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      一株耐高溫誘變鼠李糖乳桿菌產(chǎn)酸條件優(yōu)化及其特性分析

      2022-05-25 07:20:58高若珊楊春華石彥國呂銘守
      中國食品學(xué)報 2022年4期
      關(guān)鍵詞:產(chǎn)酸量酸漿漿水

      高若珊,楊春華,王 冰,石彥國,呂銘守

      (哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院 黑龍江省普通高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黑龍江省谷物食品與谷物資源綜合加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱 150028)

      豆腐制作過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物——黃漿水,是一種富含蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、鹽類等物質(zhì)的天然培養(yǎng)基[1-3]。我國傳統(tǒng)的酸漿豆腐是由黃漿水自然發(fā)酵形成的酸漿經(jīng)點(diǎn)制而成,而傳統(tǒng)的酸漿大多由地方小作坊自然發(fā)酵制成,地域性強(qiáng),難以大規(guī)模生產(chǎn)[4-5]。酸漿的酸度容易受外界因素影響,環(huán)境不穩(wěn)定,酸漿品質(zhì)也不穩(wěn)定,導(dǎo)致制作的酸漿豆腐品質(zhì)不穩(wěn)定?,F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)酸漿在自然發(fā)酵過程中的主要產(chǎn)酸菌為乳酸菌[6-9],所產(chǎn)多種有機(jī)酸豐富了酸漿豆腐的風(fēng)味,同時可作為酸漿豆腐的蛋白凝聚劑。此外,酸漿在自然發(fā)酵過程中除有益菌以外,還產(chǎn)生許多雜菌,容易導(dǎo)致所生產(chǎn)的酸漿豆腐品質(zhì)不好,貨架期短。若將酸漿改為純種發(fā)酵[10-11],則可有效解決以上問題。

      本研究以豆腐生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物——黃漿水為培養(yǎng)基,對實(shí)驗(yàn)室前期誘變選育的耐高溫乳酸菌(鼠李糖乳桿菌)進(jìn)行純種發(fā)酵制作酸漿。以產(chǎn)酸量、pH 值為考察指標(biāo),研究發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、乳酸菌接種量及預(yù)培養(yǎng)時間對乳酸菌純種發(fā)酵黃漿水產(chǎn)酸量和pH 值的影響,采用正交試驗(yàn)對乳酸菌純種發(fā)酵黃漿水制作酸漿的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,采用高效液相色譜法(HPLC)測定酸漿中有機(jī)酸的種類、含量,對乳酸菌誘變前、后的產(chǎn)酸條件及代謝通路進(jìn)行對比分析[12-15],以期提高豆腐酸漿的產(chǎn)酸量,提高酸漿豆腐的品質(zhì),為豐富酸漿豆腐風(fēng)味提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      發(fā)酵酸漿用菌株為本實(shí)驗(yàn)室前期保存及誘變選育的鼠李糖乳桿菌 (Lactobacillus rhamnosus),分別編號為:HCUL 1.1801-1912 (哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院糧油學(xué)科實(shí)驗(yàn)室保藏)、HCUL 1.1901-1912(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院糧油學(xué)科實(shí)驗(yàn)室保藏,CGMCC 保藏登記入冊編號:19309)。文中涉及菌株均以編號代替。

      黃漿水:哈爾濱商業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制。

      無水乙醇、氫氧化鈉、酚酞均為分析純級,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;氯化鎂(食品級),天津碩?;び邢薰荆荤晁針?biāo)準(zhǔn)品、草酸標(biāo)準(zhǔn)品、富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品、α-酮戊二酸、乳酸標(biāo)準(zhǔn)品、丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品均為分析純級,美國Sigma-Aldrich 公司。

      1.2 儀器與設(shè)備

      FDM-Z100 自分離大豆磨漿機(jī),鎮(zhèn)江新區(qū)大港晶晶食品機(jī)械廠;DHP-9052 培養(yǎng)箱,上海合恒儀器設(shè)備有限公司;HWS 水浴鍋,紹興萬力儀器有限公司;PHS-3C pH 計,上海儀電分析儀器有限公司;HPLC I-Class 超高效液相色譜、LC-MS/MS XEVO TQ-XS 串聯(lián)四極桿質(zhì)譜、ACQUITY UPLC BEH C8 反向色譜柱,美國Waters 公司。

      1.3 試驗(yàn)方法

      1.3.1 試驗(yàn)技術(shù)路線 豆腐黃漿水→過濾滅菌→接菌發(fā)酵→單因素實(shí)驗(yàn)→正交優(yōu)化→有機(jī)酸檢測→代謝通路分析

      1.3.2 菌株活化擴(kuò)培 采用MRS 肉湯培養(yǎng)基對乳酸菌HCUL 1.1901-1912 進(jìn)行活化,將前期保存的乳酸菌接種于10 mL MRS 液體培養(yǎng)基中,37℃恒溫培養(yǎng)24 h,再用接菌環(huán)將其接種于另一個裝有10 mL MRS 液體培養(yǎng)基的試管中,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,經(jīng)過2~4 次活化后,采用平板計數(shù)法測定其活菌數(shù),直至培養(yǎng)基內(nèi)活菌數(shù)大于106CFU/mL,待用。

      將預(yù)先活化好的乳酸菌以5%的接菌量接種于100 mL 滅菌的MRS 液體培養(yǎng)基內(nèi),置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24 h 后,備用。

      1.3.3 酸漿中產(chǎn)酸量及pH 值的測定 將5 mL待測液放入250 mL 的錐形瓶中,用排CO2后的蒸餾水稀釋適當(dāng)倍數(shù),滴3 滴指示液(0.1%)并搖勻,用0.1 mol/L NaOH 的標(biāo)準(zhǔn)溶液對試液進(jìn)行滴定,滴定終點(diǎn)為微紅色且30 s 不褪色,記錄消耗標(biāo)準(zhǔn)NaOH 溶液的體積并計算其總產(chǎn)酸量[16-17]。

      式中,C2——產(chǎn)酸量,g/L;C1——標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液濃度,mol/L;F——試液稀釋倍數(shù);V1——滴定發(fā)酵液所消耗NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL;V2——滴定空白對照組所消耗NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL;V3——待測發(fā)酵液體積,mL。

      采用雷磁PHS-3C pH 計測定pH 值。

      1.3.4 乳酸菌純種發(fā)酵黃漿水的產(chǎn)酸條件優(yōu)化

      1.3.4.1 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酸量及pH 值的影響 將活化好的菌株HCUL 1.1901-1912 以12 h 的預(yù)培養(yǎng)時間,按5%的乳酸菌接種量接種于500 mL 滅菌的黃漿水中,分別置于32,35,37,39,42 ℃的培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵培養(yǎng)24 h,在無菌操作下取出少量發(fā)酵液,測其發(fā)酵液的總酸和pH 值,以產(chǎn)酸量和pH 值為指標(biāo),考察發(fā)酵溫度對乳酸菌發(fā)酵黃漿水的影響。

      1.3.4.2 發(fā)酵時間對產(chǎn)酸量及pH 值的影響 將活化好的菌株HCUL 1.1901-1912 以12 h 的預(yù)培養(yǎng)時間,按5%的乳酸菌接種量接種于500 mL 滅菌的黃漿水中,置于37 ℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),分別發(fā)酵培養(yǎng)8,12,16,20,24 h,在無菌操作下取出少量發(fā)酵液,測其發(fā)酵液的總酸和pH 值,以產(chǎn)酸量和pH 值為指標(biāo),考察發(fā)酵時間對乳酸菌發(fā)酵黃漿水的影響。

      1.3.4.3 乳酸菌接種量對產(chǎn)酸量及pH 值的影響 將活化好的菌株HCUL 1.1901-1912 以12 h 的預(yù)培養(yǎng)時間,分別按3%,4%,5%,6%,7%的乳酸菌接種量接種于500 mL 滅菌的黃漿水中,置于37 ℃的培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵培養(yǎng)24 h,在無菌操作下取出少量發(fā)酵液,測其發(fā)酵液的總酸和pH 值,以產(chǎn)酸量和pH 值為指標(biāo),考察接種量對乳酸菌發(fā)酵黃漿水的影響。

      1.3.4.4 預(yù)培養(yǎng)時間對產(chǎn)酸量及pH 值的影響 將活化好的菌株HCUL 1.1901-1912 分別預(yù)培養(yǎng)8,10,12,14,16 h,按5%的接種量接種于500 mL滅菌的黃漿水中,置于37 ℃的培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵培養(yǎng)24 h,在無菌操作下取出少量發(fā)酵液,測其發(fā)酵液的總酸和pH 值,以產(chǎn)酸量和pH 值為指標(biāo),考察預(yù)培養(yǎng)時間對乳酸菌發(fā)酵黃漿水的影響。

      1.3.5 乳酸菌純種發(fā)酵黃漿水條件優(yōu)化試驗(yàn) 由于在不同的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、乳酸菌接種量及預(yù)培養(yǎng)時間下產(chǎn)酸量相差較大,為了得到更佳的工藝參數(shù),在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,設(shè)計了L9(34)正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素和水平見表1。

      表1 L9(34)正交試驗(yàn)的因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

      1.3.6 酸漿中有機(jī)酸HPLC 分析法

      1.3.6.1 樣品處理 自制酸漿(HCUL 1801-1912純種發(fā)酵酸漿、HCUL 1901-1912 純種發(fā)酵酸漿)經(jīng)4 000 r/min 離心20 min 后取上清液,經(jīng)0.45 μm 水系濾膜過濾,若有機(jī)酸濃度過高可以適當(dāng)稀釋,經(jīng)超聲脫氣后供分析使用。

      1.3.6.2 有機(jī)酸HPLC 分析方法 色譜條件參照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品有機(jī)酸的測定(GB 5009.157-2016)[17],色譜柱:ZORBAX Eclipse Plus C18 4.6 mm×250 mm,5 μm;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:20 μL;檢測器:UV 210 nm;流動相:用0.1%磷酸溶液+甲醇=97.5%+2.5%(體積分?jǐn)?shù))流動相等度洗脫10 min,然后用1 min 讓甲醇相達(dá)到100%并平衡5 min,再將流動相調(diào)整為0.1%磷酸溶液+甲醇=97.5%+2.5%(體積分?jǐn)?shù)),平衡5 min。8 種有機(jī)酸在此條件下可以達(dá)到基線分離。

      1.4 數(shù)據(jù)處理

      有機(jī)酸數(shù)據(jù)使用TargetLynx 數(shù)據(jù)分析軟件。采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)曲法,以濃度對應(yīng)化合物峰面積與同位素峰面積的比值做線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)。使用此標(biāo)曲定量樣本。

      本試驗(yàn)每組數(shù)據(jù)平行測定3 次,結(jié)果取平均值,并使用Spss16.0 統(tǒng)計軟件、Origin Pro 2018 軟件及Excel 軟件,對試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及處理,計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差并繪圖分析。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 產(chǎn)酸條件優(yōu)化結(jié)果分析

      不同發(fā)酵溫度對黃漿水的產(chǎn)酸量及pH 值的影響如圖1所示。不同發(fā)酵時間對黃漿水的產(chǎn)酸量及pH 值的影響如圖2所示。不同接種量對黃漿水的產(chǎn)酸量及pH 值的影響如圖3所示。不同預(yù)培養(yǎng)時間對黃漿水的產(chǎn)酸量及pH 值的影響如圖4所示。

      由圖1可知,隨著發(fā)酵溫度的不斷升高,產(chǎn)酸量先上升后下降,pH 值先下降后上升。當(dāng)發(fā)酵溫度從32 ℃升至37 ℃時,產(chǎn)酸量也在不斷上升,pH值不斷下降;當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時,產(chǎn)酸量達(dá)到最高49.00 g/L,pH 值則達(dá)到最低3.6,說明這株乳酸菌在此溫度下能夠很好的生長繁殖,其代謝產(chǎn)生的酸也最多;發(fā)酵溫度在37 ℃之后繼續(xù)升高,產(chǎn)酸量開始下降,pH 值開始上升。這表明發(fā)酵溫度在一定范圍內(nèi)能夠促進(jìn)乳酸菌的生長,超過這一范圍則會限制其生長,因此這株乳酸菌在黃漿水中的最適生長繁殖溫度為37 ℃。

      圖1 不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵黃漿水產(chǎn)酸量及pH 值的影響Fig.1 Changes of acid production and pH values of the tofu whey during fermentation under different fermentation temperatures

      由圖2可知,隨著發(fā)酵時間的延長,產(chǎn)酸量也逐漸升高。當(dāng)發(fā)酵時間由8 h 升至16 h 時,pH 值顯著下降,產(chǎn)酸量逐漸增加,說明適當(dāng)延長發(fā)酵時間會促進(jìn)菌株生長,從而提高產(chǎn)酸量。當(dāng)發(fā)酵時間由16 h 升至24 h 時,pH 值和產(chǎn)酸量變化趨于平穩(wěn)。隨著發(fā)酵時間的逐漸延長,pH 值并沒有顯著降低,這說明并非發(fā)酵時間越長越好,因?yàn)榘l(fā)酵時間過長,乳酸菌產(chǎn)酸量過多,使發(fā)酵液內(nèi)的環(huán)境不適合乳酸菌的生長,從而抑制乳酸菌發(fā)酵黃漿水的后發(fā)酵品質(zhì),易污染雜菌。綜合發(fā)酵周期、產(chǎn)酸量等方面的因素,發(fā)酵時間在16 h 時發(fā)酵液的pH 值和產(chǎn)酸量均較好,此時發(fā)酵液pH 值為4.11,產(chǎn)酸量為66.01 g/L。

      圖2 不同發(fā)酵時間對發(fā)酵黃漿水產(chǎn)酸量及pH 值的影響Fig.2 Changes of acid production and pH values of the tofu whey during fermentation under different fermentation time

      由圖3可知,隨著接種量的增加,發(fā)酵24 h內(nèi),酸漿的產(chǎn)酸量先增加后降低,pH 值先降低后升高,當(dāng)接種量為5%時,酸漿的pH 值下降最快,同時產(chǎn)酸量也增加最多,當(dāng)接種量超過5%時酸漿的pH 值開始上升,產(chǎn)酸量逐漸下降,接種量為5%時酸漿的pH 值為3.6,產(chǎn)酸量為47.03 g/L。當(dāng)接種量過低,乳酸菌的生長緩慢,導(dǎo)致產(chǎn)酸速率較慢;當(dāng)接種量過大時,乳酸菌生長過快,會造成發(fā)酵液內(nèi)菌體密度過高,抑制乳酸菌后期生長,從而抑制其產(chǎn)酸。綜上所述,本研究選擇5%的乳酸菌接種量進(jìn)行后續(xù)研究。

      圖3 不同接種量對發(fā)酵黃漿水產(chǎn)酸量及pH 值的影響Fig.3 Changes of acid production and pH values of the tofu whey during fermentation under different inoculum amounts

      由圖4可知,當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時間由8 h 升至12 h時,產(chǎn)酸量緩慢升高,pH 值顯著上升。當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時間由12 h 升至16 h 時,產(chǎn)酸量迅速降低,pH 值緩慢降低后趨于平穩(wěn)。隨著預(yù)培養(yǎng)時間的逐漸延長,pH 值并沒有顯著降低,這說明并非預(yù)培養(yǎng)時間越長越好。由于乳酸菌在8 h 時為對數(shù)生長期初期,綜合乳酸菌生長周期、產(chǎn)酸量等方面的因素,預(yù)培養(yǎng)時間為8 h 時發(fā)酵液pH 值最好,產(chǎn)酸量較好,此時發(fā)酵液的pH 值為3.4,產(chǎn)酸量為46.04 g/L。

      圖4 不同預(yù)培養(yǎng)時間對發(fā)酵黃漿水產(chǎn)酸量及pH 值的影響Fig.4 Changes of acid production and pH values of the tofu whey during fermentation under different preculture time

      在乳酸菌發(fā)酵黃漿水單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,以發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、乳酸菌接種量、預(yù)培養(yǎng)時間為影響乳酸菌發(fā)酵黃漿水產(chǎn)酸量的因素,其正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表2。

      表2 正交試驗(yàn)L9(34)結(jié)果及分析Table 2 Results and analysis of the orthogonal experiment L9(34)

      (續(xù)表2)

      通過表2的正交試驗(yàn)結(jié)果可知,根據(jù)r 值確定影響乳酸菌發(fā)酵黃漿水產(chǎn)酸量的因素由主到次依次為:A(發(fā)酵時間)>D(預(yù)培養(yǎng)時間)>C(接種量)>B(發(fā)酵溫度);影響乳酸菌發(fā)酵黃漿水pH 值的因素由大到小依次為:D(預(yù)培養(yǎng)時間)>B(發(fā)酵溫度)>A(發(fā)酵時間)>C(接種量)。由極差分析得出各因素的最優(yōu)組合,以產(chǎn)酸量為評價指標(biāo)時,得出最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件是A1D2C2B2;而以pH 值為評價指標(biāo)時,最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件為D3B2A2C2。最終選擇A2D2C2B2為最優(yōu)組合,即:發(fā)酵溫度37 ℃,發(fā)酵時間16 h,預(yù)培養(yǎng)時間12 h,接種量5%。對比課題組前期優(yōu)化的誘變前菌株HCUL 1.1801-1912 純種發(fā)酵酸漿條件,即:發(fā)酵溫度37 ℃,發(fā)酵時間48 h,預(yù)培養(yǎng)時間24 h,接種量5%,產(chǎn)酸量為39.3 g/L??梢园l(fā)現(xiàn)HCUL 1.1901-1912 純種發(fā)酵酸漿所需的發(fā)酵時間及預(yù)培養(yǎng)時間都較HCUL 1.1801-1912 純種發(fā)酵酸漿所需發(fā)酵時間及預(yù)培養(yǎng)時間大大縮短。且HCUL 1.1901-1912 純種發(fā)酵酸漿的發(fā)酵終點(diǎn)產(chǎn)酸為43.11 g/L,比誘變前產(chǎn)酸量高了9.7%。因此,得出HCUL 1.1801-1912 純種發(fā)酵酸漿優(yōu)化后的條件不僅可以保證酸漿發(fā)酵效果,而且可以提高生產(chǎn)效率,對于酸漿發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)化及酸漿豆腐生產(chǎn)制作工業(yè)化提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

      2.2 純種發(fā)酵酸漿有機(jī)酸組成及代謝通路分析

      2.2.1 純種發(fā)酵酸漿有機(jī)酸組成分析 用HPLC法檢測純種發(fā)酵酸漿中的有機(jī)酸組成成分及含量,將誘變前、后菌株發(fā)酵的酸漿作為對比,其有機(jī)酸組成成分及含量如圖5、圖6所示。

      圖5 菌株HCUL 1.1801-1912 及HCUL 1.1901-1912分別純種發(fā)酵2 種有機(jī)酸含量對比圖Fig.5 Two major organic acids concentrations fermented by HCUL 1.1801-1912 and HCUL 1.1901-1912

      圖6 菌株HCUL 1.1801-1912 及HCUL 1.901-1912分別純種發(fā)酵6 種有機(jī)酸含量對比圖Fig.6 Six organic acids concentrations fermented by HCUL 1.1801-1912 and HCUL 1.1901-1912

      由圖5、圖6有機(jī)酸HPLC 分析結(jié)果可知,HCUL 1.1801-1912 純種發(fā)酵的酸漿中8 種有機(jī)酸的含量從大到小分別為:乳酸2 374.78 μg/mL、檸檬酸977.46 μg/mL、琥珀酸35.21 μg/mL、草酸19.57 μg/mL、丙酮酸15.75 μg/mL、α-酮戊二酸9.56 μg/mL、蘋果酸4.16 μg/mL、富馬酸0.10 μg/mL,8 種有機(jī)酸總含量為3 436.61 μg/mL。由此可知,菌株HCUL 1.1801-1912 發(fā)酵黃漿水的過程中主要產(chǎn)乳酸,符合制作酸漿豆腐凝固劑的要求,適合用來點(diǎn)制酸漿豆腐。

      HCUL 1.1901-1912 純種發(fā)酵的酸漿中8 種有機(jī)酸的含量從大到小分別為:乳酸2 904.16 μg/mL、檸檬酸1 106.87 μg/mL、琥珀酸110.67 μg/mL、丙酮酸28.91 μg/mL、草酸19.64 μg/mL、蘋果酸18.58 μg/mL、α-酮戊二酸11.24 μg/mL、富馬酸4.90 μg/mL,8 種有機(jī)酸總含量為4 204.99 μg/mL,其中乳酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、富馬酸分別較誘變前純種發(fā)酵的酸漿提高了1.22,1.13,3.14,1.84,0.01,4.47,1.18,49.00 倍,由此可知,菌株HCUL 1.1901-1912 發(fā)酵黃漿水的過程中主要產(chǎn)乳酸,其次是檸檬酸,其它有機(jī)酸含量較低。

      2.2.2 純種發(fā)酵酸漿的有機(jī)酸代謝通路分析 根據(jù)對乳酸菌代謝通路的研究,結(jié)合酸漿中有機(jī)酸含量變化,繪制圖7為乳酸菌發(fā)酵黃漿水的代謝通路圖。

      圖7 乳酸菌發(fā)酵黃漿水的代謝通路圖(μg/mL)Fig.7 Organic acid metabolic pathway of fermented tofu whey cultured by lactic acid bacteria (μg/mL)

      由圖7可知,乳酸菌加入黃漿水后,利用黃漿水本身的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵。葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞后發(fā)生糖酵解反應(yīng)生成丙酮酸。丙酮酸在L-乳酸脫氫酶的作用下生成乳酸,在未破碎細(xì)胞的情況下進(jìn)行有機(jī)酸檢測,測得的丙酮酸含量較低,乳酸含量很高。這是由于丙酮酸主要作為代謝中間產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)反應(yīng),只有少量丙酮酸在胞外分泌,而乳酸作為初級代謝產(chǎn)物大部分分泌到胞外環(huán)境。這解釋了丙酮酸與乳酸之間為可逆反應(yīng),然而檢測出的結(jié)果顯示乳酸含量遠(yuǎn)大于丙酮酸。丙酮酸在丙酮酸羧化酶的作用下生成草酰乙酸,進(jìn)入三羧酸循環(huán)。草酰乙酸作為代謝中間產(chǎn)物,在胞內(nèi)反應(yīng),因此在胞外的含量極低,以至于無法檢測到。草酰乙酸在蘋果酸脫氫酶的作用下與蘋果酸發(fā)生可逆反應(yīng),同時蘋果酸在蘋果酸脫氫酶(醌)的作用下生成草酰乙酸,檢測出蘋果酸含量卻未檢測出草酰乙酸含量,是由于大部分草酰乙酸轉(zhuǎn)換為蘋果酸,而少量蘋果酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸,說明蘋果酸脫氫酶(醌)為惰性酶。蘋果酸在富馬酸水合酶的作用下與富馬酸發(fā)生可逆反應(yīng),檢測出的蘋果酸含量大于富馬酸含量,富馬酸在琥珀酸脫氫酶作用下與琥珀酸發(fā)生可逆反應(yīng),檢測出的琥珀酸含量也遠(yuǎn)大于富馬酸含量。草酰乙酸在乙醛氧化酶作用下生成草酸,草酸在草酸脫酸酶作用下生成富馬酸,檢測出的草酸含量大于富馬酸含量。產(chǎn)生此結(jié)果是由于富馬酸不斷在胞內(nèi)進(jìn)行三羧酸反應(yīng),只有少量富馬酸在胞外被檢測到。富馬酸代謝生成絡(luò)氨酸和精氨酸,是三羧酸循環(huán)中重要的一個環(huán)節(jié)。琥珀酸先生成琥珀酰-CoA,琥珀酰-CoA再生成α-酮戊二酸,α-酮戊二酸代謝生成精氨酸、抗壞血酸、醛酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和D-谷氨酸。α-酮戊二酸生成異檸檬酸,異檸檬酸生成烏頭順?biāo)幔瑸躅^順?biāo)嵘蓹幟仕?,這個過程中檸檬酸含量大幅提升,說明這幾個過程的酶都比較活躍,檸檬酸在ATP 檸檬酸合酶的作用下又生成草酰乙酸,實(shí)現(xiàn)三羧酸循環(huán)[18-20]。產(chǎn)酸含量的差異對酸漿豆腐的風(fēng)味、蛋白凝聚效果等均會產(chǎn)生影響[21-22]。

      3 結(jié)論

      本研究對酸漿發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,通過發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、乳酸菌接種量及預(yù)培養(yǎng)時間的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,從中選擇對純種乳酸菌發(fā)酵影響最大的4 因素3 水平進(jìn)行正交試驗(yàn)[23-26]。通過正交試驗(yàn)優(yōu)化得到黃漿水純種發(fā)酵產(chǎn)酸量最佳的發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度37 ℃,發(fā)酵時間16 h,預(yù)培養(yǎng)時間12 h,接種量5%,產(chǎn)酸量達(dá)6.57 g/L。將HCUL 1.1901-1912 純種發(fā)酵黃漿水得到的酸漿和HCUL 1.1801-1912 純種發(fā)酵黃漿水得到的酸漿進(jìn)行有機(jī)酸對比分析,可知誘變后的耐高溫菌HCUL 1.1901-1912 有機(jī)酸種類不變,且各個有機(jī)酸含量均大幅增長,特別是乳酸的含量顯著提高[27]。其中乳酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、富馬酸分別較誘變前的乳酸菌HCUL 1.1801-1912 純種發(fā)酵的酸漿提高了1.22,1.13,3.14,1.84,0.01,4.47,1.18,49.00 倍。不同種類的有機(jī)酸含量增長可在一定程度上豐富酸漿豆腐產(chǎn)品的風(fēng)味及蛋白凝聚性[28]。因此,本研究得到的乳酸菌純種發(fā)酵酸漿優(yōu)化條件,可以為以黃漿水為發(fā)酵基質(zhì)開發(fā)的發(fā)酵凝固劑提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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