李界秋，宋文欣，蒙姣榮 ，王忠文

（1. 廣西大學農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，廣西 南寧 530004；2. 廣西大學農(nóng)學院，廣西 南寧 530004）

0 引言

【研究意義】植物土傳病害由生活在土壤中或隨植物病株殘體殘留在土壤中的病原物侵染植物根部或莖部引起，具有危害面積大、病原種類多和病害治理困難的特點[1-3]。隨著集約化農(nóng)業(yè)的發(fā)展和高附加值作物的連年栽培，土傳病害逐年加重，連年栽種3～5年后可造成減產(chǎn)20%～40%，嚴重的減產(chǎn)60%以上，作物品質(zhì)也受到嚴重影響，土傳病害已成為我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的主要制約因素[4-5]。化學藥劑防治具有成本低、見效快等優(yōu)點，在植物土傳病害防控中發(fā)揮著重要作用[3]。但是，化學藥劑的長期大量使用容易引起藥物殘留、環(huán)境污染和抗藥性增強等問題。生物防治以利用拮抗微生物防治為主要手段，通常具有抗病和促生的雙重效果，對人體無毒無害、不污染環(huán)境及不容易使病原菌產(chǎn)生抗性，符合我國當前農(nóng)業(yè)生物藥物與生態(tài)農(nóng)業(yè)作為優(yōu)先發(fā)展的主題，是實現(xiàn)植物土傳病害綠色防控的有效技術(shù)手段[1,5-7]。目前應用于植物土傳病害生物防治的微生物菌劑中，除了木霉（Trichodermasp.）和假單胞桿菌（Pseudomonassp.），其余的多為芽胞桿菌屬（Bacillusspp.），如枯草芽胞桿菌（B. subtilis）、解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefacien）和貝萊斯芽胞桿菌（B. velezensis）等[1,8-10]。當前可供選擇的拮抗菌株資源仍然很少，可用于作物生產(chǎn)的制劑或產(chǎn)品的種類和數(shù)量均有限，現(xiàn)有的菌株難以同時防治種類繁多的病原物引致的病害[5-6]，因此，篩選獲得對多種植物土傳病害病原菌具有拮抗作用的生防菌株并研究其拮抗機制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】貝萊斯芽胞桿菌可以產(chǎn)生抗生素、酶、植物激素和抗腫瘤劑，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)和醫(yī)學上均有廣泛用途[11-14]。大量的研究表明，貝萊斯芽胞桿菌抑菌譜廣，對多種植物病原真菌和細菌均具有良好和抑制效果和防治潛力[11,15]。貝萊斯芽胞桿菌 E69菌株和E33菌株是來自水稻葉片的內(nèi)生菌，對立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、煙草疫霉（Phytophthora nicotianae）和鏈格孢菌（Alternaria alternate）等病原菌均具有顯著的拮抗作用[16]；趙昱榕等[17]從黃瓜植株體內(nèi)分離篩選獲得的貝萊斯芽胞桿菌ZF2，對多主棒孢病菌（Corynespora cassiicola）在內(nèi)的6 種病原真菌和 7 種病原細菌具有顯著拮抗效果。以土傳病原菌為目標的拮抗貝萊斯芽胞桿菌篩選已有一些報道。崔文會等[18]土壤中分離篩選獲得貝萊斯芽胞桿菌CX-2菌株，該菌株對水稻、小麥和大豆等作物的6種土傳病原真菌均有明顯的抑菌活性。羅漢果白絹病與根腐病的病原菌分別為腐皮鐮孢菌（F. solani）和齊整小核菌，王瑞昊等[19]從羅漢果根際土壤中篩選分離對這2種病原菌有拮抗作用的貝萊斯芽胞桿菌TYX-2菌株。許帥等[20]從馬鈴薯根際土壤分離篩選獲得對馬鈴薯枯萎病菌（F.oxysporum）有拮抗作用的貝萊斯芽胞桿菌菌株ZF128，盆栽試驗防效為 82.46%。貝萊斯芽胞桿菌2A-2B菌株是從雜草Sporobolus airoides根圍土壤分離獲得，可顯著抑制尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、辣椒疫霉（Phytophtora capsici）和腐皮鐮刀菌等土傳病原菌菌絲的生長[13,21]。【本研究切入點】本課題組在前期研究中以桑樹細菌性枯萎病菌（Enterobacterspp.）和桑枝菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）作為目標測試菌，獲得一批具有明顯拮抗活性的芽胞桿菌菌株，其中NN01、NN02、NN04、NN05、NN88和NN95等6個拮抗菌株被鑒定為貝萊斯芽胞桿菌[22-23]，這些拮抗菌株對尖孢鐮刀菌等主要土傳病害病原菌是否具有拮抗活性及其抑菌機理均有待明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】測定NN01、NN02、NN04、NN05、NN88和NN95等6株貝萊斯芽胞桿菌對核盤菌、灰葡萄孢、立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、齊整小核菌、煙草疫霉和終極腐霉（Pythium ultimum）的抑菌活性，以期明確其產(chǎn)生的胞外酶及攜帶的抗生素相關(guān)基因種類，為植物常見土傳病害的生物防治提供菌種資源，為進一步開發(fā)利用這些拮抗菌株提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株及植物材料 6株貝萊斯芽胞桿菌菌株由本實驗室前期研究獲得，其中NN01、NN02、NN04分離自桑樹品種桂優(yōu)12的枝條，NN05、NN88、NN95分離自桑樹品種桂優(yōu)62的根部[22-23]。植物土傳病原菌為核盤菌、灰葡萄孢菌、立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌古巴?；停‵. oxysporumf. sp.cubense）、齊整小核菌、煙草疫霉和終極腐霉，其中齊整小核菌從桑白絹病病桑樹上分離獲得并保存，其他供試病原菌由廣西大學農(nóng)學院植物病理學研究室提供。用于離體接種的桑樹品種為桂桑優(yōu)62，由廣西蠶業(yè)站惠贈；生菜葉片購于廣西大學菜市場，品種未知。對照枯草芽胞桿菌可濕性粉劑為河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司產(chǎn)品（有效成分含量：1×1011CFU·g-1）。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基 (luria-bertani, LB)：酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，去離子水定容到1 000 mL，pH7.0～7.2?？莶菅堪麠U菌常用培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g，蛋白胨15.0 g，NaCl 5.0 g，牛肉膏0.5 g，去離子水定容到1 000 mL，pH7.0～7.2。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA)：PDA粉購自BD公司，按照說明書配制。 V8培養(yǎng)基：V8 果汁 200 mL，CaCO33.0 g，瓊脂粉15.0 g，去離子水定容到1 000 mL，pH 7.0～7.2。蛋白酶檢測培養(yǎng)基：脫脂奶粉12.0 g，瓊脂20.0 g，去離子水定容至1 000 mL。纖維素酶檢測培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂20.0 g，酵母粉5.0 g，KH2PO41.0 g，NaCl 5.0 g，去離子水定容到1 000 mL，pH7.0。β-1,3-葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，剛果紅0.4 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20.0 g，去離子水定容至1 000 mL，pH值5.5～6.0。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 實驗室pH計（梅特勒-托利多儀器有限公司）、臺式離心機（艾本德中國有限公司）、恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海福瑪實驗設(shè)備有限公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司）、微型分光光度計（Biochrom有限公司）、PCR儀（賽默飛世爾科技中國有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗貝萊斯芽胞桿菌抑菌活性的測定 采用平板對峙法測定6株貝萊斯芽胞桿菌對7種供試植物土傳病害病原菌的抑制作用：待測拮抗菌用LB培養(yǎng)基，在28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)至OD600值為1.0；各種病原菌在PDA培養(yǎng)平板或V8培養(yǎng)基平板上（煙草疫霉）培養(yǎng)，菌落直徑約為8.00 cm時，用打孔器在菌落邊緣取直徑0.6 cm的菌餅，倒置接種于PDA平板中央，在其周圍距離2.0 cm對稱的4個點上接種1.0 μL拮抗菌菌液，以LB培養(yǎng)基作為對照，每株拮抗菌3次重復。對照（CK）平板上病原菌菌落直徑約為8.00 cm時，測量各個處理與對照的菌落直徑，按如下公式計算菌絲生長抑制率：菌絲生長抑制率/%=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100。

1.2.2 拮抗貝萊斯芽胞桿菌對病原菌菌絲形態(tài)的影響 取上述對峙培養(yǎng)中抑菌帶邊沿的菌絲進行形態(tài)觀察，以不接種拮抗菌只接種病原菌的培養(yǎng)平板為對照。

1.2.3 拮抗貝萊斯芽胞桿菌無菌發(fā)酵液對病原菌抑制活性的測定 各供試拮抗菌株接種于枯草芽胞桿菌常用培養(yǎng)基（液體培養(yǎng)基），28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)48 h，得到拮抗菌發(fā)酵液；將發(fā)酵液在10 000 r·min-1條件下離心 10 min，吸取上清，用 0.22 μm的細菌過濾器過濾獲得無菌發(fā)酵上清液；制作雙層PDA平板（瓊脂粉含量，上層為16 g·L-1，下層為20 g·L-1），取直徑為0.6 cm的病原菌菌餅置于雙層PDA平板中央；在距離中央2 cm處對稱的4個位置將上層的培養(yǎng)基打孔，取出上層瓊脂圓片，將40 μL無菌發(fā)酵上清液加入到打好的孔內(nèi)，28 ℃下進行培養(yǎng)。以加入無菌LB培養(yǎng)基為對照，每個處理3個重復。其余步驟同“1.2.1”。

1.2.4 葉片離體接種測定拮抗貝萊斯芽胞桿菌的防治效果 選取齊整小核菌和核盤菌為目標菌進行離體防治效果測定。齊整小核菌接種于健康桑葉，在桑葉沿中線對稱的2個位置制造傷口，在培養(yǎng)至3 d的齊整小核菌菌落邊緣打孔，菌餅接種于右邊傷口處，無菌PDA培養(yǎng)基接種于左邊傷口處作為對照，將葉片置于濕潤的濾紙上，分別無菌水（CK1）、新鮮拮抗菌菌液（1×108CFU·mL-1）和枯草芽胞桿菌可濕性粉劑（稀釋1 000倍液）（CK2）噴霧，至葉片濕潤不滴水為止，每個處理3次重復，24 h后重復噴霧1次。接種葉片于28 ℃培養(yǎng)箱中放置72 h，以十字交叉法測量病斑的直徑，計算防治效果。核盤菌則接種生菜葉片，培養(yǎng)溫度為25 ℃，接種48 h后測量病斑的大小，其他操作步驟與桑葉片接種方法相同。防治效果/%=（對照葉片病斑直徑-處理葉片病斑直徑）/對照葉片病斑直徑×100。

1.2.5 拮抗貝萊斯芽胞桿菌細菌胞外酶活性的測定 蛋白酶活性的檢測：將6株待測拮抗菌接種于 LB培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r·min-1下培養(yǎng)，至菌液 OD600值為0.6，分別吸取1.0 μL拮抗菌菌液，均勻點在距離蛋白酶檢測培養(yǎng)基平板中心約2.0 cm處。設(shè)置3個重復，以無菌LB液體培養(yǎng)基作為對照，培養(yǎng)2 d后，觀察在菌落邊緣是否形成透明圈。若形成透明圈，根據(jù)透明圈的大小判斷菌株產(chǎn)生蛋白酶活性的大小。纖維素酶活性的檢測：按上述方法將待測拮抗菌接種于纖維素酶活性檢測培養(yǎng)基平板上，經(jīng)28 ℃培養(yǎng)3 d后，用質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1的剛果紅溶液5.0 mL染色15 min，倒掉剛果紅溶液加入5.0 mL l.0 mol·L-1的 NaCl溶液，靜置 15 min，倒掉 NaCl溶液，觀察是否形成透明圈。β-1,3-葡聚糖酶活性的檢測：在β-1,3-葡聚糖酶活性檢測培養(yǎng)基上進行，操作步驟同蛋白酶活性的檢測。

1.2.6 拮抗貝萊斯芽胞桿菌抗生素相關(guān)基因的檢測 依據(jù)文獻合成用于檢測mycB[24]、fenB[25]、ituA[25]、sfp[25]、bamC[26]、erisA[26]、bacA[27]、spaS[27]、yndj[28]和qk[29]共 10 個目標基因的引物（表1）。分別以6株拮抗菌的基因組DNA作為模板對目標基因進行PCR 檢測。PCR反應體系：總反應體積50 μL，其中TaqMix 25 μL，上下游引物（10 mmol·L-1）各 2 μL， DNA模板 (50 ng·μL-1) 2 μL，ddH2O 19 μL。反應條件：95 ℃預變性 5 min，94 ℃ 變性 30 s，退火 30 s，72 ℃ 延伸2 min，運行30個循環(huán)，最后72 ℃ 延伸 5 min，其中erisA的退火溫度為54 ℃，bamC、bacA和spaS的退火溫度為58 ℃，其余基因的退火溫度為55 ℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，將條帶大小正確的片段進行回收純化后測序。

表1 用于檢測拮抗貝萊斯芽胞桿菌抗生素相關(guān)基因的引物Table 1 Primers used to detect antibiotic-related genes in Bv strains

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 用Excel計算平均數(shù)及標準差，利用IBM SPSS Statistics V21.0軟件進行統(tǒng)計學分析，利用新復極差測驗法（SSR法）進行平均數(shù)之間的多重比較，判斷不同處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 6株貝萊斯芽胞桿菌對土傳病害病原菌的抑菌活性

采用對峙培養(yǎng)法測定6株貝萊斯芽胞桿菌對7種土傳病害病原菌抑菌活性，結(jié)果顯示，6株拮抗菌株對核盤菌、灰葡萄孢、立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、齊整小核菌和煙草疫霉等6種病原菌菌絲生長均有較強的抑制作用，對終極腐霉抑制效果不明顯（圖1-A）。不同拮抗菌株對不同病原菌的抑菌活性有明顯差異，菌株NN01對核盤菌、灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌和齊整小核菌的抑制效果較好，抑菌率均達34.07%及以上；NN02對齊整小核菌的抑制活性最高，達76.11%，對核盤菌和尖孢鐮刀菌的抑菌率分別為52.22%和46.67%；NN04對齊整小核菌和尖孢鐮刀菌的抑菌活性較高，分別為74.81%和56.30%；NN88對齊整小核菌和尖孢鐮刀菌的抑菌活性也較高，分別為62.41%和40.56%（表2）。就病原菌而言，所有拮抗菌株對齊整小核菌具有較強的抑制作用，菌絲抑制率在28.70% ～ 76.11%；有4個拮抗菌株（NN01、NN02、NN04、NN88）有對尖孢鐮刀菌具有較強的抑制作用，抑制率在40.56%～56.30%；所有拮抗菌株對立枯絲核菌和煙草疫霉抑制作用較弱，菌絲抑制率均未達到19.26%。采用枯草芽胞桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)所有拮抗菌株，過濾獲得無菌發(fā)酵液，以核盤菌、灰葡萄孢菌和立枯絲核菌作為指示菌進行對峙培養(yǎng)，結(jié)果顯示所有菌株的無菌發(fā)酵液對病原菌也均具有明顯的抑制作用（圖1-B）。

表2 拮抗貝萊斯芽胞桿菌對土傳病原菌菌絲生長的影響Table 2 Effect of Bv strains on in vitro growth of soil-borne pathogens

圖1 貝萊斯芽胞桿菌（A）及其無菌發(fā)酵液（B）對 7 種土傳病害病原菌菌絲生長的抑制效果Fig. 1 Inhibitory effects of Bv culture liquid (A) and cell-free fermentation broth (B) against 7 soil-borne pathogens

2.2 拮抗貝萊斯芽胞桿菌對核盤菌和灰葡萄孢菌菌絲形態(tài)的影響

在PDA上對峙培養(yǎng)48 ～96 h后，用顯微鏡觀察抑菌帶中核盤菌和灰葡萄孢菌菌絲形態(tài)，結(jié)果顯示，NN02、NN88和NN95菌株處理的核盤菌菌絲原生質(zhì)濃縮，顏色加深，局部菌絲破裂，原生質(zhì)分布不均勻；NN02、NN04、NN05、NN88、NN95 處理的灰葡萄孢菌菌絲也有相似的表現(xiàn)。NN01、NN04處理的核盤菌菌絲及NN01處理下的灰葡萄孢菌菌絲顏色加深，其形態(tài)無明顯變化（圖2）。

圖2 貝萊斯芽胞桿菌對核盤菌（A）和灰葡萄孢（B）菌絲形態(tài)的影響Fig. 2 Effects of Bv strains on morphology of S. sclerotiorum (A) and B. cinerea (B) mycelia

2.3 拮抗貝萊斯芽胞桿菌在離體葉片上的防治效果

分別在桑葉片接種齊整小核菌，生菜葉片在接種核盤菌后，用6株貝萊斯芽胞桿菌液噴霧處理，48～72 h后觀察發(fā)病情況。結(jié)果顯示，所有拮抗菌株對桑葉片或生菜葉片的病斑擴展均有不同程度的抑制作用（圖3），對桑白絹病的防治效果都在53.40%以上，其中NN01防治效果為71.32%，NN01、NN02、NN05菌株防治效果分別為65.65%、65.05%和61.46%高于對照枯草芽胞桿菌菌劑（CK2），其余菌株的抑制效果與枯草芽胞桿菌菌劑的相當；所有拮抗菌株對生菜菌核病的抑制效果均優(yōu)于對照枯草芽胞桿菌菌劑（CK2），其中NN01防治效果最好，為65.68%（表3）。

圖3 拮抗貝萊斯芽胞桿菌在離體葉片上對病桑白絹病(A)和生菜菌核?。˙）的抑制效果Fig. 3 In vitro inhibitory effects of Bv strains against S. rolfsii on mulberry leaves (A) and S. sclerotiorum on lettuce leaves (B)

表3 離體條件下6株貝萊斯芽胞桿菌桑白絹病和生菜菌核病的防治效果Table 3 In vitro control efficacy of Bv strains against S. rolfsii and S. sclerotiorum

2.4 拮抗貝萊斯芽胞桿菌胞外酶活性

胞外酶活性進行檢測結(jié)果顯示，所有菌株在纖維素酶和酶蛋白酶檢測培養(yǎng)基上均可產(chǎn)生明顯透明圈，表明這些菌株可以產(chǎn)生纖維素酶和蛋白酶，其中NN01、NN02、NN04和NN88產(chǎn)纖維素酶的能力較強，NN05、NN95產(chǎn)纖維素酶的能力較弱；NN04產(chǎn)蛋白酶的能力最強，其次為NN01和NN02菌株。在β-1,3-葡聚糖酶檢測平板上，NN02、NN04、NN05、NN88能夠形成透明圈，但是透明圈界限不夠明顯，說明這些菌株可以產(chǎn)生葡聚糖酶，但是酶活性較弱或者產(chǎn)量較低，而菌株NN01和NN95在β-1,3-葡聚糖酶檢測平板上不產(chǎn)生可見透明圈，表明在此條件下，這2個菌株不產(chǎn)生葡聚糖酶(圖4) 。

圖4 拮抗貝萊斯芽胞桿菌的纖維素酶、蛋白酶和β-1,3-葡聚糖酶活性檢測Fig. 4 Determination of cellulase, protease, and amylase activities in Bv strains

2.5 拮抗貝萊斯芽胞桿菌抗生素合成相關(guān)基因的檢測

分別以拮抗菌株的總DNA作為模板，使用10對引物（表1）對抗生素合成相關(guān)基因進行PCR擴增。電泳檢測顯示，除了菌株NN95基因組沒有擴增出fenB基因的特異條帶，其余菌株用5對基因（mycB、fenB、ituA、bacA、yndj）的引物均可擴增出特異性單一的條帶，條帶大小正確（圖5），經(jīng)測序驗證均為對應的目標基因片段，表明這些菌株都具有產(chǎn)生抗霉枯草菌素、豐原素、伊枯草菌素、溶桿菌素和假定蛋白Yndj的潛力，而NN95菌株沒有產(chǎn)生豐原素的潛力。另外5對基因（sfp、bamc、erisa、spaS、qk）的引物則沒有擴增出明顯的條帶（圖中未顯示），表明所有拮抗菌株中均沒有攜帶產(chǎn)生表面活性素、桿菌霉素、Ericin、枯草菌素和枯草桿菌蛋白酶等抗生素的相關(guān)基因。

圖5 貝萊斯芽胞桿菌菌株中抗生素合成基因電泳檢測結(jié)果Fig. 5 Detection of antibiotic-related genes in Bv strains by PCR amplification

3 討論與結(jié)論

貝萊斯芽胞桿菌來源廣泛，抑菌譜廣且可促進植物生長，作為植物生防制劑具有良好的應用前景，開展貝萊斯芽胞桿菌菌種資源的收集、篩選對推進植物病害的生物防治具有重要意義[13-14,30]。本研究表明6株貝萊斯芽胞桿菌對核盤菌、灰葡萄孢菌、立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、齊整小核菌和煙草疫霉等病原菌菌絲生長均具有明顯抑菌活性，為常見植物土傳病害的生物防治提供了菌種資源。作用機理不同的多個菌株混合使用可以提高拮抗菌的防治效果，可以防治同一作物上不同病害，甚至防治不同作物上不同病害[5,10]，在今后的盆栽試驗及大田試驗中，將使用不同菌株混合后進行防治，評估其用于制備混合菌劑的潛力。

芽胞桿菌可分泌產(chǎn)生多種胞外酶和抗生素等抗菌物質(zhì)，參與抑菌過程[9]。芽胞桿菌分泌的常見胞外酶包括幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、纖維素酶和β-1,3-葡聚糖酶等，胞外酶的種類及其活性可作為篩選拮抗菌的主要標記，通常產(chǎn)生胞外酶種類多的拮抗菌株，均具有較好的生防效果[12,31]。脂肽類抗生素（lipopeptin）是芽胞桿菌分泌的主要抗菌物質(zhì)，以伊枯草菌素家族、表面活性素和豐原素為主，其中伊枯草菌素家族包括伊枯草菌素、桿菌抗霉素和抗霉枯草菌素等，可破壞真菌細胞壁、細胞膜，強烈抑制真菌菌絲生長；豐原素作用機理與伊枯草菌素家族的相似，對絲狀真菌抑制效果好[9,32]；溶桿菌素可導致微生物細胞壁的結(jié)構(gòu)受損，細胞溶解死亡，對真菌和細菌都具有廣譜的抗菌活性[33-34]。本研究中的6個拮抗貝萊斯芽胞桿菌菌株均能分泌蛋白酶和纖維素酶，4個菌株可以產(chǎn)生少量的β-1,3-葡聚糖酶；除了NN95菌株不攜帶fenB，所有拮抗菌株都攜帶mycB、fenB、ituA、bacA和yndj等抗生素相關(guān)基因，表明這些菌株都具有產(chǎn)生抗霉枯草菌素、豐原素、伊枯草菌素、溶桿菌素和假定蛋白Yndj的潛力。拮抗菌株的無菌發(fā)酵液對病原菌具有明顯的抑菌作用，抑菌帶邊緣的菌絲出現(xiàn)原生質(zhì)濃縮或外泄、菌絲破裂、顏色變深等，推測6株拮抗菌產(chǎn)生的胞外酶和抗生素參與了它們的抑菌過程。與其他5個菌株相比，NN95菌株在平板上的抑菌效果相對較差，可能與該菌株缺少fenB基因有關(guān)。

在本研究中拮抗菌株在平板對峙培養(yǎng)顯示的抑菌活性與葉片離體防治效果不存在一一對應關(guān)系，NN02和NN04對白絹病菌平板測試的抑菌活性分別為76.11%和74.81%，均比NN01菌株的（67.59%）高，但是其離體防治效果比NN01菌株的低；NN95菌株對齊整小核菌平板抑制為28.70%，離體防治效果61.46%，均優(yōu)于NN04和NN88菌株，推測不同菌株的作用機制存在一定的差異。在平板對峙培養(yǎng)中，菌株產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的活性和生物量直接影響其抑菌效果，而離體葉片或田間防治效果則是拮抗菌-病原菌-寄主植物三者的相互作用的結(jié)果，與菌株產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)、定殖能力、能否誘導產(chǎn)生誘導抗性及寄主的抗病性等均有密切關(guān)系[9,35]。今后可以利用基因組學、蛋白組學和代謝組學等多種組學方法聯(lián)合分析，明確抗生素相關(guān)基因及胞外酶在拮抗菌-病原菌-寄主植物三者之間發(fā)揮作用的機制。

本研究中的拮抗菌株對立枯絲核菌、煙草疫霉和終極腐霉抑菌活性較低或沒有活性。不同的病原菌對不同拮抗物質(zhì)的反應有所不同，而培養(yǎng)條件會影響拮抗菌產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的種類及濃度[34,36]。如枯草芽胞桿菌野生型菌株（ATCC 6633）對病原菌并沒有明顯的抑制活性，其過量表達抗霉枯草菌素基因的工程菌株BBG100則對灰葡萄孢菌、尖孢鐮刀菌和瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）有明顯的拮抗活性[37]。后續(xù)研究將通過改變培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件或者構(gòu)建主要抗生素相關(guān)基因的過量表達菌株，重新評估這些菌株產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的活性及其抑菌范圍。此外，本研究中6株拮抗貝萊斯芽胞桿菌均攜帶bacA基因，具有產(chǎn)生溶桿菌素的潛力。溶桿菌素對細菌有強的抑制作用[9,34]，一些貝萊斯芽孢桿菌菌株對植物病原細菌也具有較強的抑制活性[9,34,38]。本研究中的拮抗菌株對茄科青枯菌（Ralstonia solanacearum）等土傳細菌性病原是否有抑制作用，值得進一步研究。

6株拮抗貝萊斯芽胞桿菌抑菌譜廣，對核盤菌、灰葡萄孢、立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、齊整小核菌和煙草疫霉等6種土傳病原菌菌絲生長具有抑制作用；所有拮抗菌株均能較好抑制桑白絹病和生菜菌核病病斑的發(fā)展，產(chǎn)生纖維素酶和蛋白酶；除了NN95菌株不攜帶fenB，所有拮抗菌株都攜帶mycB、fenB、ituA、bacA和yndj等抗生素相關(guān)基因，具有產(chǎn)生抗霉枯草菌素、豐原素、伊枯草菌素、溶桿菌素和假定蛋白Yndj的潛力，是植物土傳病害潛在的生防菌。