曹冰東，付文苑，唐 兵，陶 蓮，王青青，歸俊娥，滕九翠，3，李魁印，鄧 英，孟平紅

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院 貴陽 550025； 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所 貴陽 550006；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 貴陽 550025； 4.貴州省安順學(xué)院 貴州安順 561000）

黃瓜（L.）是葫蘆科作物中具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蔬菜作物之一，在世界各地普遍種植。黃瓜為異花授粉作物，遺傳基礎(chǔ)狹窄，種質(zhì)資源匱乏，雜種優(yōu)勢明顯，在生產(chǎn)上幾乎全部采用雜交一代品種，但純化親本至少需要5 代的連續(xù)自交和定向選擇。利用單倍體育種可在1～2 年獲得純合的二倍體（Double Haploid，DH）株系，極大程度縮短了育種年限，提高了育種效率。同時(shí)，DH 系創(chuàng)制的群體材料能應(yīng)用于抗病、抗蟲、抗旱等性狀的遺傳圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記篩選及基因定位等研究。

1976 年San首次通過未授粉子房培養(yǎng)獲得大麥單倍體植株。隨后，Metwally 等報(bào)道在10 個科植物中誘導(dǎo)出單倍體植株。目前，未授粉子房培養(yǎng)是黃瓜獲得雙單倍體的有效途徑。Sorntip 等通過未授粉子房的誘導(dǎo)、分化和再生培養(yǎng)獲得植株，其培養(yǎng)流程較繁瑣且效率較低。Deng 等報(bào)道了一套誘導(dǎo)效率較高的黃瓜未授粉子房離體培養(yǎng)獲得再生植株的技術(shù)體系，主要技術(shù)路線如下：子房4 ℃預(yù)冷4 d，MS+0.06 mg·LTDZ（噻苯?。?蔗糖3%+瓊脂7%培養(yǎng)基培養(yǎng)，33 ℃熱激暗處理2 d 后轉(zhuǎn)入25 ℃，光照16 h/黑暗8 h 條件下培養(yǎng)直接誘導(dǎo)植株再生，但試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)部分基因型不產(chǎn)胚或胚產(chǎn)量極低，最終不能獲得再生植株。這類現(xiàn)象在南瓜、西葫蘆等作物上也有報(bào)道，這說明提高胚狀體的誘導(dǎo)率是獲得再生植株的前提。蘇賀楠等以高出胚的材料為媒介與低出胚的材料雜交，提高了胚狀體誘導(dǎo)率。出胚能力具有加性效應(yīng)，高出胚能力由顯性核基因控制。不少國內(nèi)外學(xué)者研究或總結(jié)了瓜類作物未授粉子房胚胎發(fā)生的影響因素，但是較系統(tǒng)、全面的研究并不多。筆者比較了不同基因型、播種季節(jié)、栽培方式、取材時(shí)期、子房發(fā)育時(shí)期、培養(yǎng)基附加不同濃度TDZ、不同梯度熱激溫度和不同梯度熱激時(shí)間對黃瓜未授粉子房胚誘導(dǎo)和植株再生的影響；同時(shí)對再生植株的倍性水平、同質(zhì)性，以及生根、馴化、移栽技術(shù)進(jìn)行研究，以期建立適合多種基因型的高頻胚誘導(dǎo)體系，為單倍體育種技術(shù)的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

參試材料為貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所提供的9 個黃瓜材料，材料信息詳見表1。SG033、SG049、SG026 屬于早、中熟品種，適應(yīng)性廣，強(qiáng)雌性，主蔓節(jié)瓜多，品質(zhì)優(yōu)良；SG002、SG035 屬于早、中熟品種，強(qiáng)雄性，植株長勢強(qiáng)，分枝少，葉色為深綠色，第一雄花節(jié)位3～6 節(jié)。試驗(yàn)于2020—2021年在貴州省園藝研究所蔬菜試驗(yàn)地及遺傳育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

表1 黃瓜未授粉子房培養(yǎng)試驗(yàn)材料

噻苯?。?8%）、6-芐氨基腺嘌呤（99%）、α-萘乙酸（96%）、氫氧化鈉、硝酸銀濃縮液購自貴州明涵生物科技有限公司；DNAsecure Plant Kit 試劑盒、2×Talent qPCR PreMix 購自天根生化科技（北京）有限公司；甲醛溶液購自重慶江川工（集團(tuán)）有限公司；30%Acr/Bis 制膠液、10×TBE 緩沖液（pH=8.3）購自酷來搏；過硫酸銨、四甲基乙二胺購自阿拉丁試劑；SSR 標(biāo)記引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 不同基因型對胚狀體誘導(dǎo)的影響 參照Deng 等的方法對上述9 個基因型進(jìn)行未授粉子房培養(yǎng)（稍加改進(jìn)），75%酒精浸泡時(shí)間改為30～50 s，1%次氯酸鈉溶液消毒15 min 左右。每個基因型3 次重復(fù)，每次重復(fù)接種90 個子房片（5 瓶，每瓶18 片）。

1.2.2 不同因素組合對胚狀體誘導(dǎo)的影響 以易出胚基因型SG049 為試材，對播種季節(jié)、種植方式、取材時(shí)期、子房發(fā)育時(shí)期、培養(yǎng)基附加不同濃度TDZ、不同梯度熱激溫度和不同梯度熱激時(shí)間等7因素（3 因素2 水平+4 因素4 水平）進(jìn)行完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共16 個處理，每個處理3 次重復(fù)，每重復(fù)接種90 個子房片（5 瓶，每瓶18 片）。播種季節(jié)：夏播時(shí)間為2020 年4 月19 日，5 月12 日定植，6月10 日開始取樣；秋播時(shí)間為2020 年8 月1 日，8月15 日定植，9 月10 日開始取樣。種植方式：塑料大棚、露地網(wǎng)室；取材時(shí)期：初花期（主蔓雌花開放少于15 朵）、盛花期（主蔓雌花開放15～35 朵之間）。子房發(fā)育時(shí)期：取開花前1 d（-2）、開花前6 h（-1）、開花當(dāng)天（0）、開花后1 d（+1），其中開花當(dāng)天及開花后1 d 的雌花需于開花前套袋防止授粉；不同熱激溫度處理子房：25、33、35、37 ℃，分別暗處理1、2、3、4 d；培養(yǎng)基中附加TDZ 質(zhì)量濃度為：0.03、0.06、0.08、0.10 mg·L。以MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基（4.43 g·LMS 粉+30 g·L蔗糖+7 g·L瓊脂，pH=5.8～6.0）。

1.2.3 再生植株倍性鑒定 利用流式細(xì)胞儀（Partec，Münster，Germany）鑒定再生植株的倍性水平，參考Deng 等的方法進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)呈現(xiàn)的峰值判斷再生植株的倍性。

1.2.4 SSR 分子標(biāo)記分析 經(jīng)倍性鑒定為二倍體的組培苗，隨機(jī)選取6 株用于同質(zhì)性檢驗(yàn)。采用DNA secure Plant Kit 試劑盒提取DNA 基因組，用濃度為1%瓊脂糖凝膠檢測DNA 基因組的完整性。從55 對SSR 物（表2）中篩選具有多態(tài)性的標(biāo)記用于再生植株同質(zhì)性檢驗(yàn)。擴(kuò)增總體系為20 μL：模板DNA 1 μL，前引物和后引物各1 μL，Mix 10 μL，ddHO 7 μL。擴(kuò)增程序在PCR 儀中進(jìn)行：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，24 個循環(huán)；72 ℃延伸5min，最后4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在7.2%聚丙烯酰胺電泳、銀染、顯色后進(jìn)行分析。

表2 SSR 標(biāo)記引物的信息

續(xù)表2

1.2.5 生根、馴化及移植 每個基因型的再生植株擴(kuò)繁80 株后進(jìn)行生根及移栽試驗(yàn)。2649 的再生植株接種于R 培養(yǎng)基（1/2 MS+0.02 mg·LNAA）、S培養(yǎng)基（MS+0.02 mg·LNAA）進(jìn)行生根誘導(dǎo)，篩選最佳生根培養(yǎng)基。3533、3335、4902 的再生植株接種于最佳生根培養(yǎng)基在相同條件下進(jìn)行誘導(dǎo)生根。每個處理接4 瓶，每瓶接5 株，設(shè)3 次重復(fù)。當(dāng)生根充分且植株葉片生長至4～7 片時(shí)，擰松瓶蓋室內(nèi)馴化1 d，再揭開瓶蓋室內(nèi)馴化1 d，將其移植于含泥炭+珍珠巖+蛭石（體積比3∶1∶1）混合基質(zhì)的營養(yǎng)缽（直徑12 cm，高9 cm）中，在人工氣候箱內(nèi)（晝夜溫度25 ℃/18 ℃、光照度3500 lx，光照時(shí)間12 h）馴化14 d，將成活植株定植于溫室大棚，常規(guī)肥水管理。馴化前10 d 隔天噴施1 次自制營養(yǎng)液（4.43 g·LMS+30 g·L蔗糖，pH=5.8）。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 出胚率 以子房片表面產(chǎn)生明顯胚狀體結(jié)構(gòu)時(shí)記為出胚；出胚率/%=出胚子房數(shù)/接種子房總數(shù)×100。

1.3.2 植株再生率 當(dāng)胚狀體誘導(dǎo)出具有莖、葉和芽的組織時(shí)記為植株再生；植株再生率/%=形成完整植株數(shù)/接種子房總數(shù)×100。

1.3.3 馴化成活率 營養(yǎng)缽中的植株生出新根和嫩芽時(shí)記為植株馴化成活；馴化成活率/%=馴化成活植株數(shù)/馴化植株總數(shù)×100。

1.3.4 定植成活率 定植于溫室大棚的植株能正常生長時(shí)記為植株定植成活；定植成活率/%=定植成活植株數(shù)/定植植株總數(shù)×100。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2019 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖，用DPS 18.10 進(jìn)行顯著性（Duncan）分析，用Photoshop 2019 軟件處理圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜子房培養(yǎng)形成再生植株的過程

黃瓜子房接種到培養(yǎng)基后35 ℃熱激暗處理2 d，子房片表面顏色由綠變黃且胚珠開始膨大（圖1-A～B），轉(zhuǎn)入25 ℃光照培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)7 d，膨大的胚珠從組織中突出并繼續(xù)發(fā)育（圖1-C）。繼續(xù)培養(yǎng)20 d，胚狀體突破珠被（圖1-D），發(fā)育成球形胚（圖1-E）、心形胚（圖1-F）、魚雷形胚（圖1-G）和子葉形胚（圖1-H）。子葉形胚分化形成具有明顯根和葉的組織（圖1-I），切取小植株進(jìn)行增殖培養(yǎng)（圖1-J、K），形成具有莖、葉和芽的再生植株（圖1-L）。這一過程需要4 個月左右。

圖1 黃瓜子房離體培養(yǎng)形成再生植株的過程

2.2 不同基因型對胚發(fā)生及植株再生的影響

2.2.1 不同基因型對出胚率的影響 由圖2 可知，

圖2 不同基因型對出胚率的影響

9 個基因型的出胚率差異顯著，其中，SG033 出胚率最高，為95.93%；SG035 出胚率最低，為8.15%。說明基因型是影響子房培養(yǎng)胚發(fā)生的主要因素。將低出胚材料SG035 與出胚能力強(qiáng)的基因型SG033正、反交，雜交種3533 和3335 的出胚率顯著高于出胚率低的親本材料。將低出胚材料與易出胚基因型雜交，雜交種4902 的出胚率顯著高于易出胚親本材料SG049。通過差異顯著性分析，將9 份材料分為高出胚（≥50.00%）、易出胚（≥25.00%～50.00%）、中等出胚（≥10.00%～25.00%）和低出胚（＜10.00%）的4 類基因型。

2.2.2 不同基因型對植株再生率的影響 由圖3

圖3 不同基因型對植株再生率的影響

可知，供試的9 個黃瓜材料中僅3 個低出胚基因型不能誘導(dǎo)出苗。其中，高出胚基因型SG033 與其他基因型植株再生率差異顯著，為60.74%；將其與低出胚基因型SG035 正、反交，雜交種3335、3533 植株再生率顯著高于低出胚親本材料，且2 個雜交種之間的植株再生率無明顯差異，分別為53.70%、54.81%。易出胚基因型SG049 的植株再生率相對較低（12.59%），將其與低出胚基因型SG002、SG026雜交后，2 個雜交種的植株再生率介于雙親之間，并顯著高于低出胚型親本，但與高出胚型親本無明顯差異。

2.3 不同因素組合對胚狀體誘導(dǎo)的影響

由表3 可知，16 個不同處理的出胚率有顯著差異，其中，處理11（秋季播種、定植于塑料大棚、盛花期取樣、開花前1 d 的未授粉子房、培養(yǎng)基中附加0.08 mg·LTDZ、35 ℃熱激處理2 d）出胚率最高，為52.22%；其次是處理6、14、3，出胚率分別為39.26%、22.22%、21.48%；最差的處理為1、8、10、15，不能誘導(dǎo)出胚（開花后1 d 的子房）；其他8 個處理的出胚率較低，在1.48%～11.85%之間。

表3 不同因素組合對出胚率的影響

2.4 體系優(yōu)化后的胚誘導(dǎo)率及植株再生率

2.4.1 體系優(yōu)化后的胚誘導(dǎo)率 由圖4 可知，對影響因素進(jìn)行優(yōu)化后選用處理11 進(jìn)行子房培養(yǎng)，4 個基因型胚發(fā)生效果較好。其中易出胚基因型SG049、2649、4902 出胚率分別為52.96%、51.48%、73.70%，達(dá)到了誘導(dǎo)高頻胚的效果。低出胚基因型SG002 出胚率為27.04%，達(dá)到了誘導(dǎo)易出胚基因型的效果。

圖4 體系優(yōu)化后的黃瓜子房出胚率

2.4.2 體系優(yōu)化后的植株再生率由圖5 可知，對影響因素進(jìn)行優(yōu)化后選用處理11 進(jìn)行子房培養(yǎng)，4 個基因型都能誘導(dǎo)出再生植株。其中，易出胚基因型SG049、2649、4902 植株再生率分別為25.93%、20.74%、33.70%，在原來的基礎(chǔ)上分別增加了1.06、1.00、1.94 倍；且低出胚基因型SG002 植株再生率突破零，提升至5.93%。

圖5 體系優(yōu)化后的黃瓜子房植株再生率

2.5 再生植株倍性鑒定

以二倍體黃瓜植株葉片為對照（圖6-D），利用流式細(xì)胞儀鑒定來源于4902 和2649 的再生植株倍性。對照葉片DNA 在相對熒光強(qiáng)度200 處出現(xiàn)分離峰（圖6-F），由此推斷分離峰出現(xiàn)在相對熒光強(qiáng)度100 處的為單倍體（圖6-E），分離峰出現(xiàn)在相對熒光強(qiáng)度300 處的為三倍體（圖6-G）。測定結(jié)果顯示，4902 的再生植株存在單倍體（圖6-E）、二倍體（圖6-F），2649 的再生植株存在二倍體（圖6-F）、三倍體（圖6-G）。除了再生植株相對核計(jì)數(shù)的差異外，還觀察到不同的表型差異，單倍體再生植株的莖葉細(xì)?。▓D6-A），三倍體再生植株的莖葉片粗大（圖6-C），二倍體再生植株表現(xiàn)為正常植株（圖6-B）。

圖6 黃瓜再生植株的表型及DNA 分布

2.6 再生植株同質(zhì)性檢驗(yàn)

利用SSR 對來源于雜交種2649、4902 的二倍體組培苗同質(zhì)性進(jìn)行檢驗(yàn)，首先在55 對引物中篩選在供體植株及雙親中具有多態(tài)性的標(biāo)記。由圖7可知，引物CS24 在供體植株2649、母本SG026 和父本SG049 之間具有多態(tài)性，引物SSR21563 在供體植株4902、母本SG049 和父本SG002 之間具有多態(tài)性。PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，2649 的6 株再生植株條帶與父本一致，由此確定這6 株再生植株是由胚囊細(xì)胞發(fā)育而來的純合雙單倍體。4902 的6株再生植株條帶與雙親不同，而與供體植株一致，由此確定這6 株再生植株是由體細(xì)胞發(fā)育而來的雜合二倍體。

圖7 多態(tài)性引物CS24 和SSR21563 的電泳條帶

2.7 植株的生根、馴化及移栽

再生植株誘導(dǎo)生根3 周時(shí)，R 培養(yǎng)基中的植株生根快且根系較多（圖8-A），而S 培養(yǎng)基中的植株生根慢且根系少（圖8-B）。達(dá)到移栽水平的再生植株洗去根系表面培養(yǎng)基（圖8-C～D），移栽于含混合基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，在人工氣候箱內(nèi)馴化14 d（圖8-E），植株馴化成活率為71.67%～85.00%，將成活植株定植于溫室大棚1 個月，植株定植成活率為95.83%～100%（圖9）。

圖8 再生植株生根及移栽情況

圖9 再生植株馴化成活率和定植成活率

3 討論與結(jié)論

基因型是影響雌核發(fā)育的關(guān)鍵因素，部分基因型較頑固，不能誘導(dǎo)出胚或出胚率極低，制約了未授粉子房培養(yǎng)技術(shù)在育種中的運(yùn)用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，利用高出胚基因型與低出胚基因型進(jìn)行雜交，其雜交后代的胚胎發(fā)生能力顯著提高，部分雜交種的出胚率優(yōu)于出胚能力強(qiáng)的親本基因型，推測黃瓜高出胚能力可以遺傳并具有加性效應(yīng)，這與蘇賀楠等和伍健繽等的報(bào)道一致；供試的9 份材料中有6 份基因型獲得再生植株，表明基因型是決定黃瓜未授粉子房誘導(dǎo)成功的主要因素。這種現(xiàn)象在蕓薹屬小孢子培養(yǎng)上也有類似報(bào)道。如果品種有滿足育種需求的目標(biāo)性狀，但是材料不產(chǎn)胚或產(chǎn)胚量低，則可以通過與高胚胎發(fā)生能力的橋梁品種雜交，其雜交后代可能是既高出胚又滿足育種目標(biāo)的基因型，以實(shí)現(xiàn)快速純化某些目標(biāo)性狀，這對黃瓜的回交育種具有重要意義。

雌核發(fā)育培養(yǎng)中的熱激處理是一個重要的步驟，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為32～35 ℃熱激處理2～5 d 對瓜類作物雌核發(fā)育起著積極作用；然而，Tantasawat等卻認(rèn)為35 ℃熱激3 d 降低了黃瓜胚狀體發(fā)生率。王璐等和刁衛(wèi)平等培養(yǎng)黃瓜未授粉子房，在35 ℃熱激條件下，啟動雌核發(fā)育的最適TDZ 質(zhì)量濃度分別為0.06、0.04 mg·L。TDZ 具有生長素和細(xì)胞分裂素的雙重功效，能有效誘導(dǎo)外植體的一系列分化。在南瓜、西瓜未授粉子房誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加TDZ 誘導(dǎo)形成的胚狀體畸形率較低，有利于成苗。因此，筆者只對TDZ 的處理效果進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)子房培養(yǎng)的最優(yōu)組合為處理11（秋季播種，定植于塑料大棚，盛花期取樣，以開花前1 d 的未授粉子房為外植體，4 ℃預(yù)冷處理4 d，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+0.08 mg·LTDZ+30 g·L蔗糖+7 g·L瓊脂，35 ℃熱激暗處理2 d）；該組合培養(yǎng)易出胚基因型的胚誘導(dǎo)效果達(dá)到了誘導(dǎo)高頻胚的效果，且低出胚材料的植株再生率在Deng 等建立的培養(yǎng)體系中突破零提高到5.93%。

目前，雌核發(fā)育誘導(dǎo)技術(shù)還不能對單個卵細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)，由此獲得的再生植株倍性不確定。因此，需要利用流式細(xì)胞儀、根尖染色體計(jì)數(shù)等手段鑒定再生植株的倍性。筆者在形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)上，采用流式細(xì)胞儀對再生植株倍性進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)再生植株是由單倍體、二倍體（或雙單倍體）及三倍體組成的混合群體，這與李玲等的研究結(jié)果相似。由于雙單倍體與正常二倍體有著相同數(shù)量的核和染色體數(shù)目，難以用流式細(xì)胞儀和細(xì)胞遺傳學(xué)來辨別二者，而利用SSR 分子標(biāo)記能檢測雙單倍體和二倍體植株的同質(zhì)性。SSR 標(biāo)記已成功鑒定了梨、馬鈴薯、椰子等作物自發(fā)雙單倍體的純度，也成功用于黃瓜未授粉子房再生植株的同質(zhì)性檢驗(yàn)。筆者在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，引物SSR21563、CS24 能區(qū)分再生二倍體組培苗的同質(zhì)性。

綜上所述，通過對黃瓜未授粉子房培養(yǎng)體系進(jìn)行優(yōu)化研究，獲得了最佳培養(yǎng)體系——將低出胚材料與出胚能力強(qiáng)的材料雜交，秋季播種，定植于塑料大棚，盛花期取樣，以開花前1 d 的未授粉子房為外植體，4 ℃預(yù)冷處理4 d，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+0.08 mg·LTDZ+30 g·L蔗糖+7 g·L瓊脂，35 ℃熱激暗處理2 d。