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      光強調(diào)制型SPRi生物傳感器的應(yīng)用及分析方法

      2022-06-20 18:28:00朱天逸許晟熙李杭劉星宇王詩韻
      現(xiàn)代信息科技 2022年1期
      關(guān)鍵詞:生物傳感器

      朱天逸 許晟熙 李杭 劉星宇 王詩韻

      摘? 要:表面等離體激元共振是一種在生物化學(xué)、生物分析化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用的光學(xué)傳感技術(shù),因其高通量、無需標(biāo)記、高靈敏度等優(yōu)點受到越來越廣泛的重視。該研究通過分析SPRi(SPRi maging)傳感器對不同折射率的樣品與共振角的檢測規(guī)律,得出系統(tǒng)應(yīng)用于樣品折射率、生物膜樣品厚度分布及覆蓋面密度檢測的方法;從兩種物質(zhì)相互作用的平衡反應(yīng)原理推導(dǎo)、分析了SPRi傳感器進(jìn)行實時分子相互作用檢測的方法,為SPRi傳感器的應(yīng)用實驗提供借鑒。

      關(guān)鍵詞:SPRi;生物傳感器;分子相互作用

      中圖分類號:TP212? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:2096-4706(2022)01-0113-03

      Abstract: Surface plasmon resonance is an optical sensing technology widely used in biochemistry, bioanalytical chemistry and biomedicine and other fields. It has attracted more and more attention because of its high throughput, no marking required and high sensitivity. By analyzing the detection law of SPRi (SPRi maging) sensor for samples with different refractive index and resonance angle, this study obtains the method applied to the detection of sample refractive index, biofilm sample thickness distribution and coverage density; based on the equilibrium reaction principle of the interaction between two substances, the method of real-time molecular interaction detection by SPRi sensor is deduced and analyzed, which provides reference for the application experiment of SPRi sensor.

      Keywords: SPRi; biosensor; molecular interaction

      0? 引? 言

      表面等離體激元共振(surface plasmon resonance, SPR)是一種20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的表面光學(xué)分析技術(shù)[1-3]。具有靈敏度高、生物樣品無須標(biāo)記、無須純化、實時監(jiān)測、速度快、樣品消耗量少、無損傷等特點,廣泛應(yīng)用于生物、化學(xué)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)檢測,特別是在生物大分子相互作用的實時檢測、醫(yī)療診斷、藥物開發(fā)、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等領(lǐng)域具有獨特的優(yōu)勢。SPR生物傳感器可以實現(xiàn)生物分子相互作用的無標(biāo)記、高靈敏度和實時分析,可以在生物化學(xué)、生物分析化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用[4,5]。這種方法已經(jīng)成功應(yīng)用到不同生物分子相互作用的研究中,比如抗原—抗體[6,7]、蛋白質(zhì)-DNA[8]、DNA雜交[9]、DNA-RNA[10,11]和蛋白質(zhì)-糖類[12,13]的相互作用。

      SPR傳感器原理為,一束p偏振光以大于臨界角的入射角θ照射在玻璃與金屬膜界面,發(fā)生全內(nèi)反射;改變θ,當(dāng)表面等離體波波矢ksp與光波在界面方向的分量kx匹配相等時,會發(fā)生反射光被金屬等離子體吸收現(xiàn)象,激發(fā)表面等離體激元共振,反射光能量急劇下降,達(dá)到最低。SPR對金屬膜表面的介質(zhì)的折射率的改變極其敏感,折射率的微小變化都會引起SPR角的變化,對同一種介質(zhì),在金屬膜表面的結(jié)合量不同同樣會引起SPR響應(yīng)強度的不同?;谶@樣原理,SPR生物傳感器主要應(yīng)用在檢測樣品折射率、檢測生物膜厚度及覆蓋面密度、實時檢測生物分子相互作用?;诖?,本研究將對SPR傳感器對金膜表面貼附的不同樣品的折射率與共振角的檢測規(guī)律進(jìn)行分析,得出系統(tǒng)應(yīng)用于樣品折射率、生物膜樣品厚度分布及覆蓋面密度檢測的原理;并從兩種物質(zhì)相互作用的平衡反應(yīng)原理推導(dǎo)、分析SPR傳感器進(jìn)行實時分子相互作用檢測的方法,為SPR傳感器的系統(tǒng)設(shè)計及后續(xù)的應(yīng)用實驗奠定重要的理論基礎(chǔ)。

      1? 檢測樣品折射率變化

      折射率是表征各種材料光學(xué)性質(zhì)的重要參數(shù),反映了介質(zhì)的光學(xué)性質(zhì),一定條件下可以根據(jù)介質(zhì)的折射率來了解介質(zhì)的光學(xué)性能、純度、質(zhì)量濃度以及色散和性質(zhì)。根據(jù)敘述的表面等離體激元共振的基本原理,玻璃表面所覆蓋介質(zhì)的折射率的細(xì)微改變都會引起共振條件的改變,從而引起共振角度θSPR的改變,這里將討論折射率的改變與共振角變化之間的相互關(guān)系。

      建立一種三層薄膜Kretschmann結(jié)構(gòu)模型,如圖1所示。系統(tǒng)介質(zhì)共5種,入射光波長λ=632.8 nm,其中棱鏡選用ZF12,折射率n0=1.711 29;蓋玻片折射率為n1=1.516 8,厚度d1=0.2 mm;鉻厚度d2=5 nm,折射率n2=2.97;金膜厚度d3= 50 nm,折射率n3=0.219 6+3.323 9i,所測樣品折射率n4在1.331~1.345范圍內(nèi)逐漸增加,根據(jù)推導(dǎo)的多層薄膜光學(xué)系統(tǒng)的反射率公式得到不同樣品折射率的SPR曲線。

      從SPR曲線中可以得到每種折射率溶液對應(yīng)不同的共振角θSPR,隨著樣品折射率的增加,共振角度也是不斷增大的,在某一固定入射角度,樣品折射率越大,其對應(yīng)的反射率也越大。進(jìn)一步得到環(huán)境折射率與共振角的關(guān)系圖,環(huán)境折射率與共振角存在很好的線性關(guān)系,曲線經(jīng)過線性擬合得到線性相關(guān)系數(shù)為1,二者的關(guān)系式:

      根據(jù)這個關(guān)系,可以在實際檢測實驗中,由不同環(huán)境介質(zhì)中測得的共振角計算出相應(yīng)的環(huán)境折射率,再根據(jù)折射率與溶液質(zhì)量濃度之間的函數(shù)關(guān)系計算得到溶液的濃度分?jǐn)?shù)。

      2? 檢測樣品厚度及覆蓋面密度

      在當(dāng)前分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域中,生物膜受到越來越多的關(guān)注。生物膜的主要成分是磷脂分子,磷脂分子與其他脂分子雖然不是生物大分子,但是眾多的脂分子可以自組裝成膜。除了常見的脂單層膜和雙層膜的研究,脂質(zhì)體也是脂質(zhì)膜研究的一種常見對象。

      建立一種半圓柱形三層薄膜Kretschmann結(jié)構(gòu)模型,系統(tǒng)介質(zhì)共5種,分別為棱鏡、鉻層、金膜、生物膜和環(huán)境介質(zhì)。入射光波長λ=632.8 nm,其中棱鏡折射率n0=1.761 82,鉻厚度d1=5 nm,折射率n1=2.97,金膜厚度d2=50 nm,折射率n2=0.219 6+3.323 9i,環(huán)境介質(zhì)假設(shè)為水,折射率n4=1.33,生物膜樣品的折射率n3從1.40以步長為0.05變化到1.55,厚度d3從0變化到400 nm。

      在生物膜厚度小于10 nm的條件下,生物膜厚度d3與SPR共振角θSPR存在著線性關(guān)系,即SPR生物傳感器能夠線性地響應(yīng)樣品的輸入信號。橢偏儀測得脂質(zhì)膜的折射率為1.45,分別模擬計算脂質(zhì)膜厚度為0 nm、3 nm、5 nm、8 nm、10 nm的SPR曲線,并計算出共振角θSPR與脂質(zhì)膜厚度d3的關(guān)系,如圖2所示。從擬合的結(jié)果看,共振角θSPR與脂質(zhì)膜厚度d3存在很好的線性關(guān)系,其線性線性相關(guān)系數(shù)為1,擬合結(jié)果為:

      利用這個線性關(guān)系,實際應(yīng)用中可以根據(jù)檢測到的共振角θSPR來計算金膜上脂質(zhì)膜覆蓋的厚度。已知單層脂質(zhì)膜的厚度是3.98 nm,得到單層脂質(zhì)膜的共振角位移約為ΔθSPR=0.380。脂質(zhì)膜是由兩層磷脂分子構(gòu)成的,所以單層磷脂分子的厚度大約是1.99 nm。根據(jù)方程式(2),可以計算單層磷脂分子的共振角位移為ΔθSPR=0.190,進(jìn)一步計算覆蓋在傳感芯片上的磷脂分子層的數(shù)量。這對脂質(zhì)體制備條件的探索提供了很好的理論依據(jù)。

      3? 實時檢測分子相互作用的變化

      表面等離體激元共振是一種允許實時對生物分子進(jìn)行動力學(xué)和平衡結(jié)合情況檢測的物理光學(xué)技術(shù)。首先將探針分子固定在傳感器表面,然后將目標(biāo)結(jié)合相溶液流過表面。探針分子和目標(biāo)分子的相互作用將會改變金屬表面的折射率,繼而改變穿過金屬傳感器的表面等離體的性質(zhì)。

      兩種生物大分子相互作用的過程中,有一種分子主動尋找與之相互作用的另外一種分子。相互作用主動方的分子被稱為配體(ligand),被動方的分子被稱為受體(receptor)。SPR傳感器應(yīng)用于實時檢測相互作用的兩種分子在金膜上的吸附與結(jié)合,先將親和反應(yīng)的一對分子中一種分子固定在金膜表面,另一種分子以溶液形式通過金膜表面時,二者的反應(yīng)會引起金膜表面附近的折射率的改變,反應(yīng)的傳感圖如圖3所示。曲線部分分別表示分子相互作用中結(jié)合、解離和再生過程。

      假設(shè)固定的配體L與注射通過的分析物A(受體)兩種分子相互作用,形成復(fù)合體AL,這是個可逆反應(yīng)式(3),符號ka和kd分別是復(fù)合體的合成速率和解離速率。

      用兩種分子的相互作用的結(jié)合信號曲線圖擬合,而解離信號曲線的擬合可以得到kd的值,由此可以得到結(jié)合速率常數(shù)ka和解離速率常數(shù)kd。進(jìn)而得到解離平衡常數(shù)和親和力平衡常數(shù)的值。

      4? 結(jié)? 論

      此外,本章對表面等離體激元共振傳感器的應(yīng)用方法進(jìn)行了詳細(xì)分析。以三層薄膜Kretschmann結(jié)構(gòu)系統(tǒng)為模型,討論了SPRi系統(tǒng)應(yīng)用于檢測樣品折射率的原理,得出折射率與SPR共振角的關(guān)系,以此可以根據(jù)檢測的SPR共振角來獲取相應(yīng)的樣品折射率,了解材料的光學(xué)性能參數(shù)等。另外,闡述了當(dāng)前越來越受關(guān)注的生物膜樣品厚度分布檢測和覆蓋密度檢測的原理和方法。最后,對實時分子相互作用檢測方面進(jìn)行了理論推導(dǎo)和分析。討論了分子相互作用的結(jié)合、解離速率及平衡常數(shù)的推導(dǎo),為后面SPRi系統(tǒng)的應(yīng)用研究提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

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      作者簡介:朱天逸(1999.09—),男,漢族,江蘇南京人,本科在讀,主要研究方向:生物醫(yī)學(xué)傳感器及其應(yīng)用。

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