胥思彤　朱旭江　王蘭霞　劉競　葉青　高嘉雯　張邁娜

【摘 要】 目的：建立前列安通片薄層鑒別和多成分含量測(cè)定的方法。方法：采用薄層色譜法（Thin Layer chromatography，TLC）對(duì)關(guān)黃柏、赤芍、丹參、白芷進(jìn)行定性鑒別;采用超高效液相色譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）同時(shí)測(cè)定鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和丹酚酸B 7 種成分的含量，并進(jìn)行聚類分析和主成分分析。結(jié)果：TLC 鑒別方法專屬性強(qiáng)，能夠有效鑒別4味藥材;7 種成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.9997），平均加樣回收率96.00%～100.99%，RSD<3.0%;批次間各成分含量RSD均>10.0%，其差異性主要來源于關(guān)黃柏。結(jié)論：本研究建立的質(zhì)量控制方法穩(wěn)定可行，為前列安通片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供參考，并提示廠家在生產(chǎn)的制劑的過程中要進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)關(guān)黃柏藥材的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 前列安通片;含量測(cè)定;質(zhì)量評(píng)價(jià);聚類分析;主成分分析

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2022）14-0071-07

Quality Evaluation of Qianlie Antong Tablets

XU Sitong¹ZHU Xujiang²WANG Lanxia^1*LIU Jing¹YE Qing¹GAO Jiawen¹ZHANG Maina¹

1.Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730000 China;

2. Gansu Institute for Drug Control，Lanzhou 730000，China

Abstract：Objective To establish a methods for chromatographic identification and quantitative determination in Qianlie Antong Tablets. Methods phellodendri Amuiensis Cortex， Paeoniae Rubra， Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma and Angelicae Dahuricae Radix in Qianlie Antong Tablets were identified by TLC; UPLC was applied to simultaneously determine phellodendrine hydrochloride， magnoflorine， alibiflorin， paeoniflorin， berberine hydrochloride， palmatine hydrochloride and salvianolic acid B， and cluster analysis and principal component analysis were carried out. Results TLC identification method was specific， which could effectively identify the four herbs;Seven constituents showed good linear relationship within their own ranges （r≥0.9997）， whose average recoveries were 96.00%～100.99% with the RSDs of less than 3.0%.respectively（RSD<3.0%）. The RSD of each component content was more than 10.0%， and the differences were mainly derived from phellodendri Amuiensis Cortex. Conclusion The established quality control method is stable and feasible， which can provide reference for improving the quality of Qianlie Antong Tablets. It is suggested that the quality control of phellodendri Amuiensis Cortex should be further strengthened in the process of producing preparations.

Key words：Qianlie Antong Tablets; Content Determination; Quality evaluation; Cluster Analysis; Principal Component Analysis

前列安通片是由關(guān)黃柏、赤芍、丹參、桃仁、澤蘭、烏藥、王不留行和白芷組成的復(fù)方制劑，具有清熱利濕、活血化淤之功效，用于治療濕熱淤阻證，癥見尿頻、尿急、排尿不暢、小腹脹痛等，常用于治療前列腺炎類疾病^[1-3]。其中君藥關(guān)黃柏中生物堿類成分、臣藥赤芍和丹參中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和丹酚酸B具有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、降壓、抗氧化、抗腫瘤等作用^[4-6]。目前，前列安通片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只包含關(guān)黃柏和赤芍的鑒別項(xiàng)目和鹽酸小檗堿的含量測(cè)定項(xiàng)目，缺少對(duì)其他有效成分的檢測(cè)，不能全面反映其質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)通過TLC法和UPLC法對(duì)前列安通片中各成分進(jìn)行定性鑒別及定量檢測(cè)，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法綜合評(píng)價(jià)制劑質(zhì)量，分析批次間的差異，以期為更為全面、合理地評(píng)控前列安通片的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 自動(dòng)薄層點(diǎn)樣儀及成像儀（瑞士CAMAG公司）;ME 204（0.1 mg）、MS205（0.01 mg）、XPE26（0.001 mg）電子天平（瑞士METTLER公司）;KQ-500DE超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）;硅膠G薄層板（德國Merck公司、青島海洋化工有限公司）;Agilent 1290 UPLC色譜儀（美國安捷倫公司）。

1.2 材料 前列安通片（批號(hào)：2001086001、2003086303、2004086001、2004088301、2004090301、2005086301、2005088301、2005087001、2005088301、2006086001）由甘肅獨(dú)一味生物制藥股份有限公司提供。關(guān)黃柏、丹參、赤芍、白芷對(duì)照藥材（批號(hào)分別為：120937-201408、120923-201816、12093-201303、120945-2201510）均購自中國食品藥品檢定研究院。原兒茶醛（批號(hào)：110810-201608，純度：99.3%）、芍藥苷（批號(hào)：110736-201943，純度：95.1%）、鹽酸小檗堿（批號(hào)：110713-201814，純度：86.7%）、鹽酸黃柏堿（批號(hào)：11895-201805，純度：94.9%）、鹽酸巴馬?。ㄅ?hào)：110732-201913，純度：85.7%）、丹酚酸B（批號(hào)：11562-201716，純度：94.1%）對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院;木蘭花堿（批號(hào)：wkq20031310，純度：98%）、芍藥內(nèi)酯苷（批號(hào)：wkq20040106，純度：98%）對(duì)照品均購自四川省維克奇生物科技有限公司。乙腈為色譜純，購自德國Merck公司;其余試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 關(guān)黃柏鑒別 取1.0 g樣品粉末、0.2 g關(guān)黃柏對(duì)照藥材和1.0 g缺關(guān)黃柏陰性樣品，加乙酸乙酯20 mL，超聲30 min，過濾，蒸至1.5 mL，即得供試品液、關(guān)黃柏對(duì)照藥材液和陰性樣品液。將8 μL的上述3種溶液點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）展開，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至顯色，顯出與關(guān)黃柏對(duì)照藥材相同顏色的主斑點(diǎn)，陰性無干擾。如圖1 A所示。

2.1.2 赤芍鑒別 取1.0 g樣品粉末、0.1 g赤芍對(duì)照藥材和1.0 g缺赤芍陰性樣品，加無水乙醇25 mL，超聲20 min，過濾，蒸至1.5 mL，即得供試品液、赤芍對(duì)照藥材液和陰性樣品液。取芍藥苷對(duì)照品適量，加甲醇制成0.5 mg/mL的對(duì)照品液。將4 μL對(duì)照藥材液及8 μL其余3種溶液點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶12∶0.2）展開，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至顯色，顯出與赤芍對(duì)照藥材、芍藥苷對(duì)照品相同顏色的主斑點(diǎn)，陰性無干擾。如圖1 B所示。

2.1.3 丹參鑒別 取6.0 g樣品粉末、1.0 g丹參對(duì)照藥材和6.0 g缺赤芍陰性樣品，加水100 mL，加熱煮30 min，離心，取上清液，用乙酸乙酯提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL，即得供試品液、丹參對(duì)照藥材液和陰性樣品液。取原兒茶醛對(duì)照品適量，加甲醇制成0.2 mg/mL的對(duì)照品液。將10 μL上述4種溶液點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸（10∶1∶1）展開，噴以3%三氯化鐵乙醇溶液顯色，顯出與丹參對(duì)照藥材、原兒茶醛對(duì)照品相同顏色的主斑點(diǎn)，陰性無干擾。如圖1 C所示。

2.1.4 白芷鑒別 取3.0 g樣品粉末、1.0 g白芷對(duì)照藥材和3.0 g缺赤芍陰性樣品，加水100 mL，加熱煮30 min，離心，取上清液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，二氯甲烷提取2次，每次20 mL，合并二氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL，即得供試品液、白芷對(duì)照藥材液和陰性樣品液。將5 μL上述3種溶液點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇（20∶1）展開，置紫外燈光（365 nm）下檢視，顯出與白芷對(duì)照藥材相同顏色的熒光主斑點(diǎn)，陰性無干擾。如圖1 D所示。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC CSH-C₁₈色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）;流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～5 min，5%～10%A;5～8 min，10%A;8～10 min，10%～12%A;10～14 min，12%～17%A;14～16 min，17%～21%A;16～18 min，21%A;18～23 min，21%～60%A）;流速：0.4 mL/min;檢測(cè)波長：230 nm（木蘭花堿、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷）、286 nm（鹽酸黃柏堿）、345 nm（鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、丹酚酸B）;柱溫：40 ℃;進(jìn)樣量：2 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液 分別稱取鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、丹酚酸B的對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成濃度分別為5.504 μg/mL、29.831 μg/mL、21.599 μg/mL、22.862 μg/mL、36.726 μg/mL、11.038 μg/mL、24.428 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 樣品溶液 取適量去包衣樣品粉末，精密稱定0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲30 min，冷卻后再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足損失重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液 按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中處方的比例及制法，分別制為缺關(guān)黃柏、赤芍、丹參的陰性樣品，按上述方法制備成陰性樣品溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)取“2.2.2、2.2.3、2.2.4”項(xiàng)下溶液，按上述方法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，7種成分與相鄰組分均達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均不低于10000，樣品溶液中的7個(gè)指標(biāo)成分的色譜峰與對(duì)照品溶液相對(duì)應(yīng)，缺關(guān)黃柏陰性在鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀色譜峰處無檢出、缺赤芍陰性在芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷色譜峰處無檢出、缺丹參陰性在丹酚酸B色譜峰處無檢出。

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密稱取鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、丹酚酸B的對(duì)照品 2.90 mg、7.61 mg、5.51 mg、6.01 mg、10.59 mg、3.22 mg、6.49 mg，置于50 mL容量瓶中，加50%甲醇制成對(duì)照品儲(chǔ)備液。將對(duì)照品儲(chǔ)備液加50%甲醇分別稀釋成2、5、10、25倍的稀釋液。按上述方法進(jìn)樣測(cè)定5種不同濃度的對(duì)照品溶液，以峰面積為縱軸，對(duì)照品濃度為橫軸，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品適量，按上述方法制備，連續(xù)6次測(cè)定，測(cè)得鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、丹酚酸B的峰面積RSD（n=6）分別為0.80%、1.32%、1.85%、0.27%、0.83%、1.05%、0.52%，儀器的精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性考察 取樣品（批號(hào)：2006086001）適量，按上述方法制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、丹酚酸B的含量RSD（n=6）分別為1.57%、1.96%、1.33%、1.63%、2.78%、2.63%、1.40%，該方法的重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.7”項(xiàng)下供試品溶液，分別在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h測(cè)定，測(cè)得鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、丹酚酸B的峰面積RSD（n=7）分別為1.33%、1.14%、1.80%、1.44%、0.66%、1.04%、1.10%，樣品溶液24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱9份樣品（批號(hào)：2001086001）0.1 g，加入相當(dāng)于已知含量的50%、100%、150%對(duì)照品儲(chǔ)備液，各3份。按上述方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果見表2。

2.2.11 樣品含量測(cè)定 取10批前列安通片樣品，按上述方法制備并進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果見表3。

2.2.12 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析 將10批前列安通片測(cè)得的7種成分的兩次平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)含量測(cè)定結(jié)果作為變量，運(yùn)用SPSS 19.0進(jìn)行聚類分析。結(jié)果如圖3所示;運(yùn)用SIMCA 14.1處理，并采用主成分分析法得到10批樣品得分圖和7種成分的載荷貢獻(xiàn)圖。如圖4、圖5所示。圖3顯示，可將10批前列安通片分為2類，其中批次2004086001、2004087301、2004090301、2005086301、2006086001為第一類;2001086001、2003086303、2004088301、2005087001、2005088301為第二類。圖4顯示，10批前列安通片可分為與聚類分析結(jié)果一致的2類。分析圖5發(fā)現(xiàn)，木蘭花堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿4種成分的權(quán)重占比較高，表明其對(duì)上述分類間的質(zhì)量差異性有關(guān)鍵影響，4種成分均系關(guān)黃柏的特征成分。

3 討論

3.1 TLC鑒別 本實(shí)驗(yàn)對(duì)前列安通片中關(guān)黃柏、赤芍、丹參、白芷4味藥材的TLC鑒別條件進(jìn)行了考察和優(yōu)化。為鑒定黃柏與關(guān)黃柏的混用情況，選擇可以鑒別關(guān)黃柏特有成分黃柏酮成分的方法^[7-8]。此方法參考2020版《中國藥典》的關(guān)黃柏[鑒別]項(xiàng)下方法^[7]，使關(guān)黃柏的鑒別更具專屬性。原標(biāo)準(zhǔn)中赤芍的TLC鑒別中使用乙醇提取，陰性對(duì)照品色譜中干擾較多，故選擇無水乙醇為提取溶液，且添加了赤芍對(duì)照藥材。白芷方法參考2020版《中國藥典》中川芎茶調(diào)丸[鑒別]（3）項(xiàng)下方法^[7]，同時(shí)比較了提取溶液二氯甲烷及三氯甲烷，提取pH值2～3及pH值10～12，最終確定此方法。

由于制作工藝需長時(shí)間高溫煎煮，有效成分易進(jìn)行轉(zhuǎn)化，如在考察桃仁時(shí)出現(xiàn)斑點(diǎn)位置相同，顏色不一致的情況，故其余4味藥材TLC鑒別還需進(jìn)一步研究。

3.2 含量測(cè)定

3.2.1 提取方法的選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑：（100%、70%、50%）甲醇、50%乙醇和水及超聲時(shí)間：15 min、30 min、45 min，發(fā)現(xiàn)為50%甲醇及超聲30 min時(shí)，對(duì)7種成分的提取值較高。

3.2.2 色譜條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相A：甲醇、乙腈，流動(dòng)相B：0.1%、0.4%磷酸及0.1%甲酸;柱溫：30 ℃、35 ℃、40 ℃及體積流量：0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min，并調(diào)整梯度條件^[9-11];在波長190～400 nm間進(jìn)行光譜掃描，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)^[7，12-13]，綜合考慮各成分的分離度與峰型，最終建立的色譜條件如“2.2.1”項(xiàng)中所述，其中鹽酸黃柏堿在樣品中230 nm時(shí)分離度小于1.2，故選擇在286 nm檢測(cè)。比較同品牌規(guī)格為2.1 mm×100 mm，1.7 μm的CSH-C₁₈和BEH-C₁₈色譜柱，結(jié)果表明CSH-C₁₈色譜柱對(duì)各成分的分離更好。

3.2.3 樣品分析 由表3可看出，不同批次樣品各成分含量的RSD均大于10%，說明各批次間均一性較差。結(jié)合主成分分析及聚類分析，發(fā)現(xiàn)批次間含量差異來源于關(guān)黃柏，說明其原因可能來自于投料時(shí)關(guān)黃柏的質(zhì)量差異。查閱文獻(xiàn)[14-16]后發(fā)現(xiàn)，關(guān)黃柏藥材中生物堿類成分受種質(zhì)、生長年限和產(chǎn)地的影響較大。同時(shí)也可能因廠家投料比例不精準(zhǔn)及生產(chǎn)工藝的影響，對(duì)制劑質(zhì)量產(chǎn)生影響。所以為提高不同批次間前列安通片質(zhì)量的一致性，廠家在生產(chǎn)檢驗(yàn)中應(yīng)增加木蘭花堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿作為其指標(biāo)成分，這樣更能夠準(zhǔn)確控制前列安通片的質(zhì)量并確保藥物的有效性。

為了提高前列安通片的一致性，廠家對(duì)采購的藥材，除了對(duì)關(guān)黃柏質(zhì)量的把控，嚴(yán)格以藥典的品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，也應(yīng)盡量規(guī)定其種質(zhì)、產(chǎn)地及生長年限，即通過對(duì)藥源的限制從而控制前列安通片的質(zhì)量。在加工生產(chǎn)中，注意不同批次間的投料比，并優(yōu)化生產(chǎn)工藝，提高不同批次間制劑質(zhì)量的均一性。在質(zhì)控中增加對(duì)關(guān)鍵成分木蘭花堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿的檢測(cè)項(xiàng)目，通過網(wǎng)絡(luò)化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)高效、有針對(duì)性地對(duì)前列安通片進(jìn)行質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)所建立的關(guān)黃柏、赤芍、丹參、白芷的TLC法及同時(shí)測(cè)定前列安通片中7種成分含量的UPLC法科學(xué)、準(zhǔn)確，可為更為全面的評(píng)控前列安通片的質(zhì)量提供參考價(jià)值。

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（收稿日期：2021-11-23 編輯：黃麗君）