到孢子懸浮液，使用PBS緩沖液將孢子濃度調(diào)整為5×106mL-1。以大小一致、顏色均勻、無物理損傷的‘紅香酥’梨果實為材料，在2%次氯酸鈉溶液中消毒2 min，用去離子水沖洗3次，然后在干凈的工作臺中風干，用無菌針在每個果實赤道針刺出2個3 mm×3 mm 的方形傷口。取5 μL 孢子懸液（5×106mL-1）接種在每個傷口處，采取保鮮膜保濕的方法，在恒溫（25 ℃）、恒濕（95%）、黑暗條件下培養(yǎng)5 d。待果實發(fā)病后，按照1.1 中組織分離法從發(fā)病部位再次分離純化出與首次分離中相同的真菌，即為病原菌。

1.3 菌株的形態(tài)特征鑒定

將純化的菌株在PDA 培養(yǎng)基上活化，培養(yǎng)7 d后，挑取菌落邊緣少許菌絲體放在加有一滴水的載玻片上，加蓋玻片后在顯微鏡（OLYMPUS BX51，日本）下進行觀察。觀察孢子形態(tài)和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，拍照記錄，使用ImageJ 軟件（National Institutes of Health，Maryland，美國）測量孢子大小。

1.4 菌株的分子生物學鑒定

在分離得到4株病原真菌（Y001、Y002、Y003、Y004）的基礎上，取0.1 g 活化的真菌菌絲，使用液氮研磨成粉末，使用真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒（生工生物工程股份有限公司，上海）提取真菌的總DNA。根據(jù)文獻報道并結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫中序列的收錄情況，挑選了不同真菌中各自常用的保守基因作為構(gòu)建該菌進化樹的候選序列，例如真菌Penicillium中EF-1α 序列的報道不夠充分，很多重要的種中沒有相應的序列信息，因此選用BenA 基因進行建樹，具體引物使用信息如下：使用引物ITS1/ITS4（擴增ITS 部分序列）和EF1-728F/EF1-986R（擴增EF-1α 部分序列）對菌 株Y001、Y002 和Y003 的DNA 進 行 擴 增［9］，使用通用引物ITS1/ITS4 和Bt2a/Bt2b（擴增BenA部分序列）對菌株Y004 的DNA 進行擴增［10］，引物由生工生物工程股份有限公司（上海）合成，序列見 表1。PCR反應體系為50 μL：2×T5 Super PCR Mix（擎科生物技術(shù)有限公司，天津）25 μL，菌株DNA為1 μL，引物各1 μL，ddH2O 23 μL。PCR體系為：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸32 min；4 ℃保存。使用1%的瓊脂糖檢測PCR 擴增結(jié)果，120 V 電泳15 min，將條帶大小正確的DNA樣品送至生工生物工程股份有限公司（上海）進行雙向測序。

表1 引物信息Table 1 Primer information in this study

測序結(jié)果經(jīng)NCBI 網(wǎng)站在線BLAST 分析后，將菌株初步鑒定到屬水平。接著將各菌株的ITS與EF-1α 或BenA基因序列合并，使用軟件Mega5.1 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，使用鄰接法（Neighbor-Joining），自展值（Bootstrap）為1000。

1.5 分生孢子萌發(fā)特性

1.5.1 分生孢子體內(nèi)萌發(fā)觀察

使用無菌刀片在經(jīng)消毒的果實表面切一個5 mm 左右的圓形傷口，滴加5 μL 的孢子懸液（5×106mL-1）。將接種好的果實進行保鮮膜保濕，保持果實周圍溫度為25 ℃、濕度為95%。分別在接種后第0、24、48、72 h，使用超景深顯微鏡（DVM6A，Leica，德國）觀察分生孢子在果實接種處的萌發(fā)狀態(tài)，并拍照記錄。

1.5.2 溫度對分生孢子萌發(fā)的影響

在無菌載玻片上鋪一層水瓊脂（1%，w/v），待其凝固后滴加少量孢子懸液，并用玻璃棒輕輕地涂抹均勻。將制作好的帶菌載玻片置于帶有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中保持濕度，隨后在5、10、15、20、25、30、35 ℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。每2 h 使用顯微鏡觀察1次孢子萌發(fā)情況，并隨機選取100個孢子統(tǒng)計萌發(fā)率，共觀察10 h，重復3次。

1.5.3 濕度對分生孢子萌發(fā)的影響

按照濃硫酸濕度控制法，設置5個濕度條件分別為70%、80%、90%、100%、100%+ddH2O［11］。帶菌載玻片的制作方法同上，隨后在不同濕度的密封盒中恒溫培養(yǎng)（25 ℃）。6 h 后顯微鏡觀察孢子萌發(fā)情況，并隨機選取100個孢子統(tǒng)計萌發(fā)率，重復3次。

1.5.4 光照對分生孢子萌發(fā)的影響

使用載玻片萌發(fā)法檢測光照對分生孢子萌發(fā)的影響，使用LED日光燈為光源，光照條件分別為全光照、光暗交替（光照黑暗間隔時間為0.5 h）、全黑暗3個條件。帶菌載玻片的制作方法同上，隨后在不同光照條件培養(yǎng)箱中恒溫（25 ℃）、恒濕（95%）培養(yǎng)。每2 h 使用顯微鏡觀察1次孢子萌發(fā)情況，并隨機選取100個孢子統(tǒng)計萌發(fā)率，共觀察時間8 h。重復3次。

1.6 統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 8 軟件（GraphPad Inc.，CA，USA）對孢子萌發(fā)實驗進行統(tǒng)計分析和作圖，采用雙因素方差分析（ANOVA）檢驗不同處理的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離及柯赫氏法則驗證

通過組織分離法對果實腐爛部位進行病原菌的分離和純化，共分離純化出27個真菌菌株。經(jīng)過對菌落形態(tài)的差異分析，最終選定了4種具有代表性的菌落形態(tài)不同的真菌進行后續(xù)研究。將純化后的真菌回接至梨果實后，觀察發(fā)現(xiàn)病斑與初始病斑基本一致，從病斑處再次分離得到了相同的病原菌。

發(fā)病過程觀察結(jié)果表明，在高濕度條件下，所有菌株均會在發(fā)病部位產(chǎn)生大量的菌絲（圖1）。菌株Y001 和Y002 均導致果實表面形成深褐色圓形病斑，病斑凹陷明顯，病、健部位明顯分離，菌株Y001 的病斑擴展速度相對于菌株Y002 的病斑擴展速度較慢，在發(fā)病后期，2種病斑表面長有黑褐色霉狀物，且Y002 的菌絲量明顯較多。菌株Y003初期在果實上導致淺褐色病斑，病斑凹陷明顯，病、健部位明顯分離，擴展速度較快，后期在病斑表面長有大量白色菌絲。菌株Y004 初期在果實上導致淺褐色圓形病斑，且病斑表面凹陷，邊緣明顯，擴展十分迅速，病斑表面長有白色小疣狀發(fā)霉顆粒，后變?yōu)樗{色。因此，這4 株真菌均為導致‘紅香酥’梨果實腐爛的病原物，分別被命名為Y001、Y002、Y003 和Y004。

圖1 ‘紅香酥’梨果實真菌病害特征Fig.1 Disease symptoms of pathogenic fungi in‘Hongxiangsu’pear fruit

2.2 病原菌的形態(tài)學特征

經(jīng)單孢子培養(yǎng)和顯微觀察菌絲及孢子形態(tài)，對病原菌的形態(tài)學特征進行鑒定（圖2），菌株Y001 在平板上的菌落形態(tài)呈圓形，黃綠色菌絲，邊緣比較整齊；分生孢子為紡錘形，黃褐色，有分隔且縊縮，大小為（14.170～37.060）μm×（5.798～10.254）μm；分生孢子梗為黃褐色，分生孢子著生在梗的末端。菌株Y002 的菌落為圓形，最初菌落顏色為白色，后變?yōu)槟G色，呈絨毛狀，邊緣比較整齊；分生孢子為橢圓形或紡錘形，黃褐色，分隔處 縊 縮，大 小為（5.042～8.345）μm×（3.507～5.582）μm；分生孢子梗為黃褐色，分生孢子著生在其末端。菌株Y003 菌落為近圓形，菌落初為白色，后逐漸變?yōu)榉奂t色，邊緣整齊；分生孢子為兩端稍尖的鐮刀形或卵圓形，無色單孢子，無分隔，大 小為（10.802～18.458）μm×（3.878～5.166）μm；分生孢子梗無色，分生孢子著生在其側(cè)面。菌株Y004 的菌落呈圓形或不規(guī)則形狀，初為白色，后逐漸變綠，邊緣十分整齊；分生孢子為球形，無色單孢子，大小為（3.347～4.029）μm×（3.451～4.175）μm；分生孢子梗為帚狀，無色，分生孢子在其頂端串生。

圖2 ‘紅香酥’梨果實病原真菌的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of pathogenic fungi in fruits of‘Hongxiangsu’pear

2.3 病原菌的分子生物學鑒定

在形態(tài)學鑒定結(jié)果的基礎上，提取真菌菌株Y001、Y002、Y003 和Y004 的總DNA，根據(jù)文獻報道不同真菌所適合的引物進行PCR 擴增并測序。測序結(jié)果經(jīng)NCBI 網(wǎng)站在線BLAST 分析，初步鑒定到菌株的屬水平。進一步將各菌株測得的2個基因序列進行合并，使用NJ 方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖3），菌株Y001 和Y002 與Alternaria alternate、菌株Y003 與Fusarium proliferatum、菌株Y004 與Penicillium expansum菌株聚在一起。結(jié)合圖1 的形態(tài)學鑒定結(jié)果，基本明確了4 株菌株的分類學地位。

圖3 基于ITS 和EF-1α/BenA 基因序列的‘紅香酥’梨果實病原真菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of pathogenic fungi from fruits of‘Hongxiangsu’pear based on ITS and EF-1α/BenA gene sequences

2.4 孢子體內(nèi)萌發(fā)觀察

在果實傷口注射分生孢子，利用超景深顯微鏡觀察4個菌株在‘紅香酥’梨果實中的孢子動態(tài)萌發(fā)規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在放大約400～700 倍時，4株菌在接種第24 h 后分生孢子均無明顯差異跡象，而在接種第48 h 后可以明顯看到大量的分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲，在接種第72 h 后菌絲量增長迅速，幾乎掩蓋住整個傷口。菌株Y003 和Y004在放大約700 倍時，可以明顯看到其特異的分生孢子梗等部位（圖4）。

圖4 超景深顯微鏡觀察病原真菌孢子在‘紅香酥’梨果實上的萌發(fā)Fig.4 Observation on spore germination of four pathogenic fungi in‘Hongxiangsu’pear fruit by super depth of field microscope

2.5 溫度、濕度和光照對分生孢子體外萌發(fā)的影響

通過檢測不同溫度、濕度和光照條件下分生孢子的萌發(fā)率，以明確病原真菌分生孢子的生物學特征（圖5）。通過測定不同溫度下分生孢子隨時間的萌發(fā)率，菌株Y001 分生孢子在第4 h 時開始大量萌發(fā)，并且溫度為25、30 ℃時萌發(fā)率最高，第8 h 分生孢子的萌發(fā)接近100%。因此，Y001 的孢子最佳萌發(fā)溫度為25～30 ℃。菌株Y002 的分生孢子也是在第4 h 時開始大量萌發(fā)，且在20、25和30 ℃時萌發(fā)率最高，第6 h 萌發(fā)率接近100%。因此，Y002 的孢子最佳萌發(fā)溫度為20～30 ℃。菌株Y003 在第4 h 時，20、25、30 和35 ℃均略有萌發(fā)且25 ℃和30 ℃萌發(fā)最多，第6 h 時，孢子在25、30和35 ℃大量萌發(fā)，在第8 h 達到最高。因此，Y002的孢子最佳萌發(fā)溫度為25～30 ℃。菌株Y004 在前6 h 時均未萌發(fā)，第8 h 時溫度高于20 ℃的孢子均有少量萌發(fā)，第10 h 時大量萌發(fā)，且溫度為25 ℃時萌發(fā)率最高。因此，Y004 的孢子最佳萌發(fā)溫度為25 ℃。

圖5 溫度對‘紅香酥’梨4種病原菌孢子萌發(fā)率的影響Fig.5 Effect of temperature on spore germination rate of 4 pathogenic fungi in‘Hongxiangsu’pear fruit

通過濃硫酸控制濕度法，檢測恒溫培養(yǎng)8 h 后不同濕度條件對分生孢子萌發(fā)的影響。結(jié)果如圖6所示，當環(huán)境濕度為70%時，除菌株Y001 的分生孢子有微量萌發(fā)外（7%），其余3 株真菌的分生孢子均不萌發(fā)；當濕度為80%時，除菌株Y004 不萌發(fā)外，其余3個菌株均有萌發(fā)（32%～49%）；當濕度為90%時，4個菌株均有萌發(fā)，其中菌株Y002 的萌發(fā)最高（79%），Y004 的萌發(fā)率最低（30%）；當濕度為100%時，菌株Y003 的萌發(fā)率達到了90%，Y004 的萌發(fā)率為40%；當濕度為100%+ddH2O時，除了菌株Y004 的萌發(fā)率略低外（77%），其余3個菌株的孢子萌發(fā)率均接近100%。

圖6 濕度對‘紅香酥’梨4種病原菌孢子萌發(fā)率的影響Fig.6 Effect of humidity on spore germination rate of 4 pathogenic fungi in‘Hongxiangsu’pear fruit

當使用全光、全暗和光暗交替3種光條件處理分生孢子時，除了菌株Y003 外，其余菌的分生孢子萌發(fā)不受光照的影響（圖7）。菌株Y003 在受光照6 h 后開始大量萌發(fā)，而當光照時間達到8 h 時萌發(fā)率可達58%。光暗交替同樣可以促進菌株Y003 分生孢子的萌發(fā)，在第8 h 時萌發(fā)率達到60%，這說明，光照可促進菌株Y003 的孢子萌發(fā)。

圖7 光照對‘紅香酥’梨果實中4種病原菌孢子萌發(fā)的影響Fig.7 Effect of light on spore germination of 4 pathogenic fungi in‘Hongxiangsu’pear fruit

3 討論

果實病害是長期以來困擾果農(nóng)和貯藏企業(yè)的重要問題。本研究分離并鑒定出了4 株導致‘紅香酥’梨果實貯藏期的病原物，分別為2個鏈格孢屬真菌Alternaria alternateY001 和A. alternateY002，1個鐮刀菌屬真菌F. proliferatumY003 和1個青霉菌屬真菌P. expansumY004。

鏈格孢的寄主范圍很廣，且傳播方式多樣，侵染后會造成嚴重危害［12-14］。其中，由鏈格孢引起的梨黑斑病是世界范圍內(nèi)的重要病害，不僅侵害果樹上葉片和果實，還對貯藏期的果實健康造成嚴重威脅［15-16］。我國梨產(chǎn)區(qū)的主要鏈格孢主要分屬6個種：細極鏈格孢（A. tenuissima）、細鏈格孢（A.alternata）、喬木鏈格孢（A. arborescens）、梨黑斑鏈格孢（A. gaisen）、棉鏈格孢（A. gossypina）、長柄鏈格孢（A. longipes），其中A. tenuissima和A. al?ternata為優(yōu)勢種［17］。本研究分離鑒定出2 株引起‘紅香酥’梨貯藏期病害的鏈格孢菌Y001 和Y002，經(jīng)形態(tài)學和分子學鑒定均屬于細鏈格孢（A. alter?nate），并且試驗發(fā)現(xiàn)其孢子萌發(fā)受溫度和濕度影響較大，對光照不敏感（圖7）。

鐮刀菌在自然界中廣泛存在，不僅在小麥、玉米等大田作物上危害嚴重，而且可侵染多種果蔬作物，包括蘋果［18］、香蕉［19］、冬棗［20］、土豆［21］、洋蔥和大蒜［22］等。然而，很少有關(guān)于鐮刀菌引起的梨果實病害報道。近年，在翠冠梨中報道了1個可以引起果實腐爛的鐮刀菌，經(jīng)形態(tài)和分子鑒定為層出鐮刀菌F. proliferatum［23］，與本研究中分離得到的菌株Y003 歸為同1個種。因此，鐮刀菌在梨貯藏中所引起的病害應引起人們的重視。

青霉菌是果蔬采后貯藏中的常發(fā)真菌病害，主要由擴展青霉（P. expansum）、指狀青霉（P.digitatum）和意大利青霉（P. italicum）所引起。本研究從‘紅香酥’梨中分離純化出的菌株Y004 經(jīng)形態(tài)學和分子學鑒定為擴展青霉（P. expansum），與其它品種梨果實中報道的青霉菌的種類一致［24-25］，進一步說明擴展青霉在采后梨果實病害中分布十分廣泛。

分生孢子是子囊菌門真菌寄生在宿主上時產(chǎn)生的無性孢子，孢子萌發(fā)在真菌病原物的致病過程中具有重要作用［11，26］。與傳統(tǒng)的光學顯微鏡和電子顯微鏡不同，本研究通過運用超景深顯微鏡，直觀地觀察到4 株病原菌的分生孢子在梨果實體內(nèi)逐步萌發(fā)成為菌絲的動態(tài)過程，分生孢子在48 h即可在果實傷口產(chǎn)生大量的菌絲，說明在果實貯藏時期應加強對冷庫等貯藏空間的消毒等處理。孢子在萌發(fā)過程中受到多種環(huán)境因素的影響，明確孢子萌發(fā)條件，有利于通過調(diào)控貯藏條件來減少病害發(fā)生［27-29］。本研究通過控制環(huán)境溫度的變化檢測孢子萌發(fā)活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高溫顯著抑制了4種真菌的孢子的萌發(fā)，這可能是由于高溫導致孢子細胞內(nèi)大量活性氧自由基（ROS）的累積，進而對體內(nèi)的大分子蛋白和脂類造成過氧化損傷，從而表現(xiàn)出抑制孢子萌發(fā)效果［30］。另外，光照明顯影響了F. proliferatumY003 的孢子萌發(fā)，這與光照可能是某些真菌體內(nèi)的生物途徑的轉(zhuǎn)錄激活與抑制因子有關(guān)［31］。這些結(jié)果表明，在‘紅香酥’梨果實的采后和貨架期貯藏中應盡量保持低溫、低濕和避光狀態(tài)，從而降低A. alternata、F. pro?liferatum和P. expansum等真菌的孢子萌發(fā)活性，減少腐爛發(fā)生。

4 結(jié)論

組織分離法從河北省代表性冷庫的‘紅香酥’梨果實上分離出27 株真菌菌株，赫氏法則驗證了4株典型病原真菌的致病性；綜合其形態(tài)學和分子學特征明確了病原菌的分類學地位，4 株真菌分別被鑒定為Alternaria alternateY001，Alternaria al?ternateY002，F(xiàn)usarium proliferatumY003 和Peni?cillium expansumY004；超景深顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)梨果實上的分生孢子在48 h 內(nèi)即可萌發(fā)出大量的菌絲；溫度和濕度對4 株菌的孢子萌發(fā)有顯著影響，而光照可促進菌株Y003 的孢子萌發(fā)。