支氣管敗血波氏桿菌PRN基因CDS區(qū)的生物信息學(xué)分析

宋吉健 王怡滌 楊金錢 李夢云 劉志軍 趙戰(zhàn)勤

摘要：通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測分析支氣管敗血波氏桿菌PRN基因編碼蛋白功能及其調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果表明，支氣管敗血波氏桿菌PRN基因CDS區(qū)編碼911個氨基酸，分子式為C4 121H6 556N1 250O1 258S11，分子質(zhì)量為13 196，消光系數(shù)為95 800，其理論等電點(diǎn)為9.64，不穩(wěn)定系數(shù)為36.24，PRN蛋白的理化性質(zhì)穩(wěn)定;PRN蛋白有多個磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn);信號肽預(yù)測PRN蛋白有1個信號肽，信號肽位置在1～34;PRN蛋白為親水性蛋白，存在1個跨膜結(jié)構(gòu);預(yù)測二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲構(gòu)成，占39.08%，β-折疊占23.93%，α-螺旋占23.30%，三級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲和β-折疊構(gòu)成。上述結(jié)果提示，該蛋白具有重要生物學(xué)意義，可為進(jìn)一步開發(fā)支氣管敗血波氏桿菌亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：支氣管敗血波氏桿菌;PRN;CDS區(qū);生物信息學(xué)

中圖分類號：S855.1+2 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）10-0052-06

支氣管敗血波氏桿菌是一種引起呼吸道感染的革蘭氏陰性細(xì)菌，它是多種哺乳動物的天然病原體[1]。波氏桿菌為波氏桿菌屬，波氏桿菌屬目前包括16個已命名的菌種：百日咳波氏桿菌（Bordetella pertussis）、副百日咳波氏桿菌（B. parapertussis）、支氣管敗血波氏桿菌（B. bronchiseptica）、禽波氏桿菌（B. avium）和其余菌種，后幾種由于發(fā)現(xiàn)較晚，所以研究相對較少[2]。目前，研究較多的主要為前3種，與人類和其他哺乳動物的呼吸道感染有關(guān)，因而稱為“經(jīng)典波氏桿菌”[3-4]。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)波氏桿菌在世界范圍內(nèi)的豬、兔、犬及貓中廣泛存在，協(xié)同感染非常嚴(yán)重，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。目前，研究者們通過多種方法運(yùn)用基因技術(shù)，研發(fā)新型的亞單位疫苗，但大多還未大批量投入生產(chǎn)。

支氣管敗血波氏桿菌pertactin（PRN）是一種外膜蛋白，從細(xì)菌表面突起的長線型蛋白非常適合促進(jìn)細(xì)胞間的黏附，由92 ku PRN前體蛋白分解產(chǎn)生，表觀分子量在支氣管敗血桿菌中為68 ku，在百日咳桿菌中為69 ku，在副百日咳桿菌中為70 ku[6]。大量研究表明，缺失PRN的Bb菌株不能引起豬的發(fā)病，且豬群保護(hù)率與PRN為線性關(guān)系，表明PRN作為支氣管敗血波氏桿菌的主要保護(hù)性抗原[7]。因此，本研究通過生物信息學(xué)分析深入研究該基因，以期為進(jìn)一步研發(fā)波氏桿菌新型疫苗的研發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

NCBI數(shù)據(jù)庫公布的支氣管敗血波氏桿菌PRN基因（GenBank No：AJ245927）序列共含911 個氨基酸，序列如下：MNMSLSRIVKAAPLRRTTLAMALGALGAAPAAYADWNNQSIIKAGERQHGIHIKQSDGAGVRTATGTTIKVSGRQAQGVLLENPAAELRFQNGSVTSSGQLFDEGVRRFLGTVTVKAGKLVADHATLANVSDTRDDDGIALYVAGEQAQASIADSTLQGAGGVRVERGANVTVQRSTIVDGGLHIGTLQPLQPEDLPPSRVVLGDTSVTAVPASGAPAAVSVFGANELTVDGGHITGGRAAGVAAMDGAIVHLQRATIRRGDAPAGGAVPGGAVPGGFGPLLDGWYGVDVSDSTVDLAQSIVEAPQLGAAIRAGRGARVTVSGGSLSAPHGNVIETGGGARRFPPPASPLSITLQAGARAQGRALLYRVLPEPVKLTLAGGAQGQGDIVATELPPIPGASSGPLDVALASQARWTGATRAVDSLSIDNATWVMTDNSNVGLRLSDGSVDFQQPEGRFKVLMVDTLGSGLFRMNVFDLGLSDKLVVMRDSGQHRLWVRNSGSEPSNTMLLVQTPRGSTFTLNKDGKVDIGTYRYRLNGNGQWSLVGKPPPKPPQPGPQPGPQPPQPPQPPQPPQRQPEPPQPPGRELSNVNTGGVGLSTLWYESNLSKRLGELRLNPDGGWGRGFQRQQLDNRGRRFDQKVGFELGDHVVGGRWHLGGLGYTRGDRGFTGDGGGHTDSVHVGGYTYINSGFYLDTLRSRLENDFKVGSDGYVKGKYRTHGVGSLEGRRFHDGWFLEPQELVFRVGGGSYRNGLRVRDEGGSSVLGRLGLEVGKRIELGGRQVQPYIKSVLQEFDGGTVRTNGIHRTELRGTRELGLGMLGRGHSLYSYEYSKGPKLMPWTFHGYRYSW。

1.2 方法

利用ExPASy-ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測分析PRN蛋白的親水性、等電點(diǎn)、半衰期、穩(wěn)定性等理化性質(zhì)，利用Net Phos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）使用YinOYang 1.2 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/）和NetNGlyc 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/.）PRN蛋白綜合分析磷酸化和N、O這2種糖基化;利用PSORTb version 3.0.2 （http：//www.psort.org/psortb/results.pl）和LocTree3（https：//rostlab.org/owiki/index.php/Loctree3）分析PRN的亞細(xì)胞定位和預(yù)測。對PRN蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析使用NCBI的CDD程序（https：//www. ncbi. nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）;用TMHMM軟件（http：//www. cbs.dtu. dk/services/TMHMM/）和使用SignalIP 5.0（http：//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/）對PRN氨基酸序列進(jìn)行跨膜區(qū)和信號肽預(yù)測分析;利用NPS@中SOPMA（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=/NPSAHLP/npsahlp_secpredsopma.html）分析軟件對PRN蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析;PRN蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測在 SWISS-MODEL程序進(jìn)行（https：//swissmodel.expasy.org/）。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)分析

利用ExPASy-ProtParam 對PRN蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，PRN 蛋白包含911 個氨基酸，其中，Ala（14.3%）、Gly（14.3%）和Leu（88%）出現(xiàn)頻率較高，帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）有75個，頻率為8.2%;帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）有89個，頻率為9.8%（表1）。PRN蛋白分子式為C4 121H6 556N1 250O1 258S11，分子質(zhì)量為13 196，消光系數(shù)為95 800 L/（mol·cm），其理論等電點(diǎn)（pI）為9.64;其不穩(wěn)定系數(shù)為36.24（<40），屬于穩(wěn)定類蛋白質(zhì);親水性平均系數(shù)（GRAVY）為-0.201，為親水性蛋白。預(yù)測在哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞（體外）中的半衰期為30 h，在酵母（體內(nèi)）中的半衰期>20 h，在大腸桿菌（體內(nèi)）中的半衰期>10 h。

2.3 疏水性分析

利用Protscale中Kyte & Doolittle 對PRN 蛋白的疏水性進(jìn)行預(yù)測（window size=9），由圖1可知，該蛋白最大疏水性區(qū)域為23、875位氨基酸區(qū)域，均為1.989;在589、591位氨基酸區(qū)域為最小疏水區(qū)，均為-2.767。平均疏水指數(shù)（GRAVY）為-0.201，即為親水性蛋白。

2.3 跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽預(yù)測

利用TMHMM軟件對PRN氨基酸序列進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測分析，跨膜區(qū)位于17～34氨基酸之間，由圖2可知，與使用Protscale中Kyte & Doolittle分析的最大疏水區(qū)域第23位氨基酸的位置相一致。對序列跨膜區(qū)預(yù)測是十分必要的。通常，膜蛋白不能在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，如果對序列進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測發(fā)現(xiàn)序列中存在跨膜區(qū)，則在后續(xù)需要選擇真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá);如果想利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，需要對跨膜區(qū)序列進(jìn)行刪除。利用SingaIP 41軟件分析發(fā)現(xiàn)有一個信號肽，由圖3可知，信號肽類型為SP（Sec/SPI）;信號肽位置為1～34;信號肽序列為MNMSLSRIVKAAPLRRTTLAMALGALGAAPAAYA。通過預(yù)測跨膜區(qū)和信號肽，可進(jìn)行原核表達(dá)時去除其信號肽， 對PRN進(jìn)行克隆表達(dá)， 為進(jìn)一步開發(fā)亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

2.4 PRN蛋白磷酸化、糖基化位點(diǎn)

利用Net Phos 3.1、YinOYang 1.2 Server和NetNGlyc 1.0 Server蛋白綜合分析磷酸化和糖基化位點(diǎn)，由圖4可知，磷酸化位點(diǎn)較多;糖基化分析結(jié)果（圖5）表明，與N-連接的糖基化有6個，在2、38、92、129、170、428，與O-連接的糖基化18個（圖6），在68、72、151、172、207、209、214、221、291、320、322、415、418、506、617、631、902、910，其中，序列位置214和631嚴(yán)重糖基化。

2.5 PRN亞細(xì)胞定位分析

利用PSORTb version 3.0.2和LocTree3分析PRN的亞細(xì)胞定位。PRN的亞細(xì)胞定位分?jǐn)?shù)分別為細(xì)胞質(zhì)0.00、細(xì)胞質(zhì)膜0.00、周質(zhì)0.00、外膜1000、細(xì)胞外0.00。定位分?jǐn)?shù)顯示，PRN定位在細(xì)菌的細(xì)胞外膜中，利用LocTree 3分析PRN的亞細(xì)胞定位。由圖7可知，PRN定位在細(xì)胞外膜中，亞細(xì)胞定位分?jǐn)?shù)為0.95，精確度為98%?；谏鲜?種在線軟件的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，PRN 定位在細(xì)胞外膜中。

2.6 蛋白結(jié)構(gòu)

通過NCBI的CDD 程序分析發(fā)現(xiàn)，PRN蛋白存在2個保守域結(jié)構(gòu)，分別命名為TIGR01414和cd01343，TIGR01414是主要在病原體中發(fā)現(xiàn)并與毒力相關(guān)，參與細(xì)胞黏附，在氨基酸458～911間包含1個保守的C端結(jié)構(gòu)域，自動轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域的長度約為 400 個氨基酸，包括富含芳香族氨基酸的 OMP 信號，還是cl36898超家族唯一成員。cd01343位于氨基酸317～559間，是革蘭氏陰性菌 V 型分泌系統(tǒng)的自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。cd01343是超家族cl00185的成員。PRN蛋白由16股平行的β螺旋氨基酸結(jié)構(gòu)組成，呈“V”形橫截面，是迄今為止已知的最大的β螺旋蛋白之一。

使用SOPMA分析軟件對PRN蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，由圖8可知，PRN蛋白二級結(jié)構(gòu)中主要以α-螺旋、β-折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，分別占23.30%、13.61%、23.93%和39.08%。運(yùn)用SWISS-MODEL軟件完成PRN蛋白三級結(jié)構(gòu)模型的構(gòu)建（圖9）。觀察到較多的無規(guī)則卷曲和α-螺旋，與二級預(yù)測結(jié)果相一致。但GMQE評價模型可靠性得分為0.42，表明該模型可信度一般。

3 討論

目前，支氣管敗血波氏桿菌主要在豬、犬、兔等動物群體間感染非常嚴(yán)重，長期以來危害被低估[8]。尤其在豬群中與副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌等協(xié)同感染嚴(yán)重，死亡率很高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失[9]。雖然Bb主要是佐劑滅活苗已在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用，但免疫效果普遍較差，豬群對于支氣管敗血波氏桿菌的攜帶十分嚴(yán)重[10]。此外，大量抗生素的使用加劇了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生[11]。相關(guān)研究表明，使用豬支氣管敗血波氏桿菌某些表面毒力因子及相關(guān)分泌蛋白作為亞單位疫苗，對于豬波氏桿菌病感染具有一定的免疫保護(hù)作用[12]。研究人員發(fā)現(xiàn)，除去N端信號肽的PRN基因，在大腸桿菌中實現(xiàn)了各段基因的高效表達(dá)[13]。結(jié)果表明，蛋白片段氨基酸序列保守、表達(dá)量高、純化方便，可作為亞單位疫苗進(jìn)行開發(fā)。本研究通過生物信息學(xué)軟件對PRN分析，它編碼由911個氨基酸組成、理論等電點(diǎn)為9.64的親水性蛋白，根據(jù)結(jié)構(gòu)與生物特性預(yù)測結(jié)果分析，PRN包含2個RⅠ（GGXXP）n和 RⅡ（PQP）n 重復(fù)氨基酸序列，研究發(fā)現(xiàn)RⅠ區(qū)可能與細(xì)菌的黏附功能有關(guān)，RⅡ為主要的保護(hù)性抗原表位[14]。PRN還具有逃避宿主細(xì)胞的免疫保護(hù)作用，對巨噬細(xì)胞可能有一定的毒性[15]。

趙戰(zhàn)勤等曾克隆表達(dá)出PRN及其不同區(qū)域的氨基酸多肽，通過小鼠免疫保護(hù)試驗證明了PRN的N端強(qiáng)于C端，且RⅡ區(qū)域強(qiáng)于RⅠ區(qū)域[16]，但其僅在小鼠模型進(jìn)行了免疫保護(hù)試驗，未在豬群進(jìn)一步驗證，無法確定是否對豬也具有較好的免疫保護(hù)性。此外，在設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時會出現(xiàn)擴(kuò)增不出目的條帶的現(xiàn)象，或者克隆出PRN基因片段在測序時也會出現(xiàn)不同的問題，這可能是波氏桿菌基因GC含量過高，尤其PRN基因GC含量高達(dá)716%。有研究發(fā)現(xiàn)在擴(kuò)增PRN基因時加入少量的二甲基亞砜（DMSO）或betaine[17]，使其氫鍵斷裂有利于雙鏈解開，因此對該基因還需要進(jìn)一步研究。最近科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)不表達(dá)PRN基因的陰性菌株越來越多，一些重要基因（包括毒力相關(guān)基因或調(diào)節(jié)基因）上的單核苷酸多態(tài)性（SNP）可能幫助機(jī)體在疫苗選擇壓力下存活[15]，這也是為什么最近幾年百日咳波氏桿菌、副百日咳波氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌在全球廣泛傳播，從未消退，研發(fā)新型疫苗刻不容緩。其次，在進(jìn)行同源性分析時，發(fā)現(xiàn)禽波氏桿菌（B. avium）基因中沒有PRN基因，這也可以證明禽波氏桿菌與百日咳波氏桿菌、副百日咳波氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌不屬于同一個群。而且發(fā)現(xiàn)支氣管敗血波氏桿菌在一個支上，PRN基因同源性較高，可為研究新型疫苗的研發(fā)提供一個新思路。李洪廣等發(fā)現(xiàn)兔支氣管敗血波氏桿菌缺失PRN基因可以使毒力下降，突變株產(chǎn)生了較好的免疫原性，進(jìn)行減毒活疫苗的研發(fā)也是一種新思路[18]。

本研究通過對編碼的PRN蛋白進(jìn)行了較全面的生物信息學(xué)分析，預(yù)測分析了該蛋白的氨基酸同源性、理化性質(zhì)、生物學(xué)特性及功能，研究其信號肽和功能域，預(yù)測該蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，可為進(jìn)一步研究其功能、調(diào)節(jié)機(jī)制及相關(guān)支氣管敗血波氏桿菌疫苗提供借鑒。

參考文獻(xiàn)：

[1]趙戰(zhàn)勤.支氣管敗血波氏桿菌的重組沙門氏菌基因工程疫苗研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[2]Weigand M R，Peng Y H，Batra D，et al. Conserved patterns of symmetric inversion in the genome evolution of Bordetella respiratory pathogens[J]. mSystems，2019，4（6）：e00702-19.

[3]Park J，Zhang Y，Buboltz A M，et al. Comparative genomics of the classical Bordetella subspecies：the evolution and exchange of virulence-associated diversity amongst closely related pathogens[J]. BMC Genomics，2012，13：545.

[4]Linz B，Ma L H，Rivera I，et al. Genotypic and phenotypic adaptation of pathogens：lesson from the genus Bordetella[J]. Current Opinion in Infectious Diseases，2019，32（3）：223-230.

[5]Ruch-Gallie R，Moroff S，Lappin M R.Adenovirus 2，Bordetella bronchiseptica，and parainfluenza molecular diagnostic assay results in puppies after vaccination with modified live vaccines[J]. Journal of Veterinary Internal Medicine，2016，30（1）：164-166.

[6]Lipscombe M，Charles I G，Roberts M，et al. Intranasal immunization using the B subunit of the Escherichia coli heat-labile toxin fused to an epitope of the Bordetella pertussis P.69 antigen[J]. Molecular Microbiology，1991，5（6）：1385-1392.

[7]Zhao Z Q，Xue Y，Tang X B，et al. Immunogenicity of recombinant protective antigen and efficacy against intranasal challenge with Bordetella bronchiseptica[J]. Vaccine，2009，27（18）：2523-2528.

[8]裴 潔，何 華，趙戰(zhàn)勤，等. 支氣管敗血波氏桿菌的研究進(jìn)展[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息，2006（2）：4-6.

[9]趙戰(zhàn)勤，裴 潔，薛 云，等. 豬源支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（12）：4209-4217.

[10]趙戰(zhàn)勤，徐引弟，吳 斌，等. 豬霍亂沙門氏菌ΔasdC500株的生物學(xué)特性及作為活疫苗表達(dá)載體的應(yīng)用[J]. 生物工程學(xué)報，2009，25（1）：29-36.

[11]Lin X J，Zou J，Yao K H，et al. Analysis of antibiotic sensitivity and resistance genes of Bordetella pertussis in Chinese children[J]. Medicine，2021，100（2）：e24090.

[12]Shin E K，Jung R，Hahn T W. Polymorphism of pertactin gene repeat regions in Bordetella bronchiseptica isolates from pigs[J]. The Journal of Veterinary Medical Science，2007，69（7）：771-774.

[13]吳庭才，趙戰(zhàn)勤，王 臣，等. 支氣管敗血波氏桿菌PRN黏附素R1區(qū)蛋白的免疫原性[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2009，40（9）：1370-1375.

[14]Dominowski P J，F(xiàn)rantz J C ，Krebs R L，et al.? Formulations and process for production of bordetella bronchiseptica p68 antigen and vaccines：IB2006000946[P]. 2006.

[15]Octavia S，Maharjan R P，Sintchenko V，et al. Insight into evolution of Bordetella pertussis from comparative genomic analysis：evidence of vaccine-driven selection[J]. Molecular Biology and Evolution，2010，28（1）：707-715.

[16]趙戰(zhàn)勤，王 臣，薛 云，等. 百日咳桿菌黏附素中針對支氣管敗血波氏桿菌的保護(hù)性抗原肽的篩選[J]. 微生物學(xué)報，2010，50（9）：1239-1245.

[17]胡佳佳. 兔源支氣管敗血波氏桿菌PRN蛋白的表達(dá)及其免疫保護(hù)性研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[18]李洪廣，王 芳，姜 平，等. 兔支氣管敗血波氏桿菌PRN基因缺失突變株的構(gòu)建及特性研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2012，43（2）：299-305.