劉丹 丁小艷
摘 要:目的:比較不同極性部位提取物抗氧化能力和成分類型,為刺梨葉所含成分進一步研究提供參考方向。方法:通過正交實驗優(yōu)化刺梨葉供試液提取工藝,將提取液分別依次用乙酸乙酯和水飽和正丁醇依次萃取,得到醇層、乙酸乙酯層、正丁醇層、水層,以DPPH自由基清除率和總抗氧化力為評價指標,比較不同層提取物抗氧化能力。結(jié)果:提取條件最佳組合為料液比1∶30、超聲時間60 min、乙醇濃度60%。正丁醇層提取物的抗氧化能力最強。結(jié)論:刺梨葉中富含多酚黃酮類物質(zhì),正丁醇層提取物具有更強的抗氧化能力。
關(guān)鍵詞:總黃酮;總多酚;提取工藝;抗氧化活性
Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activity of Active Substance from Rosa Roxburghii Leaves
LIU Dan1, DING Xiaoyan2
(1.Guizhou Institute for Food and Drug Control, Guiyang 550004, China; 2.Guizhou Material Industry Technology Research Institute, Guiyang 550016, China)
Abstract: Objective: The antioxidant capacity and component types of extracts from different polar parts were compared to provide a reference direction for the further study of the components contained in Rosa roxburghii leaves. Method: The extraction process of the test solution from Rosa roxburghii leaves was optimized by orthogonal experiment. The extract was extracted with ethyl acetate and water saturated n-butanol in turn to obtain alcohol layer, ethyl acetate layer, n-butanol layer and water layer. The antioxidant capacity of the extracts from different layers was compared with DPPH free radical scavenging rate and total antioxidant capacity. Result: The best combination of extraction conditions was solid-liquid ratio 1∶30, ultrasonic time 60 min and ethanol concentration 60%. N-butanol extract has the strongest antioxidant ability. Conclusion: Rosa roxburghii leaves are rich in polyphenols and flavonoids, and n-butanol layer extract has stronger antioxidant capacity.
Keywords: total flavonoids; total polyphenols; extraction process; antioxidant activity
實驗中所用刺梨葉,被2003版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》收錄,是藥食同源植物,在貴州省等地分布較為廣泛,目前在貴州多地有種植基地,為貴州的優(yōu)勢經(jīng)濟作物[1-3]。近年來,刺梨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展得到了貴州省委、省政府的高度重視,大力支持相關(guān)的科學研究。
刺梨葉中的成分對自由基有清除作用。刺梨中的多酚類、黃酮類成分,已被研究證明具有很好的抗氧化作用[4-6]。在近年來的研究中發(fā)現(xiàn)刺梨葉有α-葡萄糖苷酶抑制活性,對2型糖尿病大鼠脂代謝也起一定的治療作用[7-11],這都與刺梨葉的抗氧化機制相關(guān),說明刺梨葉中的抗氧化活性物質(zhì)值得被深入研究,可制成茶葉等飲品,具有廣闊的食品、保健食品應(yīng)用前景。本實驗優(yōu)化刺梨葉活性成分提取工藝,再比較刺梨葉不同極性部位提取物的抗氧化活性。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
刺梨葉樣品為薔薇科薔薇屬植物繅絲花的干燥葉;Folin-Ciocalteu試劑(F-C試劑,自制);沒食子酸對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號110831-201204);蘆丁對照品(成都曼斯特生物有限公司,批號MUST-11040302);水為去離子水;試劑均為分析純。
CARY100-Bio紫外-可見分光光度計(美國瓦里安中國有限公司);DY-H4-型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);KQ-500DB超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);ACCULAB型萬分之一電子天平(深圳市郎普電子科技有限公司);高速中藥粉碎機(上海精宏試驗設(shè)備有限公司);高效液相色譜儀(美國沃特世中國有限公司);ALC-210.4電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司);GZX-GFC-101-2-BS型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海博泰實驗設(shè)備有限公司);80-2臺式低速離心機(上海醫(yī)療器械集團有限公司)。
1.2 實驗方法
1.2.1 溶液制備
(1)提取工藝優(yōu)化供試品溶液制備。刺梨葉干燥后粉碎,過篩,得刺梨葉供試品。稱取適量刺梨葉供試品,加入10倍量的石油醚浸泡達24 h脫色后,過濾,用石油醚洗滌,干燥后稱取1 g樣品于50 mL錐形瓶中,精密稱定,設(shè)置60%乙醇超聲提取,
3 000 r/min離心10 min,取上清液稀釋后待測。
(2)對照品溶液制備。①蘆丁標準溶液的配制。準確稱取蘆丁對照品116.84 mg置于50 mL容量瓶中,用60%乙醇稀釋并定容至刻度,制得2.29 mg/mL對照品儲備液。精密吸取2.5 mL對照品儲備液于25 mL
容量瓶中,60%乙醇稀釋至刻度,制得229.0 μg/mL蘆丁標準液[12]。②沒食子酸標準溶液配制。精密稱取沒食子酸對照品50.0 mg于50 mL容量瓶中,去離子水溶解定容至50 mL,得質(zhì)量濃度為0.899 mg/mL沒食子酸儲備液。精密吸取該儲備液5 mL于50 mL容量瓶中并用去離子水定容至刻度,制得89.9 μg/mL的沒食子酸標準溶液[13]。
(3)抗氧化活性比較供試液制備。精密稱取1.2.1項下脫色并干燥后的刺梨粉20 g,60%乙醇溶液,料液比1∶10(g∶mL),超聲提取60 min,提取2次,過濾。精密吸取濾液50 mL,為醇層,其他濾液減壓蒸發(fā)回收乙醇,剩余水溶液分別采用極性增大的乙酸乙酯和水飽和正丁醇依次萃取,最后為水相部位。
1.2.2 正交實驗
根據(jù)前期的單因素實驗,各條件最佳點為液料比25∶1,超聲時間30 min,乙醇濃度60%。以各最佳點為中心設(shè)計正交實驗。以目標函數(shù)確定達到總黃酮和總多酚的最佳提取條件,選擇加權(quán)綜合評分法,以總黃酮和總多酚各占50%來確定最佳提取工藝[14],因素水平見表1。
1.2.3 總抗氧化力和DPPH自由基清除率測定
(1)總抗氧化力測定。精密稱取不同極性部位提取物于25 mL容量瓶中,制成濃度為2.6 mg/mL的樣品液,將樣品液稀釋10倍,則制得待測液。分別加入待測液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL和4.5 mL于10 mL具塞試管中(空白不加樣液,以同體積超純水代替),加超純水至體積為1.5 mL,加入0.6 mol/L的H2SO4溶液1 mL,28 mmol/L的Na3PO4溶液1.5 mL,4 mmol/L的鉬酸銨溶液1.5 mL,再加超純水至總體積為10 mL,搖勻后置于95 ℃恒溫水浴中1.5 h,取出,冷至室溫,在695 nm波長處測定吸光度。每個樣品平行3次實驗。
(2)DPPH自由基清除率測定。將上述總抗氧化力測定中制成的樣品液稀釋100倍則制得待測液,分別取0.7 mL、1.0 mL、1.3 mL、1.6 mL、1.9 mL和2.2 mL待測液,加超純水至4 mL,再加0.25 mmol/L的DPPH乙醇溶液2 mL,置暗箱中反應(yīng)30 min,于517 nm處測定吸光度。對照不加供試液。每個樣品平行3次實驗。
2 結(jié)果與分析
2.1 正交實驗優(yōu)化
由表2可知,極差分析結(jié)果顯示,提取條件中對測定結(jié)果影響程度由大到小的順序為乙醇濃度、料液比、超聲時間;由k值得,最優(yōu)組合為A1B3C2,得分為664.20分,低于正交實驗表中的最佳組合A3B3C2(684.89分)。因此當料液比1∶30、超聲時間60 min,乙醇濃度60%時,綜合評分最高,提取工藝最佳。
2.2 刺梨葉不同極性部位抗氧化力比較
由表3可知,刺梨葉不同部位的抗氧化能力大小均為水飽和正丁醇層>乙酸乙酯層>醇層>水層。
3 結(jié)論
刺梨葉的藥理活性與其抗氧化機制有關(guān),可開發(fā)相關(guān)的保健食品。實驗前期研究中發(fā)現(xiàn)刺梨葉有很高的抗氧化活性,對刺梨葉的各個極性部位提取物的抗氧化活性進行對比,發(fā)現(xiàn)刺梨葉中起抗氧化作用的物質(zhì)主要在正丁醇層,其次乙酸乙酯層,研究結(jié)果表明有必要對抗氧化能力強的極性部位進行深入研究。
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