甕青芬，趙 卓，劉晨陽(yáng)，翟 卿

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

0 引言

【研究意義】玉帶鳳蝶（Papilio polytes）隸屬于鱗翅目Lepidopetera鳳蝶科Papilionoidea鳳蝶屬Papilio，幼蟲主要以柑橘屬、花椒等蕓香科植物為食，是柑橘和花椒的重要害蟲之一；國(guó)內(nèi)分布于秦嶺以南各省區(qū)，是蝶類里面為數(shù)不多的西藏和河南的共有種。國(guó)外主要分布在印度、日本、美國(guó)等地[1-2]。線粒體基因組具有進(jìn)化速率較快、母系遺傳、分子較小等特點(diǎn)，在昆蟲鑒定、物種進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建等方面應(yīng)用廣泛[3]。【前人研究進(jìn)展】目前對(duì)玉帶鳳蝶的研究主要集中在玉帶鳳蝶人工養(yǎng)殖與生物學(xué)特性、特異性化合物對(duì)求偶行為的調(diào)節(jié)、玉帶鳳蝶產(chǎn)卵偏好性、鐵蛋白功能表達(dá)、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等方面[4-6]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于玉帶鳳蝶線粒體基因組結(jié)構(gòu)的研究相對(duì)較少[7-8]，描述玉帶鳳蝶成蟲翅面特征和幼蟲齡期特征，分析構(gòu)成玉帶鳳蝶指名亞種Papilio polytes polytes和西藏亞種Papilio polytes tibetanus翅面特征不同的影響因素?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對(duì)玉帶鳳蝶（P. polytes）線粒體基因組測(cè)序、組裝，基因注釋，分析線粒體基因組序列結(jié)構(gòu)特征，以期豐富其基因組學(xué)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。此外，本研究還描述了玉帶鳳蝶指名亞種Papilio polytes polytes和西藏亞種Papilio polytes tibetanus的翅面特征。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集與保存

用于DNA提取與基因組測(cè)序的玉帶鳳蝶標(biāo)本，2019 年 8 月采集于寶天曼自然保護(hù)區(qū)（111°46′55″～112°03′32″E；33°20′12″～33°35′43″N），無(wú)水乙醇浸泡后保存于-20 ℃冰箱保存。

1.2 形態(tài)鑒定

形態(tài)鑒定主要根據(jù)翅面斑紋鑒定。

1.3 DNA提取與基因組測(cè)序

取玉帶鳳蝶成蟲胸部肌肉約30 mg，根據(jù)天根公司基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit）步驟提取總DNA，利用全波長(zhǎng)微量掃描分光光度計(jì)進(jìn)行DNA濃度檢測(cè)，檢測(cè)合格后（DNA含量超過100 ng ·μL-1）送往北京貝瑞和康公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 序列拼接與注釋分析

測(cè)序得到的原始序列通過GetOrganelle v1.7.3.5軟件進(jìn)行修剪、組裝拼接，自動(dòng)刪去質(zhì)量低的序列，得到的序列上傳至MITOS Web Sever（http://mitos.bioinf.uni-leipzig.de/index.py）進(jìn)行基因注釋，獲得線粒體基因組初注釋結(jié)果，再將13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因和2個(gè)rRNA基因進(jìn)行手動(dòng)矯正，將再根據(jù)矯正注釋的結(jié)果編制tbl文件，和fas文件一起提交至GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/?form=history&tool=genbank）獲得GenBank登錄號(hào)，為MZ188895，使用cox1基因在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比找近緣種，結(jié)果與形態(tài)鑒定一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征

玉帶鳳蝶指名亞種Papilio polytes polytes成蟲如圖1所示，中型蝶，翅展77-95 mm，雄蝶體黑色，尾突短。前翅外緣平滑，背面外緣區(qū)有7～9個(gè)黃色斑點(diǎn)，且從臀角到頂角斑點(diǎn)依次變小；后翅外緣波浪狀，背面外中區(qū)有6個(gè)乳白色斑塊和1個(gè)乳黃色斑塊，乳黃色斑被翅脈分隔成兩部分；前翅腹面斑紋同背面，顏色較淡；后翅腹面中帶斑紋同背面，外緣區(qū)有1列白斑，亞外緣區(qū)有7個(gè)月牙形白斑。雌蝶尾突較雄蝶長(zhǎng)，雌蝶前翅顏色較雄蝶淡；后翅背面外中區(qū)有2～6個(gè)斑，其中靠近后緣的1～2個(gè)長(zhǎng)斑呈紅色，亞外緣區(qū)有7個(gè)月牙形紅斑，其中近尾突處紅斑最小，臀區(qū)外緣有近似三角形的紅斑；前翅腹面顏色同背面，后翅腹面斑紋同背面，亞緣區(qū)有7個(gè)紅斑，比背面大且清晰。

圖1 玉帶鳳蝶指明亞種Fig. 1 P. polytes polytes

玉帶鳳蝶西藏亞種Papilio polytes tibetanus成蟲如圖2所示，雄蝶前翅背面外緣區(qū)有7個(gè)黃色斑點(diǎn)，后翅背面外中區(qū)有6個(gè)白斑點(diǎn)和1個(gè)黃斑點(diǎn)，臀角處有紅色和藍(lán)色2團(tuán)鱗片；后翅腹面亞外緣區(qū)有6個(gè)月牙形黃斑。雌蝶后翅背面外中區(qū)有6個(gè)斑，其中后緣的2個(gè)長(zhǎng)斑呈紅色，第3個(gè)長(zhǎng)斑靠近基部為白色，靠近端部為紅色，2個(gè)小斑呈黃色，亞外緣區(qū)有6個(gè)月牙形紅斑，其中近頂角處的1個(gè)紅斑比其余紅斑大；腹面后翅斑紋比背面復(fù)雜，外中區(qū)2個(gè)黃色小斑靠近外緣處比背面多1個(gè)紅色斑點(diǎn)，與相近的小黃斑幾乎連接，亞外緣區(qū)有7個(gè)斑點(diǎn)。

圖2 玉帶鳳蝶西藏亞種Fig. 2 P. polytes tibetanus

幼蟲如圖3所示，不同齡期幼蟲體色和形狀差異較大。1齡幼蟲黃白色，頭為暗黑色，各體節(jié)都生有1對(duì)刺狀突，后胸膨大；2齡幼蟲淡黃褐色，胸部、第8～9腹節(jié)背面和腹部末端有大塊白斑；3齡幼蟲深黃褐色，刺狀突變短，腹部末端枝刺黃色，頭部白斑變小，第8～9腹節(jié)背面和腹部末端的白斑破碎，不連成片；4齡幼蟲體型明顯變大，體色鮮綠，腹部背面有“X”形白斑、末端的黃色枝刺比3齡幼蟲細(xì)；5齡幼蟲深草綠色，后胸背面有齒狀紋，斑紋兩側(cè)各有1個(gè)橢圓形黑色眼斑，第4～6腹節(jié)背面兩側(cè)各有1斜紋，腹部末端白色。

圖3 玉帶鳳蝶各幼蟲時(shí)期的形態(tài)Fig. 3 P. polytes polytes and P. polytes tibetanus at larvae stage

2.2 線粒體基因組結(jié)構(gòu)

玉帶鳳蝶P. polytes線粒體基因組總長(zhǎng)度為15 267 bp，堿基含量表現(xiàn)明顯的AT偏好性，A+T平均含量為80.6%，詳見表1。線粒體基因組包括37個(gè)基因和一段非編碼區(qū)，GenBank登錄號(hào)為MZ188895，共有 11處基因間隔區(qū)，最長(zhǎng)的53 bp，在trnQ基因和nad2基因之間，有12處基因重疊區(qū)，最長(zhǎng)的為8 bp，在trnW基因和trnC基因之間，詳見表2。37個(gè)基因中，有23個(gè)基因在重鏈（Heavy strand）上，其中包括14個(gè)tRNAs、9個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因；14個(gè)基因在輕鏈（Light strand）上，其中包括2個(gè)rRNAs、8個(gè)tRNAs、4個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。線粒體基因組結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖4 玉帶鳳蝶線粒體基因組結(jié)構(gòu)Fig. 4 Structure of P. polytes mitochondrial genome

表1 玉帶鳳蝶線粒體基因組核苷酸組成Table 1 Nucleotide composition of P. polytes mitochondrial genome

表2 玉帶鳳蝶線粒體基因組結(jié)構(gòu)組成Table 2 Composition of P. polytes mitochondrial genome structure

2.3 蛋白質(zhì)編碼基因

13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因總長(zhǎng)度為11 209 bp，其中最長(zhǎng)的是nad5基因，長(zhǎng)度為1 737 bp，最短的是atp8基因，為168 bp。12個(gè)基因均是以典型的ATN為起始密碼子，僅有cox1基因是以特殊的TTG為起始密碼子；只有cox2終止密碼子不是TAA或TAG，而是以單獨(dú)的T結(jié)尾。相對(duì)密碼子使用頻率最高是UUA，為4.93，如表3，平均使用頻率最高的氨基酸是Leu（亮氨酸）。有8種氨基酸在13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因里均有出現(xiàn)，分別是Phe（苯丙氨酸）、Ile（異亮氨酸）、Lys（賴氨酸）、Leu（亮氨酸）、Met（蛋氨酸）、Gln（谷氨酰胺）、Ser（絲氨酸）、Tyr（酪氨酸）。Atp8基因里所含氨基酸種類最少，僅占總氨基酸種類的一半（10種）。

表3 玉帶鳳蝶線粒體基因組相對(duì)密碼子使用頻率Table 3 Relative synonymous codon usage of P. polytes mitochondrial genome

2.4 RNA基因與控制區(qū)

22個(gè)tRNAs總長(zhǎng)度為1 444 bp，基因長(zhǎng)度介于61 bp（trnS1基因）和70 bp（trnK基因）之間，除trnS1基因缺少DHU臂構(gòu)不成三葉草結(jié)構(gòu)外，其他21個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)均是典型的三葉草結(jié)構(gòu)，如圖5所示。堿基配對(duì)大多都是遵循Waston-Crick配對(duì)規(guī)律， G-U配對(duì)和U-U配對(duì)共有17處，其中G-U配對(duì)12處，U-U配對(duì)5處，有9個(gè)tRNAs基因未出現(xiàn)堿基錯(cuò)配。

圖5 玉帶鳳蝶22個(gè)tRNAs的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig. 5 Secondary structure of 22 tRNAs genes of P. polytes

2個(gè)rRNAs均位于輕鏈，rrnL基因位于trnL1基因和trnV基因之間，長(zhǎng)度為1 327 bp，rrnS基因位于trnV基因和控制區(qū)之間，長(zhǎng)度為780 bp。

控制區(qū)位于rrnS基因和trnM基因之間，長(zhǎng)度為444 bp，A+T的平均含量最高，為94.5%。

3 討論與結(jié)論

玉帶鳳蝶指名亞種和西藏亞種蝶翅面斑紋有較大區(qū)別：指名亞種雄蝶前翅背面外緣區(qū)黃斑有7～9個(gè)不等，而西藏亞種有7個(gè)且后翅背面臀角處有紅色和藍(lán)色2團(tuán)鱗片，指名亞種沒有；指名亞種后翅腹面亞緣區(qū)有7個(gè)白色斑，西藏亞種有6個(gè)黃色斑。指名亞種雌蝶后翅背面外中區(qū)有斑2～6個(gè)不等，其中靠近后緣的1～2個(gè)斑紅色，而西藏亞種有6個(gè)，其中后緣的2個(gè)斑紅色，第3個(gè)斑近基部白色、近端部為紅色，2個(gè)小斑黃色；指名亞種亞外緣區(qū)有月牙斑7個(gè)，西藏亞種6個(gè)；指名亞種后翅腹面亞緣區(qū)紅斑有6個(gè)，西藏亞種7個(gè)，指名亞種后翅腹面斑紋同背面，西藏亞種斑紋比背面復(fù)雜，外中區(qū)2個(gè)黃色小斑，近外緣處比背面多1個(gè)紅斑，與相近的小黃斑幾乎連接。指名亞種分布于陜西、河北、河南、湖南、湖北、山東、山西、江西、浙江、江蘇、廣西、廣東、福建等地，而西藏亞種僅分布在西藏，玉帶鳳蝶指名亞種和西藏亞種翅面斑紋的不同，與西藏特殊的地理位置、海拔和氣候條件氣候等有重要關(guān)系。

線粒體是細(xì)胞質(zhì)中為細(xì)胞生命活動(dòng)提供能量的細(xì)胞器。玉帶鳳蝶線粒體基因組中，37個(gè)基因的排列順序和方向與小紅珠絹蝶Parnassius nomion[9]、揚(yáng)眉線蛺蝶Limenitis helmanni[10]一致，基因trnM-trnI-trnQ的排列順序與研究較多的鞘翅目Coleoptera、直翅目Orthoptera等昆蟲線粒體基因組的trnI-trnQ-trnM的排列順序不一樣[11-12]，沒有出現(xiàn)基因重排與缺失的現(xiàn)象。2個(gè)rRNA的排列位置，說明了蝶類線粒體基因組進(jìn)化上比較保守。通過核苷酸組成分析，37個(gè)基因的A+T的平均含量明顯高于G+C的平均含量，表明玉帶鳳蝶線粒體基因組有明顯的AT偏向性，驗(yàn)證了昆蟲線粒體基因組有AT偏向性的特征。關(guān)于基因重疊現(xiàn)象，累計(jì)重疊序列31 bp，驗(yàn)證了線粒體基因組結(jié)構(gòu)緊密，編碼效率高的觀點(diǎn)[13]。13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中的cox1基因是以特殊的TTG作為起始密碼子，這種非正常的起始密碼子可以經(jīng)過轉(zhuǎn)換完成翻譯功能，研究表明，這種現(xiàn)象普遍存在于包括鱗翅目在內(nèi)的節(jié)肢動(dòng)物中[14-15]。cox2基因是以T作為終止密碼子，這種不完整的終止密碼子可以在RNA加工中經(jīng)過添加Poly A尾巴轉(zhuǎn)變?yōu)橥暾慕K止密碼子。22個(gè)tRNAs除trnS1基因外均為典型的三葉草結(jié)構(gòu)，堿基配對(duì)出現(xiàn)的非典型配對(duì)或錯(cuò)配可以通過編輯矯正，不影響轉(zhuǎn)運(yùn)功能[16]。與其他大多數(shù)種類的昆蟲相比，鱗翅目昆蟲的控制區(qū)與更為保守，有最高的A+T含量，證明了控制區(qū)又叫A+T富含區(qū)的科學(xué)性。

本研究玉帶鳳蝶指名亞種和西藏亞種外部形態(tài)的區(qū)別主要是由于地位分布位置的不同，玉帶鳳蝶線粒體基因組結(jié)構(gòu)和基因排列順序與鱗翅目昆蟲線粒體基因組結(jié)構(gòu)和排列一致，線粒體基因組總長(zhǎng)度為15 267 bp，有明顯的AT偏向性。