吳旭東，黃仕新，吳 鵬，徐長安，龍 騰 ，唐 旭

（1. 福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，福建 廈門，361021；2. 自然資源部第三海洋研究所，福建 廈門，361005）

0 引言

【研究意義】近年來，卷煙工業(yè)企業(yè)不斷優(yōu)化提升產(chǎn)品結(jié)構(gòu)，如何進(jìn)一步提高煙葉質(zhì)量和可用性、滿足卷煙品牌原料需求成為工業(yè)企業(yè)亟需解決的關(guān)鍵問題。篩選優(yōu)質(zhì)的煙用產(chǎn)纖維素酶菌株有助于緩解煙草行業(yè)中煙葉的等級結(jié)構(gòu)矛盾、部位結(jié)構(gòu)矛盾和區(qū)域結(jié)構(gòu)矛盾?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】纖維素是構(gòu)成煙葉細(xì)胞組織和骨架的基本物質(zhì)。煙葉中纖維素的含量一般在11%左右，隨著煙葉等級的降低而增加[1]。纖維素含量較高時(shí)，會使卷煙制品組織粗糙，煙葉燃燒后產(chǎn)生較強(qiáng)的嗆咳刺激感[2-4]。微生物及發(fā)酵酶制劑技術(shù)可以降低煙葉、煙草薄片及煙梗中纖維素等物質(zhì)的含量，促進(jìn)其內(nèi)部大分子有機(jī)物質(zhì)的分解和轉(zhuǎn)化，從而改善品質(zhì)，減少有害物質(zhì)產(chǎn)生[5-7]。國內(nèi)外學(xué)者利用生物技術(shù)對降低煙葉及煙梗中纖維素進(jìn)行了大量的研究工作。Gravely等[8]提出用曲霉屬（Asetgillusspp.）微生物來降解煙梗中的纖維素方法；葉建斌等[9]利用煙草中分離的類芽孢桿菌（Paenibacillusspp.）對再造煙葉原料進(jìn)行發(fā)酵處理，發(fā)現(xiàn)再造煙葉香氣增加，刺激性明顯減輕，感官品質(zhì)提升；于少藤等[10]使用從煙葉表面分離篩選到的產(chǎn)纖維素酶菌株（Pseudomonas gessardii）yc10對煙葉進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)煙葉纖維素降解率達(dá)23.49%，總糖含量增加，煙葉中香氣成分增加；王瑩等[7]和范堅(jiān)強(qiáng)等[11]從煙草中篩選了多個(gè)可降解大分子物質(zhì)的微生物，并利用所產(chǎn)纖維素酶和果膠酶混合處理煙絲，處理后煙絲纖維素失重率達(dá)到41.23%，煙氣細(xì)膩柔和，香氣飽滿，能有效提高煙草品質(zhì)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】為提高纖維素降解菌在卷煙生產(chǎn)過程中實(shí)際應(yīng)用的可行性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以37份片煙樣品作為研究對象，通過剛果紅染色法初篩，搖瓶液體復(fù)篩，測定菌株的CMC酶活，以分離篩選出適用于煙葉原料的高效降解纖維素菌株，通過形態(tài)特征觀察、生理生化和分子生物學(xué)方法，對篩選出的菌株進(jìn)行菌種鑒定，同時(shí)對該菌株所產(chǎn)纖維素酶的酶學(xué)特性進(jìn)行研究，為卷煙工業(yè)企業(yè)煙葉原料的保值增值提供優(yōu)質(zhì)菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品 實(shí)驗(yàn)所用樣品片煙來自云南、福建等國內(nèi)外煙葉主產(chǎn)區(qū)，見表1。

表1 樣品片煙來源Table 1 Source of flue-cured tobacco strip samples

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

液體富集培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）5 g，NH4NO31 g，酵母膏 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 5 g，NH4NO31 g，酵母膏 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41 g，瓊脂 18 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 5 g，胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.1.3 主要儀器和試劑 儀器：GR60DF全自動立式高壓滅菌鍋（廈門致微儀器有限公司），MQT-60R振蕩培養(yǎng)箱（上海旻泉儀器有限公司），SW-CJIFD超凈工作臺（蘇州凈化有限公司），生化培養(yǎng)箱（寧波萊福科技有限公司），徠卡顯微鏡DM570（徠卡儀器有限公司）。

試劑：剛果紅、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、葡萄糖等常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR引物由上海生工合成。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自上海賽百盛基因有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的富集與篩選 稱取碾碎后的片煙2 g置于50 mL液體富集培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h后，取富集后的培養(yǎng)液稀釋涂布至篩選培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48～72 h，再進(jìn)行剛果紅染色，選擇生長較好、透明圈較大的菌株接于斜面和LB固體培養(yǎng)基中。

1.2.2 DNS試劑制備 甲液配制：6.9 g結(jié)晶苯酚溶于15.2 mL 10% 氫氧化鈉，加蒸餾水稀釋至69 mL，再加6.9 g 亞硫酸氫鈉溶解備用；乙液配制：225 g酒石酸鉀鈉溶于300 mL 10% 氫氧化鈉，加入880 mL 1% 3,5-二硝基水楊酸。將甲、乙液混合于棕色瓶靜置7～10 d即可。

1.2.3 粗酶液的制備 將篩選得到的菌株接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min-1振蕩活化過夜后，按5%接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵24 h，獲得的發(fā)酵液在 4 ℃、10 000 r·min-1離心 6 min，所得上清液即為粗酶液，后續(xù)進(jìn)行酶活測定。

1.2.4 酶活力測定

1.2.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取6支10 mL刻度試管并編號，按表2分別加入質(zhì)量濃度為1.5 mg·mL-1的葡萄糖溶液、蒸餾水和DNS試劑，配成不同葡萄糖含量的反應(yīng)液。將各管搖勻后，沸水浴10 min，冷卻后加純水定容至10 mL，顛倒混勻后吸取200 μL至96孔板檢測OD540值，以葡萄糖質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，扣除空白后的OD540值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作參數(shù)Table 2 Parameter of glucose standard curve

1.2.4.2 CMC酶活測定 參考羅燕青等[12]的方法，進(jìn)行略微改動。在10 mL刻度試管中（3支實(shí)驗(yàn)管）加入0.2 mL稀釋酶液，加入1.8 mL 1%的CMC-Na溶液（pH 5），搖勻，于60 ℃條件下水浴10 min，取出冷卻至室溫，加入1.5 mL DNS試劑，迅速混勻后沸水浴反應(yīng)10 min，冷卻后，加水定容至10 mL，輕輕上下?lián)u勻，另取稀釋酶液0.2 mL和0.1 mol·L-1pH為5的緩沖溶液1.8 mL作為空白，不加CMC溶液，同樣依上述步驟，用空白調(diào)零點(diǎn)，于波長540 nm測吸光度值。

酶活力單位定義：在60 ℃，pH 5.0條件下，催化1% CMC-Na每分鐘生成1 μg還原糖所需的酶量作為 1 個(gè)酶活力單位 U（μg·min-1·mL-1）。

式中G：由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的葡萄糖質(zhì)量（mg）；N1：粗酶液稀釋倍數(shù)；N2：比色時(shí)反應(yīng)液稀釋倍數(shù)；103：毫克與微克的轉(zhuǎn)換；10：酶水解反應(yīng)時(shí)間（min）；0.2：測定酶活力時(shí)所用粗酶液的體積（mL）。

1.2.5 菌株的鑒定

1.2.5.1 形態(tài)觀察及生理生化特性 參照《伯杰氏菌手冊》[13]、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]觀察菌株的培養(yǎng)形態(tài)、革蘭氏染色與芽孢染色，并測定其生理生化特征。

1.2.5.2 分子生物學(xué)鑒定 按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（上海賽百盛）提取總DNA，使用標(biāo)準(zhǔn)引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴(kuò)增 16S rRNA序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一明亮條帶，切下條帶經(jīng)膠回收試劑盒（上海生工）回收PCR產(chǎn)物送測序公司（廣州基迪奧）進(jìn)行測序，測序結(jié)果上傳NCBI進(jìn)行BLAST分析，采用MEGA 5.1軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.6 纖維素酶酶學(xué)特性研究

1.2.6.1 最適反應(yīng)溫度的測定 在10 mL刻度試管中加入稀釋酶液與1%的CMC溶液（pH 5）后，于不同溫度 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃條件下水浴，其他條件同“1.2.4”的方法，測定不同溫度下CMC酶活。

1.2.6.2 最適反應(yīng)pH的測定 在上一步得出最適溫度條件下，設(shè)置加入1%的CMC溶液的pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其他條件同“1.2.4”的方法，進(jìn)行酶活反應(yīng)測定。

1.2.6.3 酶的熱穩(wěn)定性的測定 在進(jìn)行酶活反應(yīng)前，先將酶液分別置于 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃ 溫度下保溫 30 min，再按照“1.2.4”的方法，進(jìn)行酶活反應(yīng)測定。其中以未處理的酶液酶活力為100%，得到該纖維素酶對溫度的耐受力結(jié)果。

1.2.6.4 酶的酸堿穩(wěn)定性的測定 在進(jìn)行酶活反應(yīng)前，先將酶液分別于pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖液中，4 ℃保溫30 min后，再按照“1.2.4”的方法，進(jìn)行酶活反應(yīng)測定。其中以未處理的酶液酶活力為100%，得到該纖維素酶對溫度的耐受力結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與篩選

經(jīng)分離純化得到的菌株于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，通過剛果紅染色，比較水解圈直徑（H）和菌落直徑（C）大小，選擇比值較大的菌株進(jìn)行復(fù)篩，最終得到一株酶活力為56.261 U·mL-1的菌株，編號為FX-1，其剛果紅染色結(jié)果見表3，纖維素酶水解圈見圖1，以此作為后續(xù)研究對象。

圖1 菌株FX-1纖維素酶水解圈Fig. 1 Cellulase hydrolysis circle of FX-1

表3 FX-1菌株剛果紅染色結(jié)果Table 3 Congo red staining of FX-1

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)及生理生化鑒定 菌株FX-1在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，菌落為灰白色、干燥、表面有不規(guī)則隆起褶皺，邊緣毛刺狀，結(jié)果如圖2-A所示；透射電鏡觀察顯示菌體呈棒狀或近棒狀，長約為 1.6～2.2 μm，粗約 0.8～1.0 μm，多為 2 個(gè)或2個(gè)以上菌體鏈狀連接，結(jié)果如圖2-B所示；革蘭氏染色陽性，菌體呈現(xiàn)為桿狀，芽孢染色為綠色，菌體為紅色，芽孢中生，橢圓形，不膨大，結(jié)果如圖2-C、D所示；其部分生理生化特性見表4。根據(jù)這些特征，可初步判斷該菌株為芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）細(xì)菌。

圖2 菌株 FX-1 形態(tài)特征Fig. 2 Morphological characteristics of FX-1

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 FX-1的16S rRNA序列長度為1 416 bp，NCBI比對顯示FX-1的16S rRNA序列與Bacillus subtilis相似度最高（100%），進(jìn)一步使用MEGA軟件（版本5.1）利用NJ法構(gòu)建FX-1系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。結(jié)果顯示FX-1與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、特基拉芽孢桿菌（Bacillustequilensis）（相似度99.79%）處于同一分支，置信度為86%，結(jié)合生理生化特征（表4），將FX-1鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

表4 菌株FX-1的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characteristics of FX-1

圖3 FX-1菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of FX-1

2.3 酶活力測定

2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 由圖4可見，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.309 4x-0.010 2，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.998 4，線性良好，可以用于纖維素酶活測定。

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 4 Standard curve of glucose

2.3.2 纖維素酶活性分析 用不同發(fā)酵時(shí)間的粗酶液測定FX-1菌株的CMC酶活力，同時(shí)測定相應(yīng)時(shí)間菌株的生長量情況，結(jié)果如圖5，表明FX-1菌株在發(fā)酵48 h時(shí)纖維素酶酶活力最高，達(dá)56.261 U·mL-1，而其生物量最高時(shí)是在36 h。在48 h后，菌株的產(chǎn)酶活性隨著生物量的下降而有所降低，在一定時(shí)間內(nèi)二者呈正相關(guān)。由此可見，該纖維素酶合成模式屬于延續(xù)合成型[15]。

圖5 培養(yǎng)時(shí)間對菌株生長和產(chǎn)酶的影響Fig. 5 Effect of incubation time on growth and enzyme production of FX-1

2.4 菌株FX-1所產(chǎn)纖維素酶的酶活特性

2.4.1 FX-1纖維素酶最適反應(yīng)溫度 以羧甲基纖維素鈉為底物，溫度為30～75 ℃，測定不同溫度下CMC酶活力，結(jié)果如圖6，表明FX-1所產(chǎn)生的纖維素酶在60 ℃條件下酶活力達(dá)最大值，且在30～70 ℃均有活性。這說明該酶最適反應(yīng)溫度為60 ℃，具有良好的耐熱性。

圖6 FX-1纖維素酶不同反應(yīng)溫度條件下酶活變化情況Fig. 6 FX-1 cellulase activity at different reaction temperatures

2.4.2 FX-1纖維素酶最適反應(yīng)pH 在得出最適溫度條件下，以不同pH的羧甲基纖維素鈉溶液為底物，測定CMC酶活力，結(jié)果如圖7，表明FX-1菌株產(chǎn)生的纖維素酶的最適反應(yīng)pH為5.0，且該酶在pH 3.0～8.0均有活性，與王霞等[16]獲得的地衣芽孢桿菌CMC-4所產(chǎn)纖維素酶適應(yīng)性pH范圍相似，且范圍更大，說明該菌株所產(chǎn)纖維素酶pH適應(yīng)范圍較廣，具有較好的耐酸性與耐堿性。

圖7 FX-1纖維素酶不同pH條件下酶活變化情況Fig. 7 FX-1 cellulase activity under different pH conditions

2.4.3 FX-1纖維素酶的熱穩(wěn)定性 在進(jìn)行酶活反應(yīng)前，先將酶液分別置于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃溫度下保溫30 min，再測定CMC酶活力，結(jié)果如圖8，表明CMC在30～55 ℃下熱穩(wěn)定較好，相對酶活有90%以上；當(dāng)在溫度≥60 ℃保溫30min時(shí)，酶活力迅速下降，但相對酶活依然高于30%，說明該酶具有一定的耐熱性。

圖8 FX-1纖維素酶在不同溫度環(huán)境下的耐受情況Fig. 8 Tolerance of FX-1 cellulase to elevated temperatures

2.4.4 FX-1纖維素酶的酸堿耐受能力 在進(jìn)行酶活反應(yīng)前，先將酶液分別于pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖液中，4 ℃保溫30 min，再測定CMC酶活，結(jié)果如圖9，表明pH 為3.0～7.0，CMC酶較穩(wěn)定，當(dāng)pH為8.0時(shí)，酶活迅速下降，但相對酶活依然高于60%，說明該酶具有一定的耐酸堿能力，但主要過程pH值還是較為偏酸性，可知該酶為酸性酶[17]。

圖9 FX-1纖維素酶在不同酸堿環(huán)境下的耐受情況Fig. 9 Tolerance of FX-1 cellulase to acidic and alkaline conditions

3 結(jié)論與討論

纖維素降解菌廣泛分布于自然界，細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物在一定條件下都能合成、分泌纖維素酶[18]。細(xì)菌是微生物中種類最多，數(shù)量廣泛的類群。與真菌相比，細(xì)菌生長更迅速，環(huán)境適應(yīng)能力更強(qiáng)，其中芽孢桿菌具有良好的穩(wěn)定性、環(huán)境適應(yīng)性以及產(chǎn)酶活性高等優(yōu)點(diǎn)，有利于工農(nóng)業(yè)應(yīng)用[18,19],，也更適于煙草行業(yè)。目前，關(guān)于芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶活性的研究多有報(bào)道，如薛磊等[20]研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬細(xì)菌是云南煙草種植區(qū)的優(yōu)勢菌群，篩選到的芽孢桿菌YN14產(chǎn)纖維素酶活性高；Abd等[21]在對土壤和灌溉水產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的分離篩選研究中，發(fā)現(xiàn)能夠分泌纖維素酶的40株菌株中，纖維素酶活力最高的5株菌皆為芽孢桿菌；Yang等[22]表明在所有的纖維素分解細(xì)菌分離物中，蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的纖維素酶活性最高。

分離篩選到可有效降解纖維素的纖維素酶高產(chǎn)菌株是實(shí)現(xiàn)應(yīng)用的前提。本研究從37份片煙樣品中分離篩選到了一株產(chǎn)纖維素酶菌株FX-1，該菌株能在以羧甲基纖維素鈉（CMC）為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，剛果紅染色后有明顯的透明圈。菌落為灰白色、干燥、表面有不規(guī)則隆起褶皺；透射電鏡觀察顯示菌體呈棒狀或近棒狀的桿菌；部分生理生化測試結(jié)果顯示菌株FX-1為革蘭氏陽性，接觸酶實(shí)驗(yàn)陽性，V-P試驗(yàn)測定陽性，能還原硝酸鹽和檸檬酸鹽。上述形態(tài)觀察和生理生化特征與芽孢桿菌屬Bacillus細(xì)菌的表型特征相似。從16S rRNA序列與Bacillus subtilis相似性（相似度最高100%）和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，F(xiàn)X-1與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）（相似度99.79%）處于同一分支，置信度為86%。綜上，結(jié)合生理生化、16S rRNA基因序列同源性、系統(tǒng)發(fā)育樹等方面分析，將FX-1初步鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

從枯草芽孢桿菌FX-1產(chǎn)纖維素酶的生長特性可以看出，發(fā)酵48小時(shí)，纖維素酶酶活性可以達(dá)到56.261 U·mL-1。此前很多煙草源產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選研究中，楊宗燦等[23]從原煙表面分離篩選得到的煙葉纖維素降解菌株XC-19-1，其發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活性為6.6 U·mL-1；鄒芳等[24]從煙稻輪作區(qū)獲得的枯草芽孢桿菌YC-2的CMC酶活力為38.65 U·mL-1；梅金飛[25]從煙草秸稈廢棄物中獲得的嗜熱芽孢桿菌SL-2A的 CMC最大酶活力為 48.72 U·mL-1?？梢娍莶菅挎邨U菌FX-1具有較高的纖維素酶活性。對其酶學(xué)特性研究也表明，F(xiàn)X-1菌株所產(chǎn)纖維素酶活穩(wěn)定，在pH 3.0～7.0、溫度30～55 ℃保溫30 min后仍有較高活力，說明其具有較強(qiáng)的耐酸能力和耐熱能力。該酶催化的最適pH值為5.0，最適溫度為60 ℃，可知該酶為中溫酸性酶。綜上，本研究所得菌株FX-1是1株能高產(chǎn)酸性纖維素酶的枯草芽孢桿菌，經(jīng)進(jìn)一步開發(fā)后，將在煙草行業(yè)中具有良好的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。