毛蕊花糖苷在常氧、缺氧大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的比較

王維剛， 李曉琳， 燕 娜， 劉天龍， 王 芃， 郭姿良,， 吳 迪,5，李茂星,,5*

(1.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四○醫(yī)院臨床藥學(xué)科，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省高原藥學(xué)行業(yè)技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730050；4.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；5.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004)

高原環(huán)境具有低壓、低溫、缺氧等特點(diǎn)[1]，其中缺氧是影響生命活動(dòng)及疾病發(fā)展的重要因素之一，此時(shí)機(jī)體產(chǎn)生過(guò)度氧化應(yīng)激，引發(fā)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、能量代謝紊亂等，導(dǎo)致腦肺損傷、記憶下降，加重運(yùn)動(dòng)疲勞，降低高原作業(yè)效能[2-4]。

毛蕊花糖苷是肉蓯蓉、熟地黃、車(chē)前子等藥用植物的指標(biāo)成分[5-6]，它不僅可減輕腦組織損傷，而且具有良好的抗疲勞活性[7-8]；在體內(nèi)外模擬腸道條件下可通過(guò)糖苷鍵及酯鍵斷裂，分解為羥基酪醇和咖啡酸[9-10]；灌胃給藥后吸收迅速，分布廣泛，生物利用度良好[11]；尾靜脈注射給藥后可快速代謝產(chǎn)生羥基酪醇，并且后者在體內(nèi)可被快速代謝和消除[12]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，毛蕊花糖苷、羥基酪醇、咖啡酸均具有良好的體外抗氧化活性，而且前兩者還能改善PC12細(xì)胞缺氧損傷，表明毛蕊花糖苷口服給藥后可能是原藥與其代謝產(chǎn)物羥基酪醇、咖啡酸協(xié)同發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)比較了毛蕊花糖苷在常氧、缺氧大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)，以期為該成分后續(xù)研究提供參考。

1 材料

1.1 試劑與藥物 毛蕊花糖苷原料藥(純度≥94%，自制)；毛蕊花糖苷(純度≥98%，批號(hào)PS000683)、羥基酪醇(純度≥98%，批號(hào)PRF10100843)、咖啡酸(純度≥98%，批號(hào)102913)、染料木素(純度≥98%，批號(hào)PRF9112103)對(duì)照品(成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司)。色譜純乙腈(瑞典Oceanpak公司，批號(hào)20100310G202)；色譜純甲酸(批號(hào)xk-011-00017)、乙酸乙酯(批號(hào)2020102201)(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)；水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 儀器 Agilent 1290超高效液相色譜儀、Agilent 6560離子淌度飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司)；FLYDWC50-ⅡC低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙(貴州風(fēng)雷航空軍械有限公司)；JPXH-D可調(diào)式渦旋混勻器(上海旌派儀器有限公司)；3K15高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；BP210S電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)RUC-2-25離心濃縮儀(德國(guó)Labconco公司)。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四○醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(軍)2017-0046，飼養(yǎng)室溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度40%～60%，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)經(jīng)聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四○醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批編號(hào)2020KYLL121)。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC-QTOF-MS分析條件

2.1.1 色譜 Thermo Hypersi1 GOLD色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；Thermo嵌入式保護(hù)柱套(2 mm)；Thermo Hypersil GOLD保護(hù)柱柱芯(2.1 mm×0.2 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-水(含0.1%甲酸)(B)，梯度洗脫，程序見(jiàn)表1；體積流量0.4 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)281 nm；進(jìn)樣量2 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.1.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源(ESI)；干燥器溫度225 ℃，體積流量7.0 L/min；霧化器壓力25 psi(1 psi=6.895 kPa)；鞘氣(N2)溫度325 ℃，體積流量12.0 L/min；毛細(xì)管電壓4 000 V；噴嘴電壓1 000 V；負(fù)離子檢測(cè)模式，m/z100～750；提取離子羥基酪醇m/z153.055 7，咖啡酸m/z179.035 0，毛蕊花糖苷m/z623.198 1，內(nèi)標(biāo)(染料木素)m/z269.048 8，各成分全掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 各成分全掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Full scan MS spectra for various constituents

2.2 溶液制備

2.2.1 給藥液 稱(chēng)取毛蕊花糖苷原料藥適量，滅菌注射用水溶解，即得(質(zhì)量濃度為30 mg/mL)。

2.2.2 對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱(chēng)取毛蕊花糖苷、羥基酪醇、咖啡酸對(duì)照品0.002 0 g，置于10 mL棕色量瓶中，乙腈超聲溶解后加水定容，即得對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度均為200 μg/mL)。精密稱(chēng)取染料木素對(duì)照品0.002 0 g，同法制備內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.3 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、質(zhì)控樣品溶液 將“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液用50%乙腈依次稀釋至100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000 ng/mL，分別吸取5 μL至EP管中，加入45 μL空白血漿，渦旋混勻1 min，即得血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液(質(zhì)量濃度為10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 ng/mL)。同法制備毛蕊花糖苷、羥基酪醇、咖啡酸質(zhì)量濃度分別為20、100、500 ng/mL的質(zhì)控樣品溶液。

2.3 血漿處理 大鼠血漿4 000 r/min離心10 min，取上清50 μL，加入乙酸乙酯400 μL、內(nèi)標(biāo)溶液(4 μg/mL)2 μL，渦旋10 min，12 000 r/min離心15 min，取乙酸乙酯層至1.5 mL離心管中，萃取2次，37 ℃離心濃縮儀上揮干，50 μL 5%乙腈復(fù)溶，15 000 r/min離心5 min，取上清液，進(jìn)行HPLC-QTOF-MS分析。

2.4 建模、給藥與采血

2.4.1 常氧大鼠 將7只大鼠編號(hào)并稱(chēng)定質(zhì)量，每只按300 mg/kg劑量灌胃給予“2.2.1”項(xiàng)下給藥液。大鼠給藥前12 h禁食，自由飲水，于給藥前和給藥后5、10、15、30、45 min及1、1.5、2、4、6、8、12、24 h眼眶靜脈采集全血各0.3 mL，置于肝素化EP管中，在-20 ℃下保存，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)行HPLC-QTOF-MS分析。

2.4.2 缺氧大鼠 將7只大鼠編號(hào)后置于低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙中，在模擬高原7 500 m下缺氧暴露3 d，制備缺氧模型。大鼠給藥前12 h禁食，自由飲水，稱(chēng)定質(zhì)量后每只按300 mg/kg劑量灌胃給予“2.2.1”項(xiàng)下給藥液，于給藥前和給藥后5、10、15、30、45 min及1、1.5、2、4、6、8、12、24 h眼眶靜脈采集全血各0.3 mL，置于肝素化EP管中，在-20 ℃下保存，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)行HPLC-QTOF-MS分析。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取6個(gè)來(lái)源大鼠空白血漿適量，加入“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品(20 ng/mL)、內(nèi)標(biāo)溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，在“1.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2，可知該方法專(zhuān)屬性良好。

2.6.2 線性關(guān)系考察 取“2.2.3”項(xiàng)下血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，在“1.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，并以S/N=10為定量限，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6.3 精密度、準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，在“1.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)行6次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)進(jìn)行3 d，每天1次，計(jì)算日間精密度，并考察方法準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)表3。由此可知，各成分日內(nèi)、日間精密度RSD均小于12%，準(zhǔn)確度均在94.89～111.52%范圍內(nèi)，符合生物樣品分析要求。

表3 各成分準(zhǔn)確度、精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.3 Results of accuracy and precision tests for various constituents(n=6)

注：a～e分別為總離子流圖及羥基酪醇、咖啡酸、染料木素、毛蕊花糖苷提取離子流圖。圖2 各成分HPLC-QTOF色譜圖Fig.2 HPLC-QTOF chromatograms of various constituents

2.6.4 提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液適量，每個(gè)質(zhì)量濃度6份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，在“1.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，得峰面積A1；另取空白血漿，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，濃縮儀揮干后殘?jiān)謩e用20、100、500 ng/mL對(duì)照品溶液復(fù)溶，在“1.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，得峰面積A2；取20、100、500 ng/mL對(duì)照品溶液適量，在“1.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，得峰面積A3，以A1與A2的比值計(jì)算提取回收率，A2與A3的比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表4。由此可知，該方法下毛蕊花糖苷、咖啡酸提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)均在85%以上，而羥基酪醇更達(dá)到90%以上。

表4 各成分提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of extraction recovery rate and matrix effect tests for various

2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液適量，每個(gè)質(zhì)量濃度5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，分別于室溫[(21±2)℃]下放置6 h、4 ℃下放置6 h，-20 ℃下保存7 d、-20 ℃下凍融3次后在“1.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。由此可知，在上述條件下各成分峰面積RSD均小于10%，表明血漿穩(wěn)定性良好。

表5 各成分穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=5)Tab.5 Results of stability tests for various constituents(n=5)

2.7 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究 在常氧、缺氧大鼠血漿中均未檢測(cè)到羥基酪醇，毛蕊花糖苷、咖啡酸主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表6，血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3～4。由此可知，與常氧大鼠血漿比較，缺氧大鼠血漿中毛蕊花糖苷AUC0～t、AUC0～∞、Cmax降低(P<0.05)，Tmax、Vz/F升高(P<0.05)；咖啡酸AUC0～t、AUC0～∞、Cmax降低(P<0.05)，MRT0～∞、Tmax、Vz/F升高(P<0.05)。

表6 毛蕊花糖苷、咖啡酸主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab.6 Main pharmacokinetic parameters for verbascoside and caffeic

圖3 毛蕊花糖苷血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.3 Plasma concentration-time curves for verbascoside

圖4 咖啡酸血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.4 Plasma concentration-time curves for caffeic acid

3 討論

課題組前期發(fā)現(xiàn)，灌胃給予大鼠300 mg/kg毛蕊花糖苷后呈現(xiàn)出良好的抗缺氧、抗疲勞活性[7-8]。因此，為了進(jìn)一步探究毛蕊花糖苷藥效基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)也選擇300 mg/kg作為給藥劑量。

高原低氧對(duì)機(jī)體的物質(zhì)代謝系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等均有顯著影響，從而影響藥動(dòng)學(xué)過(guò)程[13-16]。本實(shí)驗(yàn)在常氧、缺氧大鼠體內(nèi)檢測(cè)到了毛蕊花糖苷和咖啡酸，但未發(fā)現(xiàn)羥基酪醇。在體內(nèi)胃腸道及體外模擬消化條件下，毛蕊花糖苷水解生成羥基酪醇[9-10]；靜脈注射給予毛蕊花糖苷后，在血漿中可檢測(cè)到羥基酪醇[12]，而且在肝臟中快速轉(zhuǎn)化為次級(jí)代謝產(chǎn)物[17]，故推測(cè)羥基酪醇可能被肝臟快速代謝，使血漿中其濃度低于檢測(cè)限。

與常氧大鼠比較，缺氧大鼠血漿中毛蕊花糖苷AUC0～t、AUC0～∞、Cmax分別降低50%、48%、55%，Tmax增加114%，表明毛蕊花糖苷吸收強(qiáng)度降低一半左右，吸收速度減慢。缺氧可導(dǎo)致Caco-2細(xì)胞P-gp表達(dá)上調(diào)，使藥物外排增多，減少藥物吸收，導(dǎo)致芍藥苷、左氧氟沙星、甲硝唑吸收降低[10,18-20]，推測(cè)缺氧大鼠毛蕊花糖苷吸收減弱的原因一方面可能與大鼠小腸外排蛋白P-gp表達(dá)上調(diào)、外排作用增強(qiáng)有關(guān)，從而降低小腸對(duì)藥物的吸收[18]，而另一方面缺氧可導(dǎo)致大鼠胃排空作用減弱[21]；Vz/F顯著升高，可能是AUC、Cmax降低的原因，并且課題組前期發(fā)現(xiàn)，毛蕊花糖苷與缺氧大鼠血漿蛋白結(jié)合率降低，導(dǎo)致該成分更容易向組織中分布，可能導(dǎo)致該參數(shù)升高。另外，缺氧大鼠血漿中咖啡酸AUC、Cmax顯著降低，Tmax顯著延長(zhǎng)，提示該成分體存量減少，其原因可能與P-gp表達(dá)上調(diào)及減緩胃排空有關(guān)，也可能與代謝生成速率減慢有關(guān)；Tmax、Vz/F、t1/2z、MRT0～∞顯著增加，提示缺氧狀態(tài)下該成分在大鼠體內(nèi)代謝減慢，平均駐留時(shí)間延長(zhǎng)，組織分布增加。

綜上所述，毛蕊花糖苷在缺氧大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)發(fā)生明顯變化；缺氧損傷后，毛蕊花糖苷及其代謝產(chǎn)物咖啡酸組織分布增加，但吸收減弱，體存量減少，在一定程度上制約了藥效發(fā)揮。因此，在實(shí)際抗缺氧用藥過(guò)程中應(yīng)增加毛蕊花糖苷劑量，以期保證其藥效基礎(chǔ)。