陳龍軍，林陳強，賈憲波，方 宇，張 慧，陳濟琛

（福建省農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意義】環(huán)糊精是由6個以上葡萄糖通過α-1,4-糖苷鍵連結形成的環(huán)狀低分子寡聚糖，根據(jù)組成的葡萄糖單體個數(shù)的不同（6～8個），分別稱為α-、β-、γ-環(huán)糊精[1-2]。由于環(huán)糊精分子具有特殊的外表親水、內里疏水的中空圓筒結構，能與許多客體分子形成包絡物，進而改變客體分子的溶解度、穩(wěn)定性等物理化學性質，因此在農(nóng)藥、食品、醫(yī)藥、化妝品和環(huán)保等領域具有廣泛的應用[3-5]。通常環(huán)糊精是由環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶（EC 2.4.1.19，簡稱CGTase）通過催化淀粉等底物的環(huán)化而形成。環(huán)糊精酶屬于α-淀粉酶家族，催化產(chǎn)生α-、β-、γ-環(huán)糊精的混合物，根據(jù)主要產(chǎn)物的不同，可分為α-、β-、γ-環(huán)糊精酶。另外環(huán)糊精酶除了催化環(huán)化反應外，還能催化耦合、水解、歧化等反應，是一種多功能復合酶[6-8]。鑒于環(huán)糊精的巨大應用價值，生產(chǎn)環(huán)糊精所必需的環(huán)糊精酶逐漸成為當今研究的熱點?！厩叭搜芯窟M展】傳統(tǒng)環(huán)糊精酶主要通過天然菌株的發(fā)酵獲取，但由于天然菌株本身不穩(wěn)定、產(chǎn)量低、發(fā)酵產(chǎn)物復雜不利于分離等困難，導致環(huán)糊精酶生產(chǎn)成本居高不下，進一步限制了環(huán)糊精的規(guī)?；瘧谩榱颂岣攮h(huán)糊精酶的產(chǎn)量，降低其生產(chǎn)成本，通過基因工程和蛋白質工程等技術，實現(xiàn)環(huán)糊精酶的異源高效表達，構建適用于工業(yè)化生產(chǎn)的菌株被認為是最有效的途徑之一?？莶菅堪麠U菌（Bacillus subtilis）作為傳統(tǒng)的工業(yè)生產(chǎn)菌株，遺傳背景清晰，無明顯密碼子偏好性，分泌能力強，易于培養(yǎng)，基因操作簡單，發(fā)酵工藝成熟，被認為是理想的外源蛋白質的分泌表達宿主菌[9-10]。張佳瑜等[11]將來源于軟化芽胞桿菌的α-環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶在枯草桿菌中進行表達，發(fā)酵優(yōu)化后α-環(huán)糊精酶活力達到4.9 U·mL-1，表達量是野生軟化芽胞桿菌表達量的9.8倍。外源蛋白質在枯草芽胞桿菌中的分泌表達依賴于信號肽的引導，主要有兩個途徑：Sec途徑和Tat途徑。對于同一種外源蛋白質，不同信號肽的引導分泌效率相差較大，兩者之間存在適配性[12]?？莶菅堪麠U菌信號肽由N端正電荷區(qū)（1～5個帶正電氨基酸）、H段疏水區(qū)（7～15疏水性氨基酸）及C端信號肽酶識別區(qū)（3～7個親水性氨基酸）組成。研究表明信號肽N端正電荷數(shù)、H端疏水性會影響目的蛋白在枯草芽胞桿菌中的分泌途徑（Sec、Tat途徑），從而影響目的蛋白的分泌效率。因此針對特定的蛋白質需要選擇合適的信號肽，優(yōu)化信號肽N端正電荷數(shù)對外源蛋白高效表達具有重要影響?！颈狙芯壳腥朦c】目前大多數(shù)研究集中在通過菌株發(fā)酵條件優(yōu)化、菌種誘變選育和不同外源表達系統(tǒng)來提高外源蛋白表達效率[13-14]，有關信號肽及信號肽序列優(yōu)化來提高外源蛋白表達仍鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】本實驗室在前期工作中從Geobacillus caldoxylosilyticus.CHB1中分離獲得一個新型α-環(huán)糊精酶，其最適反應溫度達到60 ℃，具有較好的熱穩(wěn)定性。該環(huán)糊精酶已在E. coli、芽胞桿菌及畢赤酵母中實現(xiàn)了克隆表達[15-17]。為了探索α-環(huán)糊精酶在枯草芽胞桿菌中的高效表達條件，本研究以來源于芽胞桿菌的173種信號肽為文庫，篩選適合于α-環(huán)糊精酶高效表達的信號肽。在此基礎上，對篩選獲得的信號肽N端氨基酸進行突變，通過優(yōu)化信號肽N端正電荷數(shù)，進一步實現(xiàn)α-環(huán)糊精酶在枯草芽胞桿菌中的高效分泌表達。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種和質粒 枯草芽胞桿菌環(huán)糊精酶表達載體pBE-aprE-CGT及重組Bacillus subtilisRIK1285 /pBE-aprE-CGT由本實驗室構建保存；Bacillus subtilisSecretory Protein Expression System（SP DNA mixture 173種分泌信號肽文庫）、the In-Fusion HD Cloning System及E.coliHST08 Premium Competent Cells購自大連寶生物工程（TaKaRa）有限公司。

1.1.2 試劑與儀器 限制性內切酶、TaqDNA聚合酶、DNA Mark、Protein Mark、T4 DNA連接酶、DNA切膠回收試劑盒和質?？焖偬崛≡噭┖校═aKaRa公司）；PCR引物合成、測序等由上海生工生物工程股份有限公司完成，其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。3-18K超高速冷凍離心機（Sigma公司），PCR儀（基因有限公司），Micro Pulser電穿孔儀（美國 Bio-Rad公司），Multiskan FC酶標儀（美國Thermo公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（種子培養(yǎng)基）：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，Amp 終質量濃度100 μg·mL-1。TB（發(fā)酵培養(yǎng)基）：甘油0.5%，蛋白胨1.2%，酵母粉2.4%，K2HPO41.64%，KH2PO40.23%。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因克隆和聚丙烯酰胺凝膠電泳 常規(guī)的分子克隆技術及蛋白表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析參照文獻[16]。

1.2.2 環(huán)糊精酶信號肽表達載體文庫的構建 以環(huán)糊精酶表達載體pBE-aprE-CGT為模板，在信號肽aprE上下游分別設計反向引物（M1:5′-CGCGTCCC TCTCCTT TTGCTTAAGT TCAGAGTAG-3′; E1: 5′-GGCCGGTGCACATATGGAGCTCGGTACCCTCG AG-3′），采用 PrimeSTAR Max DNA Polymerase對該表達載體進行線性化擴增。PCR 反應條件：98 ℃10 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s；循環(huán) 30 次；72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物用切膠回收試劑盒進行線性載體pBE-CGT長片段回收，備用。

將線性載體pBE-CGT與SP DNA mixture按比例混合，用5X In-Fusion HD Enzyme Premix進行同源重組，重組產(chǎn)物轉化受態(tài)細胞E.coliHST08，經(jīng)100 μg·mL-1氨芐青霉素抗性LB平板過夜培養(yǎng)，收集克隆子進行混合培養(yǎng)，提取混合質粒，構建環(huán)糊精酶信號肽表達載體庫pBE-SP-CGT。

1.2.3 重組枯草芽胞桿菌的構建 采用電轉化方法，冰浴融化感受態(tài)細胞Bacillus subtilisRIK1285 取100 μL與3 μL重組質粒pBE-SP-CGT混勻，設置電轉化參數(shù)（電擊參數(shù) 1 500 V、25 μF、200 Ω），將pBE-SP-CGT載體導入感受態(tài)Bacillus subtilisRIK1285中，于10 μg·mL-1卡那霉素抗性LB平板培養(yǎng)至轉化子出現(xiàn)（24～48 h），獲得重組Bacillus subtilisRIK1285/pBE-SP-CGT。

1.2.4 重組枯草芽胞桿菌的篩選表達與信號肽鑒定 種子液培養(yǎng)：挑取重組枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis單克隆于LB 培養(yǎng)基生長18 h；發(fā)酵培養(yǎng)：按1%接種量將種子發(fā)酵液接種至50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，在37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，進行誘導表達，于12 000 r·min-1離心2 min除菌體，收集上清液和菌體，測定α-環(huán)糊精酶活性。以重組Bacillus subtilisRIK1285 / pBE-aprECGT為對照，篩選α-環(huán)糊精酶活性高于對照的重組克隆子，提取該克隆子質粒，送上海生工生物工程股份有限公司進行測序，鑒定相應信號肽序列。

1.2.5 信號肽定點飽和突變 以篩選獲得表達效果最好的信號肽表達載體（pBE-citH-CGT）為模板，采用QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit，結合信號肽citH信號肽堿基序列及擬突變氨基酸位點設計19種氨基酸突變引物，如表1（Gly2，帶下劃線堿基序列為突變的氨基酸堿基密碼子）所示。以表1引物進行PCR擴增（95 ℃ 2 min；95 ℃20 s，60 ℃ 10 s，68 ℃ 4 min，20 個循環(huán)；68 ℃5 min），獲得包含突變信號肽的線性表達載體片段。該片段經(jīng)DpnI酶處理后，轉化大腸桿菌DH5α，于含 100 μg·mL-1氨芐青霉素抗性 LB 平板過夜培養(yǎng)，篩選轉化子測序鑒定突變結果，完成突變的19個信號肽突變表達載體轉化枯草芽胞桿菌Bacillus subtilisRIK1285進行環(huán)糊精酶表達，測定各突變子的環(huán)糊精酶表達活性。同理分別對N3、T4進行飽和突變（具體序列省略）。

表1 citH信號肽第二位Gly飽和突變引物Table 1 Primers for saturated mutation of G2

1.2.6 α-CGTase酶活性測定 測定 α-環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶活力的方法參照甲基橙褪色法[18]，具體操作如下：取0.9 mL預先用50 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液（pH 6.0）配制的3%（m/V）可溶性淀粉溶液于試管中，置于60 ℃水浴鍋內預熱2 min，然后加入粗酶液或適當稀釋的純酶液0.1 mL，反應10 min，立即加入1.0 mL 1 mol·L-1的鹽酸終止反應，再加入1.0 mL（pH6.0）的0.1 mmol·L-1的甲基橙溶液，混勻后于16 ℃下保溫20 min，用酶標儀測定波長505 nm處的吸光度并根據(jù)空白計算褪色程度（ΔA），最后根據(jù)α-環(huán)糊精標準曲線計算出α-環(huán)糊精的濃度。酶活性單位定義為：60 ℃，pH6.0下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol相應環(huán)糊精所需的酶量即為一個酶活力單位（U）。

1.3 α-CGTase的酶學性質分析

1.3.1 溫度 對 重 組 CGTase α-環(huán)化 活 性 的 影響 在pH6.0 條件下，將純酶液依次在 30 、40 、50 、60 、65 、70 ℃、80 ℃ 溫度下測定酶 α-環(huán)化活力大小，考察溫度對酶α-環(huán)化活性的影響，最適溫度下的酶活力定義為100%，計算相對酶α-環(huán)化活力。

1.3.2 溫度對重組α-CGTase熱穩(wěn)定性的影響 在pH6.0 條件下，將純酶液分別置于 40 、50 、60、70 、80 ℃ 的水浴中處理 30 、60 、90、120 min，結束后將酶液置于冰浴中冷卻，然后按照酶α-環(huán)化活力測定方法測定其酶活力，考察溫度對酶穩(wěn)定性的影響，未經(jīng)處理條件下的酶α-環(huán)化活力定義為100%，計算殘余酶α-環(huán)化活力。

1.3.3 pH 對重組 CGTase α-環(huán)化活性的影響 在 60 ℃下，將純酶液分別于pH為3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0緩沖液中，測定不同pH下的酶活力大小，考察pH對酶α-環(huán)化活性的影響，最適pH下的酶活力定義為100%，計算相對酶活力。

1.3.4 不同金屬離子對重組CGTase α-環(huán)化活性的影響 在反應體系中分別加10 mmol·L-1不同的金屬離子和抑制劑，測定其酶α-環(huán)化活力，考察不同金屬離子和抑制劑對酶α-環(huán)化活性的影響，以反應體系中不加入金屬離子和抑制劑作為對照，定義其酶活力100%，計算相對酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Origin pro 8處理并進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 信號肽表達載體庫構建

重組蛋白的分泌水平受信號肽種類的影響十分顯著。SP DNA mixture包含能編碼173種Bacillus subtilis分泌信號肽的DNA片段，本文運用同源重組的方法將線性載體pBE-CGT與SP DNA mixture進行同源整合獲得α-環(huán)糊精酶信號肽表達載體庫pBE-SP-CGT；并電轉化Bacillus subtilisRIK1285進行α-環(huán)糊精酶活性篩選，共篩選365個陽性轉化子，以Bacillus subtilisRIK1285/pBE-aprE-CGT表達菌株為對照，篩選獲得9條表達活性高于對照組的信號肽（citH、ybdG、amyE、nprE、bpr、bglS、bglC、sacB、yweA），結果如圖 1所示，其中尤以信號肽citH表達效果最好，胞外α-環(huán)糊精酶活性達（9.6±0.29） U·mL-1，是對照組[（5.3±0.22） U·mL-1]的 1.8倍，顯著高于對照組。α-環(huán)糊精酶主要以胞外形式進行分泌表達，胞外發(fā)酵上清蛋白電泳如圖2所示，與對照相比，在66.4～97.2 kDa有1條約75 kDa蛋白，與目標蛋白大小一致，不同信號肽表達環(huán)糊精酶蛋白亮度差異不明顯（表達量不高）。篩選獲得的9條信號肽氨基酸序列如表2所示。

表2 信號肽氨基酸序列表Table 2 Amino acid sequence of signal peptide

圖1 不同信號肽對目的蛋白的影響Fig. 1 Effects of signal peptides on target protein production

圖2 不同信號肽SDS-PAGE 電泳結果Fig. 2 SDS-PAGE analysis on signal peptides

2.2 citH信號肽優(yōu)化對α-環(huán)糊精酶分泌表達的影響

2.2.1 citH信號肽Gly2、Asn3、Thr4飽和突變對α-環(huán)糊精酶分泌表達的影響 以空載體pBE及pBE-citHCGT表達載體為對照，對信號肽citH的N端氨基酸序列中Gly2、Asn3、Thr4分別進行飽和突變，各突變體胞內、胞外α-環(huán)糊精酶活性變化如圖3、4、5所示。由圖3可看出，當Gly2突變?yōu)镚2A、G2K、G2L、G2V、G2R，胞外α-環(huán)糊精酶活性均高于對照，尤其是G2R顯著高于citH，使胞外α-環(huán)糊精酶活性由（9.6±0.29） U·mL-1提高到（10.7±0.27） U·mL-1，增加了11.5%。由圖4可知，當Asn3突變?yōu)镹3M、N3A、N3K、N3V、N3G、N3R時，信號肽更有利于α-環(huán)糊精酶的分泌表達，特別是N3K突變子顯著高于citH，使胞外 α-環(huán)糊精酶活性由（9.6±0.29 ）U·mL-1提高到（11.5±0.28） U·mL-1，增加了19.8%。同理對Thr4進行飽和突變（圖5），T4M、T4A、T4K、T4C、T4L、T4G、T4R 等7個突變信號肽表達效果均優(yōu)于對照，其中T4L顯著增加，使胞外α-環(huán)糊精酶活性由（9.6±0.29） U·mL-1提高到（11.8±0.21）U·mL-1，增加了22.9%。

圖3 citH信號肽Gly2飽和突變對α-環(huán)糊精酶分泌表達的影響Fig. 3 Effect of Gly2 saturation mutation of citH on α-CGTase activity

圖4 citH信號肽Asn3飽和突變對α-環(huán)糊精酶分泌表達的影響Fig. 4 Effect of Asn3 saturation mutation of citH on α-CGTase activity

圖5 citH信號肽Thr4飽和突變對α-環(huán)糊精酶分泌表達的影響Fig. 5 Effect of Thr4 saturation mutation of citH on α-CGTase activity

2.2.2 citH信號肽多點突變對α-環(huán)糊精酶分泌表達的影響 以空載體pBE及pBE-citH-CGT表達載體為對照，G2R、N3K、T4L突變信號肽為基礎，對信號肽citH的N端氨基酸序列進行組合突變，構建多點突變信號肽G2R-N3K-CGT、G2R-T4L-CGT、N3K-T4LCGT、G2R-N3K-T4L-CGT，各突變子分泌α-環(huán)糊精酶的能力如圖6所示。雙點、三點復合突變信號肽，分泌α-環(huán)糊精酶的能力均高于單點突變信號肽，呈顯著上升趨勢；尤其是三點突變G2R-N3K-T4L-CGT，分泌α-環(huán)糊精酶的能力最強，顯著高于pBE-citHCGT，其胞外α-環(huán)糊精酶活性由（9.6±0.29） U·mL-1增加到 （14.2±0.11） U·mL-1，提高了 47.9%。各突變信號肽表達環(huán)糊精酶胞外蛋白電泳分析如圖7所示，經(jīng)過3次突變后，G2R-N3K-T4L-CGT突變子蛋白條帶亮度略有提高，但不明顯。

圖6 citH信號肽多重突變對α-環(huán)糊精酶分泌表達的影響Fig. 6 Effect of multiple mutation of citH on α-CGTase activity

圖7 不同信號肽的SDS-PAGE 電泳圖分析Fig. 7 SDS-PAGE analysis on signal peptide mutant

2.3 重組α-環(huán)糊精酶的酶學性質

2.3.1 pH對重組α-環(huán)糊精酶活性的影響 由圖8可知，α-環(huán)糊精酶最適反應pH6.0，在pH3.0～6.0隨pH升高，相對酶活性呈上升趨勢，當pH大于6.0后，隨pH增加，酶活性逐漸降低。

圖8 pH對α-環(huán)糊精酶活力的影響Fig. 8 pH dependence of α-CGTase activity

2.3.2 溫度對重組α-環(huán)糊精酶活性的影響 由圖9可知，α-環(huán)糊精酶活力為30～80 ℃，呈先上升后下降的趨勢，當反應溫度為60 ℃時，α-環(huán)糊精酶活力最高，因此，該酶最適反應溫度為60 ℃。

圖9 溫度對α-環(huán)糊精酶活力的影響Fig. 9 Temperature dependence of α-CGTase activity

2.3.3 α-環(huán)糊精酶的熱穩(wěn)定性 α-環(huán)糊精酶在不同溫度下保溫不同時間，酶活力變化如圖10所示。當保溫溫度低于50 ℃時，經(jīng)過90 min保溫，α-環(huán)糊精酶相對酶活力仍能達到70 %以上，尤其是在40 ℃條件下保溫120 min，相對酶活力高達97.5 %，具有較好的熱穩(wěn)定性。當保溫溫度高于50 ℃時，隨著保溫時間延長，相對酶活力呈明顯下降趨勢，溫度越高，酶活力下降越明顯。

圖10 不同溫度下α-環(huán)糊精酶的熱穩(wěn)定性Fig. 10 Thermal stability of α-CGTase activity

2.3.4 不同金屬離子及抑制劑對重組α-環(huán)糊精酶活性的影響 不同金屬離子及抑制劑對α-環(huán)糊精酶活性的影響如圖11所示。Mg2+、Ca2+對α-環(huán)糊精酶活性具有顯著促進作用，10 mmol·L-1的 Mg2+、Ca2+使 α-環(huán)糊精酶活性達到117.9 %及121.9 %。而Cu2+、Mn2+、Na+、Zn2+、Al3+、EDTA、Trition、SDS 對 α-環(huán)糊精酶活性具有不同程度的抑制作用，其中Na+及SDS抑制作用顯著，α-環(huán)糊精酶活性降至初始值的72.1%及33.5%。此外Fe2+、Li+、K+對α-環(huán)糊精酶活性的影響不顯著。

圖11 不同金屬離子及抑制劑對α-環(huán)糊精酶活力的影響Fig. 11 Effect of metal ions and inhibitors on α-CGTase activity

3 討論

枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）是一種公認的符合食品安全標準的基因工程菌，在生物工程研究及食品工業(yè)中應用潛力巨大?？莶菅堪麠U菌含有173種信號肽，大量研究表明，外源蛋白的表達與特定信號肽之間存在著明顯的適配性；信號肽的結構特征、基因轉錄及翻譯水平的高低對蛋白分泌表達效率具有重要影響[19]。因此針對外源蛋白基因，建立信號肽庫，篩選與目標蛋白匹配度最高的信號肽，已經(jīng)成為提高外源蛋白分泌的有效手段。袁林等[20]對來源于枯草芽胞桿菌的9 種信號肽進行篩選，獲得引導PFA高效分泌表達的信號肽YfkN。與α-淀粉酶PFA的自身信號肽相比，表達量提高了約10倍。Guan C等[21]通過篩選來源于枯草芽胞桿菌的19種信號肽，獲得分泌表達氨基肽酶效率更優(yōu)的信號肽YncM，是氨基肽酶自身信號肽胞外表達效率的1.2倍。Zhang W等[22]通過篩選來源于枯草芽胞桿菌的138種信號肽（114個Sec和24個Tat途徑信號肽），獲得分泌堿性木聚糖酶效率較優(yōu)的信號肽PhoB。本研究以枯草芽胞桿菌173種信號肽為對象，篩選獲得了與α-環(huán)糊精酶分泌表達匹配度較優(yōu)信號肽9條，其中citH信號肽引導分泌α-環(huán)糊精酶活性是初始aprE信號肽的1.8倍，達到（9.6±0.29）U·mL-1。

有研究表明，外源蛋白的分泌表達并不完全決定于信號肽，其還與啟動子強弱、蛋白酶分泌量、信號肽mRNA的穩(wěn)定性差異、蛋白質跨膜過程涉及的分子伴侶及異位復合物的有效性、發(fā)酵誘導條件等有關[23-24]。祝發(fā)明等[25]通過定點突變使AmyX蛋白信號肽N端正電荷增加，H端疏水性降低，最終使β-半乳糖苷酶分泌效率提高了2.3倍。Caspers等[26]對來自枯草芽胞桿菌的信號肽Amy E的N端4個氨基酸進行突變，改變信號肽N端帶電荷數(shù)，研究突變信號肽對來源于Fusarium solanipisi的角質酶在枯草芽胞桿菌中分泌表達的影響，結果表明信號肽帶正電荷氨基酸數(shù)量與其分泌表達效率并無正相關性。袁林等[20]通過對信號肽Yfk N的N端中非正電荷氨基酸Ile3和Gln4進行飽和突變，獲得引導分泌效率更優(yōu)的突變體I3G/Q4R，亦表明信號肽Yfk N的N端帶正電荷數(shù)量與其引導PFA的分泌效率并無正相關性。本研究通過對信號肽citH信號肽的N端中非正電荷氨基酸Gly、Asn3、Thr4進行飽和突變，考察N端信號肽正電荷數(shù)變化對酶蛋白表達效率的影響，結果獲得多個表達效率更高的單突變體、雙突變體及三突變體信號肽，研究結果亦顯示信號肽citH的N端正電荷數(shù)量與α-環(huán)糊精酶分泌效率無明顯正相關性。

本研究對citH信號肽進行多點復合突變，獲得分泌表達效率更高的信號肽三點突變體G2R-N3KT4L，其引導分泌α-環(huán)糊精酶的胞外環(huán)化活性達到（14.2±0.11 ）U·mL-1，相比未突變信號肽 [（9.6±0.29） U·mL-1]，分泌效率提高了47.9%；是野生菌株嗜熱地芽胞桿菌Geobacillus caldoxylosilyticus.CHB1（0.66 U·mL-1）的 21.5倍[27]。本研究通過對枯草芽胞桿菌信號肽文庫的篩選與優(yōu)化，實現(xiàn)了α-環(huán)糊精酶在枯草芽胞桿菌中的高效表達，并研究了重組α-環(huán)糊精酶的酶學性質，其最適反應pH為6.0，最適反應溫度為60 ℃，在50 ℃范圍內穩(wěn)定；Mg2+、Ca2+對α-環(huán)糊精酶活性具有一定的激活。盡管本研究較大程度提高了α-環(huán)糊精酶胞外分泌表達能力，但其仍無法滿足規(guī)模化應用的要求，接下來的工作考慮通過更大范圍內信號肽篩選優(yōu)化及工程菌發(fā)酵條件優(yōu)化等進一步提高α-環(huán)糊精酶表達水平。