固本平喘方納米脂質(zhì)體霧化吸入劑改善哮喘豚鼠病理狀態(tài)的研究

貫劍 宋紅普 張曉曉 張彤

【摘要】目的：研究固本平喘方霧化吸入后治療效果。方法：將39只豚鼠分為正常對(duì)照組、哮喘模型組、中藥對(duì)照組、固本平喘吸入劑小劑量組、固本平喘吸入劑大劑量組、西藥對(duì)照組6組，采用固本平喘中醫(yī)納米脂質(zhì)體霧化吸入，觀察一般情況、血常規(guī)和病理改變。結(jié)果：模型組與其他組比較，白細(xì)胞（WBC）、嗜酸性細(xì)胞（EO）水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常組由于霧化等因素影響，存在肺動(dòng)脈壁增厚和輕微炎癥的情況。哮喘模型組的炎癥情況最為嚴(yán)重，動(dòng)脈壁增厚。中藥對(duì)照組炎癥情況減輕，伴有肉芽組織增生。結(jié)論：固本平喘方納米脂質(zhì)體霧化吸入劑對(duì)哮喘豚鼠的病理學(xué)有一定的改善作用。

【關(guān)鍵詞】固本平喘方;霧化吸入;哮喘;豚鼠;病理學(xué)

【中圖分類號(hào)】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1007-8517（2022）11-0009-05

StudyonthePathologicalStateoftheNebulizedNanoliposome

InhalationofGubenPingchuanFormulaonAsthmaticGuineaPigs

GUANJian1SONGHongpu2ZHANGXiaoxiao3ZHANGTong2

1.LiangyuanHospitaloftraditionalChinesemedicine，Shangqiu476000，China;

2.ShanghaiUniversityoftraditionalChinesemedicine，Shanghai200030，China;

3.PutuoHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityoftraditionalChinesemedicine，Shanghai200062，China

Abstract：ObjectiveToassesstheinhalationtherapyofnebulizedGubenPingchuan.Method39guineapigsweredividedintosixgroups：normalcontrolgroup，asthmamodelgroup，traditionalChinesemedicinecontrolgroup，GubenPingchuanlow-doseinhalationgroup，GubenPingchuanhigh-doseinhalationgroup，andWesternmedicinecontrolgroup.ThenebulizednanoliposomesofGubenPingchuanwereinhaledbythesixgroupsandwemeasuredtheallergy-relatedimmunologicalindicators.ResultThelevelsofWBCandeosinophil（EO）weresignificantlyhigherinmodelgroupandothergroups.Thenormalgrouphadpulmonaryarterywallthickeningandslightinflammationduetoatomizationandotherfactors.Theinflammationofasthmamodelgroupwasthemostserious，andthearterialwallwasthickened.Inthecontrolgroup，inflammationwasalleviated，accompaniedbygranulationtissuehyperplasia.ConclusionThenebulizednanoliposomeinhalationofGubenPingchuancouldimprovethepathologyofasthmaticguineapigstoacertainextent.

Keywords：GubenPingchuanFormula;NebulizedInhalation;Asthma;GuineaPigs;Pathologically

固本平喘方具有益氣平喘、脫敏解毒的功效，筆者在臨床上長(zhǎng)期使用霧化吸入劑治療哮喘有較好效果，但方式多為簡(jiǎn)單的霧化吸入，多數(shù)臨床觀察[1-3]僅停留在經(jīng)驗(yàn)層面，實(shí)驗(yàn)研究的機(jī)理不明確，本項(xiàng)研究，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來客觀地觀察和評(píng)價(jià)其治療效果，探討其在細(xì)胞的作用機(jī)理。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥物

1.1.1治療用藥固本平喘霧化吸入劑（以下簡(jiǎn)稱固本平喘方）：每毫升含1g生藥量，由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供。

1.1.2陽(yáng)性對(duì)照藥小青龍合劑（湖北福廣制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z42021495）。功能主治是解表化飲，止咳平喘，用于風(fēng)寒水飲，惡寒發(fā)熱，無汗，喘咳痰稀。每支裝10mL。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物英國(guó)種普通級(jí)健康豚鼠39只，體重250～300g，均由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，普通級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)[上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SYXK（滬）2004-0005]。

1.3設(shè)備與試劑

1.3.1設(shè)備貝爾思超聲霧化器（BSW-2A型）由鞍山市貝爾思電子有限公司生產(chǎn)。希森美康（XE-2100）全自動(dòng)血球分析裝置，由日本SYSMEXCORPORATIION公司生產(chǎn)。萊卡SP1600切片機(jī)由上海萊卡儀器有限公司生產(chǎn)。奧林巴斯CX31顯微鏡。隔水式恒溫箱（PYX-DHS型）上海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠生產(chǎn)。

1.3.2試劑卵蛋白粉（OVA），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：F20110811）。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1造模方法將豚鼠正常飼養(yǎng)1周后開始進(jìn)行致敏。第1天，先用75%乙醇溶液消毒局部皮膚后，給哮喘模型組、高劑量組、低劑量組及中藥對(duì)照組、西藥對(duì)照組每只豚鼠腹腔注射10%卵蛋白生理鹽水溶液1.6mL（6mL/kg，另有0.1mL損耗）致敏?？瞻讓?duì)照組用0.9%生理鹽水。第8天，再次注射致敏，各組劑量和方法同前。

2.2模型評(píng)價(jià)指標(biāo)第14天開始激發(fā)引喘，將豚鼠置于4L的玻璃鐘罩內(nèi)用1%卵蛋白霧化吸入15～30s，觀察20～30s，誘發(fā)哮喘發(fā)作（說明模型成功）。如豚鼠出現(xiàn)抽搐，馬上將其取出。以后隔天進(jìn)行1次引喘，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。同時(shí)，從第14天起，引喘后1h各組進(jìn)行相應(yīng)治療。至第28天，各組動(dòng)物處死，提取樣本。

2.3分組與治療方法A正常對(duì)照組：致敏、激發(fā)以及治療均以0.9%生理鹽水代替。B哮喘模型組：造模成功后每天吸入1%OVA溶液激發(fā)1次。C中藥對(duì)照組：霧化吸入小青龍合劑1g/次。D固本平喘吸入劑小劑量組：霧化吸入劑1g/次。E固本平喘吸入劑大劑量組：霧化吸入劑3g/次。F西藥對(duì)照組：霧化吸入地塞米松1g/次。

2.4血常規(guī)檢測(cè)采用全自動(dòng)血球分析裝置自動(dòng)分析血常規(guī)全套。

2.5肺組織病理學(xué)檢查各組豚鼠分別于末次激發(fā)后24h內(nèi)用2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉下開胸。取右肺下葉組織，置4%甲醛固定，24h后酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片行HE染色，光鏡下觀察支氣管周圍炎性病變。

2.5.1肺組織切片制備①切取標(biāo)本同一部位組織，大小約2mm×1mm×1mm;②以乙醇進(jìn)行梯度脫水（80%乙醇1次、95%乙醇2次、100%乙醇3次）;③浸二甲苯2次，以透明;④用58℃低熔點(diǎn)石蠟浸蠟2次;⑤包埋蠟塊;⑥5um常規(guī)切片，裱于防脫片劑處理過的干凈載玻片上;⑦置60℃恒溫箱中烤片3h，備用。

2.5.2肺組織HE染色①切片以二甲苯脫蠟2次;②以乙醇進(jìn)行梯度脫水（100%乙醇3次、95%乙醇2次、80%乙醇1次）;③在蒸餾水中停留2min后，以蘇木素溶液染細(xì)胞核;④自來水沖洗，去掉浮色;⑤1%鹽酸酒精分化;⑥蒸餾水漂洗后，以1%伊紅酒精溶液染細(xì)胞質(zhì);⑦以乙醇進(jìn)行梯度脫水（80%乙醇1次、95%乙醇2次、100%乙醇3次）;⑧以二甲苯透明，樹脂膠封片。光鏡下觀察。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）方式表示，多組之間均數(shù)比較采用方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1一般情況變化各組在被激發(fā)后癥狀表現(xiàn)不同，正常對(duì)照A組豚鼠表現(xiàn)精神活躍、反應(yīng)靈敏、呼吸平穩(wěn)，無明顯呼吸急促、困難和喘鳴音，模型組合各用藥組豚鼠在吸入OVA后不久出現(xiàn)躁動(dòng)、搔抓顏面等情況，部分豚鼠出現(xiàn)呼吸急促、腹式呼吸，甚至哮鳴音等。在末次激發(fā)時(shí)，小劑量治療D組豚鼠未出現(xiàn)哮鳴音和呼吸困難，其他各治療組均有2～3只豚鼠出現(xiàn)輕度呼吸急促、喘鳴等情況。

3.2血常規(guī)變化模型組與其他組比較，WBC、EO水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常組較其他各組的EO水平均低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。D、E、F組的BA水平與模型組比較顯著增高，D、F組與C組比較亦有差異。A組與B組的PMN差別有統(tǒng)計(jì)意義，其余各組無差別。B組與A組比較，LY有顯著差別，D、E、F組與B組的差別也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表1。

3.3固本喘方對(duì)病理學(xué)的影響肺組織病理學(xué)觀察變化情況，A正常對(duì)照組：支氣管及周圍肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺動(dòng)脈壁輕度增厚，有2例伴有輕度間質(zhì)性肺炎。B哮喘模型組：肺動(dòng)脈壁增厚，細(xì)支氣管腔內(nèi)充滿炎性分泌物，有2例伴有肺間質(zhì)纖維組織增生。C中藥對(duì)照組：肺內(nèi)細(xì)支氣管壁及管周見少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腔內(nèi)少量分泌物。小灶性肺組織結(jié)構(gòu)破壞，伴部分肉芽組織增生。D固本平喘吸入劑?。悍蝿?dòng)脈壁增厚，細(xì)支氣管腔內(nèi)少量分泌物，3例出現(xiàn)輕度間質(zhì)性肺炎和局部間質(zhì)性肺炎。E固本平喘吸入劑大：1肺動(dòng)脈壁增厚，輕度間質(zhì)性肺炎。2例出現(xiàn)局部肺組織破壞，伴肉芽組織增生。F西藥對(duì)照組：肺動(dòng)脈壁增厚，輕度間質(zhì)性肺炎。2例出現(xiàn)肺組織結(jié)構(gòu)破壞，另有1例局部肺出血。A組：圖①、②;B組：圖③、④;C組：圖⑤、⑥;D組：圖⑦、⑧;E組：圖⑨、⑩;F組：圖B11、B12（如下圖所示）。

4討論

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，反復(fù)接觸過敏原導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)性炎癥是多數(shù)哮喘發(fā)作的基本機(jī)制。中藥復(fù)方固本平喘方（包括黃芪、白術(shù)、黃芩、甘草、麻黃、烏梅等）是臨床經(jīng)驗(yàn)方基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代研究進(jìn)展優(yōu)化配伍而成，具有益氣平喘、脫敏解毒的功效。中藥?kù)F化吸入劑治療哮喘有較好效果，但方式多為簡(jiǎn)單的霧化吸入，多數(shù)臨床觀察僅停留在經(jīng)驗(yàn)層面，實(shí)驗(yàn)研究的機(jī)理不明確。

白細(xì)胞（WBC）升高是細(xì)菌性炎癥的主要表現(xiàn)，但是在哮喘動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)存在外周血WBC增高的情況，有研究[4]表明中藥復(fù)方能顯著降低大鼠外周血WBC，較模型組有顯著差異。哮喘炎癥的特征性標(biāo)志是嗜酸性細(xì)胞（EOS）的浸潤(rùn)，EOS細(xì)胞漿中含有嗜酸性細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白（ECP）、堿性蛋白（MBP）、嗜酸細(xì)胞衍生的神經(jīng)毒素（EDN）、嗜酸細(xì)胞過氧化物酶（EPO）等特殊蛋白質(zhì)顆粒以及多種炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子和氧自由基，EOS釋放組胺，產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性（AHR），因此EOS是引起遲發(fā)相變態(tài)反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性的關(guān)鍵細(xì)胞，在介導(dǎo)氣道變應(yīng)性炎癥參與支氣管哮喘發(fā)病的調(diào)節(jié)中起重要作用[5]。同時(shí)，EOS在氣道的緩解期也處于高水平，與晚期哮喘反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性關(guān)系密切[6]。淋巴細(xì)胞（LY）包括T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，EOS分化、成熟、聚集又依賴于淋巴細(xì)胞的活化及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)，因此淋巴細(xì)胞在哮喘發(fā)病中也起了關(guān)鍵作用，它影響哮喘的發(fā)生和哮喘氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性，其中T淋巴細(xì)胞具有“中樞性”調(diào)節(jié)作用[7]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，模型組與其他組比較WBC、EO水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明模型組的血液中EO增多，處于一種致敏狀態(tài)。正常組較其他各組的EO水平均低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B組與A組比較，LY有顯著差別，D、E、F組與B組的差別也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示造模后的豚鼠LY明顯升高，而兩個(gè)治療組和西藥組對(duì)于豚鼠外周血的LY有降低作用。

從各組的病理結(jié)果可以看出，正常組由于霧化等因素影響，存在肺動(dòng)脈壁增厚和輕微炎癥的情況。哮喘模型組的炎癥情況最為嚴(yán)重，動(dòng)脈壁增厚。中藥對(duì)照組炎癥情況減輕，伴有肉芽組織增生。兩組治療組同樣有肺動(dòng)脈增厚，并有輕度炎癥存在。西藥組存在肺組織結(jié)構(gòu)受到破壞的情況，以上不排除外界感染的可能。

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（收稿日期：2022-02-25編輯：陶希睿）

基金項(xiàng)目：上海市科委項(xiàng)目[固本平喘霧化吸入劑對(duì)哮喘豚鼠信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因6（STAT6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究]。項(xiàng)目編號(hào)：8ZR1416200。

作者簡(jiǎn)介：貫劍（1973-），男，滿族，博士，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥治療過敏性疾病的臨床和實(shí)驗(yàn)研究。E-mail：475479521@qq.com