戴陳偉，刁慧敏，江楊帆，呂涵，周秀紅

(安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230061)

生物安全實驗室是指通過一系列的防護屏障和管理措施，以避免或控制被操作的有害生物因子危害，從而達到生物安全要求，使得實驗室可以用于開展微生物學(xué)、生物化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、動物實驗等領(lǐng)域的研究[1]。生物安全實驗室目前在科研、衛(wèi)生等領(lǐng)域使用非常廣泛，為了保證實驗室的安全運行，減少潛在風險，保證實驗結(jié)果的準確無誤以及保護實驗人員的人身安全，對生物安全實驗室工作臺面進行有效消毒是一項非常重要的措施[2]。一方面，實驗室工作人員需要接觸感染性病原體，這很容易引起實驗室感染事件[3]；另一方面，病原微生物實驗室的實驗操作，如樣品混合、吸吹、離心和轉(zhuǎn)移、開瓶(管)帽等很難避免氣溶膠的生成，可能污染操作環(huán)境，從而導(dǎo)致測試樣品之間的交叉污染，影響測試結(jié)果的可靠性[4-5]。

生物安全實驗室的消毒尤其是工作臺面的消毒，對于生物安全實驗室的良好運行以及工作人員的保護起到非常重要的作用。帖金鳳等[6]使用英國Bioquell 消毒機，按12 mL/m3速率用35% 的過氧化氫對生物安全實驗室進行汽化消毒，處理60 min后，放置在室內(nèi)不同位置表面的菌片上的枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢可被100%殺滅。韓杰等[7]用汽化過氧化氫進行P3生物安全實驗室模擬現(xiàn)場消毒試驗，結(jié)果顯示，當空氣中過氧化氫濃度為1 800 mg/m3，汽化過氧化氫消毒裝置運行60 min時，對各個位置載體上枯草桿菌黑色變種芽孢的殺滅對數(shù)值均大于6.0。

傳統(tǒng)消毒劑如84消毒液、新潔爾滅等化學(xué)消毒劑對實驗室工作臺面的消毒效果較好，細菌殺滅率一般可超過95%[8-9]。但84消毒液、新潔爾滅消毒后一般都會產(chǎn)生殘留，并且使用后實驗室會有一定的刺激性氣味，長期使用此類消毒方法還會使實驗室常見菌產(chǎn)生耐性，降低消毒效果[10]。另外使用84消毒液、新潔爾滅對工作臺面進行消毒時一般只會對正面及看得到的側(cè)面進行消毒，導(dǎo)致工作臺的下面及不容易消毒的位置就會留下消毒死角，從而影響整體消毒效果，帶來安全隱患。

過氧化氫溶液化學(xué)性質(zhì)活潑，易分解為氧氣和水，無殘留毒性，因而過氧化氫消毒不會對環(huán)境造成二次污染，被稱為最清潔的消毒劑。除了作為一種強氧化劑被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)領(lǐng)域[11]，過氧化氫超強的氧化能力也可以破壞微生物體內(nèi)的原生質(zhì)，從而達到殺滅微生物的效果，其對細菌繁殖體、真菌和細菌芽孢均有很好的殺滅作用[12-13]。過氧化氫消毒的原理主要是過氧化氫分子及其分解后產(chǎn)生的游離羥基和活性衍生物可直接作用和破壞細菌細胞膜，使其內(nèi)容物外泄，導(dǎo)致細菌機體死亡，或與微生物的蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)破壞和死亡[14]。

汽化過氧化氫發(fā)生器是一種新型的實驗室消毒設(shè)備，按照規(guī)定的消毒程序?qū)⒁簯B(tài)過氧化氫汽化，完成實驗室消毒。汽化過氧化氫發(fā)生器采用食品級過氧化氫，消毒過程自動化，所以對工作人員無毒無害，不會對實驗室工作臺和實驗儀器造成損害，同時對實驗室工作臺面消毒徹底、不留死角[6]。汽化過氧化氫適用于空間消毒，除生物安全實驗室外，還可用于醫(yī)院病房、實驗動物中心、優(yōu)良制造標準車間及各種生物安全設(shè)備(如隔離器、傳遞窗、生物安全柜和高效過濾器等)的消毒，具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著各國出臺的環(huán)保安全法規(guī)日趨嚴格，對于過氧化氫消毒的研究成為消毒領(lǐng)域的熱門課題之一。

本研究首先對3%過氧化氫消毒液進行中和劑鑒定和懸液定量殺滅試驗，并進一步使用汽化過氧化氫對生物安全實驗室工作臺面進行消毒，將對生物安全實驗室工作臺面的消毒效果同84消毒液和新潔爾滅進行比較，探討三種消毒方法在實際使用中的優(yōu)缺點，為生物安全實驗室工作臺面的日常消毒工作提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HTY-SUPER SD2型汽化過氧化氫發(fā)生器(浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司)，SQ810C蒸汽高壓滅菌器(江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠)，3002電子天平(杭州友恒稱重設(shè)備有限公司)，Ⅱ級A型生物安全柜(江蘇蘇凈集團有限公司)，SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司)。

1.2 材料

84消毒液(山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司，批號200811)，新潔爾滅(山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司，批號200402)，胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司，批號20190930)，3%過氧化氫消毒液(山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司，批號201118)。

2 試驗方法

2.1 中和劑鑒定試驗

按《消毒技術(shù)規(guī)范》衛(wèi)生部2002年版[15]中和劑鑒定試驗進行，選擇金黃色葡萄球菌(ATCC6538)作為細菌繁殖體代表，白色念珠菌(ATCC10231)作為真菌代表進行中和劑鑒定試驗，以含20 g/L硫代硫酸鈉和10 g/L吐溫80的PBS(phosphate buffered saline)溶液作為中和劑。試驗分為6組，如表1所示。

表1 中和劑鑒定試驗Table 1 Groups of neutralizer identification test

2.2 懸液定量殺滅試驗

取適量3%過氧化氫消毒液于無菌大試管中，置于20 ℃水浴中備用。取無菌試管，加入0.5 mL有機干擾物和0.5 mL試驗菌后，再吸取4 mL消毒劑迅速混勻。分別于作用5、10和15 min時，取試驗菌與消毒劑混合液0.5 mL加入到4.5 mL的中和劑中，混勻，再作用10 min后，進行活菌計數(shù)培養(yǎng)，計算殺滅對數(shù)值。試驗重復(fù)3次。

2.3 實驗室消毒試驗

2.3.1 消毒方法

汽化過氧化氫：盡量保持工作臺所在實驗室密閉，同時用封口膠帶將實驗室門縫密封，按照汽化過氧化氫發(fā)生器操作規(guī)程進行操作，以1 500 mg/m3的流量對實驗室進行消毒，消毒時間60 min。

84消毒液：配制400 mg/L的84消毒液，使用高壓滅菌處理的清潔布浸泡后對工作臺進行消毒，消毒時間15 min。

新潔爾滅：配制0.1%的新潔爾滅消毒液，使用高壓滅菌處理的清潔布浸泡后對工作臺進行消毒，消毒時間15 min。

2.3.2 采樣方法

消毒前采樣：隨機選擇3個實驗室的工作臺面，各放置2個5 cm×5 cm大小的無菌規(guī)格板，將經(jīng)高壓滅菌處理過的無菌棉拭子在裝有無菌生理鹽水的試管內(nèi)浸濕后，在規(guī)格板內(nèi)采用螺旋式方法均勻涂抹3次。采樣結(jié)束后用經(jīng)高壓滅菌處理過的剪刀剪除棉拭子與手接觸的部分，將剩余棉拭子置于裝有無菌生理鹽水的試管中，充分混勻，待檢。

消毒后采樣：分別用汽化過氧化氫、84消毒液、新潔爾滅對3個工作臺面進行消毒，消毒后的采樣方法與消毒前保持一致，消毒后的采樣位置應(yīng)為消毒前同一工作臺面附近的位置。

分別于消毒前60 min和消毒后30 min對工作臺面同一部位采用相同取樣方法取樣，進行活菌培養(yǎng)計數(shù)。

3 試驗結(jié)果

3.1 中和劑鑒定試驗結(jié)果

如表2所示，第1組無菌落生長；第2組金黃色葡萄球菌菌落生長數(shù)平均值為3.4×103CFU/mL，白色念珠菌菌落生長數(shù)平均值為2.3×103CFU/mL；第3、4、5組菌落生長數(shù)明顯多于第2組，其金黃色葡萄球菌菌落生長數(shù)組間誤差率分別為3.06%、3.30%和3.70%，白色念珠菌菌落生長組間誤差率分別為4.69%、3.38%和8.00%；第6組無菌落生長。結(jié)果表明，含20 g/L硫代硫酸鈉和10 g/L吐溫80的PBS溶液可以作為該過氧化氫消毒液殺滅金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的中和劑。

表2 中和劑鑒定試驗結(jié)果Table 2 Results of neutralizer identification test 單位：CFU/mL

3.2 懸液定量殺滅試驗結(jié)果

如表3所示，用過氧化氫消毒液對懸液內(nèi)的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌分別作用10、20、30 min，重復(fù)3次，平均殺滅對數(shù)值均大于5.00；用過氧化氫消毒液對懸液內(nèi)白色念珠菌分別作用10 、20、30 min，重復(fù)3次，平均殺滅對數(shù)值均大于4.00。懸液定量殺滅試驗結(jié)果表明，過氧化氫消毒液對懸液內(nèi)的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌分別作用10 min及以上，按《消毒技術(shù)規(guī)范》衛(wèi)生部2002年版[15]懸液定量殺滅試驗要求，均可以達到消毒合格。

表3 過氧化氫消毒液殺滅試驗結(jié)果Table 3 Results of sterilization of hydrogen peroxide disinfectant

3.3 實驗室消毒試驗結(jié)果

表4 三種消毒方法消毒前后菌落數(shù)比較Table 4 Comparison of colonies number before and after disinfection with three disinfection

同時計算三種消毒方法的殺菌率，試驗結(jié)果顯示汽化過氧化氫組的細菌殺滅率最小值為92.9%、最大值為100%、平均值為(98.54±2.53)%，84消毒液組細菌殺滅率最小值為92.9%、最大值為100%、平均值為(96.65±3.09)%，新潔爾滅組消毒液細菌殺滅率最小值為89.5%、最大值為100%、平均值為(94.54±4.30)%，細菌殺滅率平均值按照從大到小排序為汽化過氧化氫組、84消毒液組、新潔爾滅組，且該差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.487，P=0.045<0.05)，詳見表5。

表5 三種消毒方法殺菌率比較Table 5 Comparison of disinfection efficacy of three disinfection

4 結(jié)論

研究結(jié)果顯示，含20 g/L硫代硫酸鈉和10 g/L吐溫80的PBS溶液可以作為本研究所使用的3%過氧化氫消毒液的中和劑，且該過氧化氫消毒液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌作用10 min及以上，殺滅對數(shù)值大于5.00，對白色念珠菌作用10 min及以上，殺滅對數(shù)值大于4.00，均消毒合格。

汽化過氧化氫進行消毒后細菌殺滅率(98.54±2.53)%優(yōu)于84消毒液和新潔爾滅的消毒效果。由于汽化過氧化氫發(fā)生器是通過將過氧化氫汽化實現(xiàn)其消毒功能，使用過氧化氫發(fā)生器進行消毒的實驗室要求密閉效果較好[16]，而生物安全實驗室一般密閉性都比較好，因此汽化過氧化氫可以作為一種很好的生物安全實驗室工作臺面消毒方法[17]。