嵌合抗原受體T細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)工藝控制及質(zhì)量管理關(guān)注點(diǎn)探討

劉芬 孫程潔 王沖

摘 要 嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cell， CAR-T）治療產(chǎn)品的上市為惡性腫瘤治療提供了新手段。能否持續(xù)生產(chǎn)高質(zhì)量的CAR-T治療產(chǎn)品對CAR-T治療的成功至關(guān)重要。本文論述CAR-T治療產(chǎn)品生產(chǎn)工藝控制及質(zhì)量管理中應(yīng)予以特別關(guān)注的幾個(gè)要點(diǎn)，以期為該類產(chǎn)品質(zhì)量的持續(xù)改進(jìn)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)的監(jiān)管提供參考。

關(guān)鍵詞 嵌合抗原受體T細(xì)胞 細(xì)胞治療產(chǎn)品 生產(chǎn)工藝 質(zhì)量管理

中圖分類號：R951； R979.19 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：C 文章編號：1006-1533（2022）11-0008-03

引用本文 劉芬， 孫程潔， 王沖. 嵌合抗原受體T細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)工藝控制及質(zhì)量管理關(guān)注點(diǎn)探討[J]. 上海醫(yī)藥， 2022， 43（11）： 8-10； 63.

Discussion on concerns of manufacturing process and quality management of chimeric antigen receptor T cell therapy products

LIU Fen， SUN Chengjie， WANG Chong

（Shanghai Center for Drug Evaluation and Inspection， Shanghai 201210， China）

ABSTRACT Chimeric antigen receptor T cell （CAR-T） therapy provides a novel approach for the treatment of malignant tumors. Whether or not high-quality CAR-T therapeutic products can be sustainably produced is critical to the success of this therapy. This article discusses several points that special attention should be paid in the production process control and quality management of CAR-T therapeutic products， so as to provide reference for the continuous improvement of the quality of such products and the supervision of regulatory agencies.

KEY WORDS chimeric antigen receptor T-cells； cell therapy products； manufacturing process； quality management

近年來，嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cell， CAR-T）治療的臨床價(jià)值不斷顯現(xiàn)[1]，全球范圍內(nèi)已有多個(gè)該類產(chǎn)品獲準(zhǔn)上市。在我國，2021年有2個(gè)靶向CD19的CAR-T治療產(chǎn)品獲得批準(zhǔn)，用于治療復(fù)發(fā)性或難治性大B細(xì)胞淋巴瘤。在有大量臨床需求的情況下，質(zhì)量可控性成為CAR-T治療產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵因素。要能持續(xù)、穩(wěn)定地生產(chǎn)高質(zhì)量的CAR-T治療產(chǎn)品，這就涉及到生產(chǎn)工藝及流程的規(guī)范化、系統(tǒng)化和可度量化，且須符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的要求。與傳統(tǒng)的藥品相比，CAR-T治療產(chǎn)品是一類新型藥品，具有特殊性，故須根據(jù)其特點(diǎn)分析質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)并據(jù)此制定技術(shù)要求[2]。本文針對CAR-T治療產(chǎn)品及其生產(chǎn)工藝的特點(diǎn)，論述該類產(chǎn)品生產(chǎn)工藝控制及質(zhì)量管理中應(yīng)予關(guān)注的幾個(gè)要點(diǎn)。

1 CAR-T治療產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝及其特點(diǎn)

目前，已獲準(zhǔn)上市的CAR-T治療產(chǎn)品均由患者自體細(xì)胞經(jīng)基因修飾和擴(kuò)增生產(chǎn)，采取的均為個(gè)體化定制生產(chǎn)方式[3]，生產(chǎn)時(shí)間約需7 ～ 15 d。CAR-T治療產(chǎn)品生產(chǎn)涉及到的主要單元操作有T細(xì)胞富集、激活、轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增等[4]，須對整個(gè)生產(chǎn)過程進(jìn)行有效的控制，包括初始物料、工藝參數(shù)、過程產(chǎn)品等，確保生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和終產(chǎn)品批間質(zhì)量的一致性。

1.1 細(xì)胞單采和預(yù)處理

CAR-T治療產(chǎn)品由待治療患者的T細(xì)胞生產(chǎn)，其需先在醫(yī)療機(jī)構(gòu)通過外周血單采方式獲得患者的白細(xì)胞（初始物料），然后在經(jīng)過驗(yàn)證的規(guī)定時(shí)限內(nèi)啟動生產(chǎn)。初始物料中可能含有“污染”細(xì)胞，包括但不限于白血病母細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板和粒細(xì)胞等，這些非目的細(xì)胞會影響產(chǎn)品的生產(chǎn)，如可能的激活和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)，干擾CAR-T擴(kuò)增等[5-7]。因此，CAR-T治療產(chǎn)品生產(chǎn)的第一步就是對上述初始物料進(jìn)行處理，采用密度梯度離心或單抗磁珠分選等方法，盡可能去除非目的細(xì)胞，并獲得足夠數(shù)量及比例的T細(xì)胞。

待治療患者因受疾病和以往治療等因素影響，其血液中的T細(xì)胞數(shù)通常較健康人低，且不同患者間的差異很大[8]。因此，不同批產(chǎn)品的初始物料存在一定的異質(zhì)性，而初始物料的質(zhì)量是CAR-T治療產(chǎn)品生產(chǎn)工藝穩(wěn)健的物質(zhì)前提，故須關(guān)注初始物料的驗(yàn)收要求（如運(yùn)輸過程中的溫度控制、細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞活力、微生物水平等）、操作時(shí)限、達(dá)到目標(biāo)劑量水平所需的活細(xì)胞數(shù)，關(guān)注手工操作的批間一致性、預(yù)處理后的細(xì)胞活力、CD3+細(xì)胞比率、實(shí)際工藝控制能力等。

1.2 T細(xì)胞激活

為獲得足夠數(shù)量的T細(xì)胞，需對T細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。對此，最簡單、最常用的方法是使用具有高親和力的可溶性抗人CD3抗體來進(jìn)行非特異性的T細(xì)胞激活和擴(kuò)增。但由于初始物料經(jīng)預(yù)處理后，其所含大多數(shù)抗原遞呈細(xì)胞已被去除，為防止單獨(dú)信號刺激所誘導(dǎo)的T細(xì)胞過早凋亡或無能，此工藝中通常會加入支持T細(xì)胞擴(kuò)增的細(xì)胞因子，如白介素-2，以促進(jìn)T細(xì)胞增殖（并有維持此后生產(chǎn)的CAR-T功能的作用）。因此，在該生產(chǎn)步驟中，操作人員可能會進(jìn)行抗體及共刺激因子等試劑的配制和添加操作，須關(guān)注該步驟所用試劑的來源及配制、添加方法，關(guān)注潔凈環(huán)境的控制和無菌保障等要求。AC7C6331-A454-4D16-B030-FE54F1A966FF

1.3 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)

CAR-T治療產(chǎn)品生產(chǎn)的最關(guān)鍵步驟是將靶向目的抗原的抗體基因?qū)隩細(xì)胞，使T細(xì)胞表面表達(dá)能夠靶向腫瘤細(xì)胞抗原的受體。病毒載體修飾系統(tǒng)是目前CAR-T治療產(chǎn)品生產(chǎn)中最常用的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，通常采用慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，將病毒載體攜帶的抗原受體基因整合到宿主細(xì)胞基因組中。整合到宿主細(xì)胞基因組中的載體拷貝數(shù)關(guān)系到CAR-T治療產(chǎn)品的臨床效力，但過高的載體拷貝數(shù)也與更高的致癌基因插入的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[9]，故須特別關(guān)注該步驟中病毒載體的添加量和孵育時(shí)限的控制，以及相關(guān)驗(yàn)證情況。

在已獲準(zhǔn)上市的CAR-T治療產(chǎn)品中，既有采用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的，也有采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的。兩種病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的最顯著差異在于，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在細(xì)胞有絲分裂期間才能進(jìn)行基因整合，而慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)則在細(xì)胞分裂和非分裂期間都能進(jìn)行基因整合[10]。比較而言，對于T細(xì)胞激活后的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)時(shí)須更加關(guān)注轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間的控制。在該生產(chǎn)步驟中，部分工藝會對病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)孵育袋進(jìn)行特殊處理，如對轉(zhuǎn)導(dǎo)孵育袋進(jìn)行纖維連接蛋白的包被或使用其他轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑，以增強(qiáng)病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。因此，須關(guān)注該步驟中試劑的配制、添加，以及細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移、細(xì)胞離心清洗等操作。

1.4 CAR-T培養(yǎng)和擴(kuò)增

目前，大多數(shù)CAR-T治療產(chǎn)品生產(chǎn)過程中使用的都是一次性、透氣的細(xì)胞培養(yǎng)袋，這些培養(yǎng)袋的尺寸和形狀多種多樣，并提供無菌對接通道和無針閥門，可最大限度地減少培養(yǎng)及其操作單元引入污染的可能。制造商也可根據(jù)自身工藝要求，定制培養(yǎng)袋的尺寸、形狀或無菌對接通道[11]。對于在密閉系統(tǒng)中進(jìn)行的培養(yǎng)和擴(kuò)增過程，可適當(dāng)降低環(huán)境的潔凈度級別要求。通過合理的工藝流向設(shè)計(jì)，可有效減少制造商的硬件投入成本。這類培養(yǎng)袋因與CAR-T治療產(chǎn)品有直接且長期的接觸，故其管理顯得尤為重要，包括供應(yīng)商審計(jì)、入廠放行標(biāo)準(zhǔn)及要求、使用前檢查、發(fā)生意外破袋的應(yīng)急措施、產(chǎn)品相容性研究等。

病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后的擴(kuò)增培養(yǎng)是CAR-T治療產(chǎn)品生產(chǎn)中用時(shí)最長的步驟，需培養(yǎng)4 ～ 12 d。須關(guān)注擴(kuò)增培養(yǎng)過程中培養(yǎng)體系的控制和變更策略，以及CAR-T收獲的依據(jù)，如細(xì)胞活力、細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞表型、嵌合抗原受體表達(dá)率等中控指標(biāo)的監(jiān)測。

2 CAR-T治療產(chǎn)品質(zhì)量保障的特殊考慮

2.1 病毒載體管理

慢病毒載體和γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是CAR-T治療產(chǎn)品生產(chǎn)中采用的主要基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)，它們的質(zhì)量直接關(guān)系到CAR–T治療產(chǎn)品的質(zhì)量和一致性[12]。作為CAR-T治療產(chǎn)品生產(chǎn)中的關(guān)鍵物料，病毒載體的生產(chǎn)全過程都應(yīng)符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的基本原則和相關(guān)要求[13]。應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注病毒載體的來源、建庫、檢測（包括安全、鑒別、純度和滴度），以及放行要求、對照或參比品管理、穩(wěn)定性考察等。

2.2 無菌要求

CAR-T治療產(chǎn)品的初始物料是患者的活的T細(xì)胞，其多采用小批量多批次并行模式生產(chǎn)，且產(chǎn)品不可以進(jìn)行滅菌操作。因此，須在符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的條件下執(zhí)行嚴(yán)格的全生產(chǎn)過程無菌操作，并根據(jù)無菌工藝控制能力評估結(jié)果設(shè)計(jì)潔凈生產(chǎn)環(huán)境，防控生產(chǎn)過程中可能的污染和交叉污染。目前的CAR-T治療產(chǎn)品生產(chǎn)工藝中包含較多手工操作步驟，應(yīng)關(guān)注所有手工操作的暴露工序和與密閉系統(tǒng)連接有關(guān)的無菌生產(chǎn)操作，關(guān)注無菌驗(yàn)證，關(guān)注多品種共線生產(chǎn)的管控和同時(shí)開展多個(gè)操作單元的最大負(fù)荷能力。

2.3 初始物料和試劑的來源

CAR-T治療產(chǎn)品的初始物料是患者的T細(xì)胞。對于這類初始物料，應(yīng)進(jìn)行特定病原體的篩選和檢測，以避免病毒等的污染。CAR-T治療產(chǎn)品生產(chǎn)過程中使用的試劑，如血清、生長因子、單克隆抗體、抗生素、培養(yǎng)基等，雖然不是產(chǎn)品組分，但也應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品質(zhì)量屬性而關(guān)注它們的質(zhì)量控制要求，以及在產(chǎn)品中的殘留量控制，避免這些試劑本身或其引入的外來因子影響產(chǎn)品的安全性、效力和純度。

2.4 污染、混淆和差錯(cuò)的防控

CAR-T治療產(chǎn)品是個(gè)體化定制產(chǎn)品，有些制造商采用獨(dú)立生產(chǎn)單元模式設(shè)計(jì)多拷貝廠房。隨著市場需求規(guī)模擴(kuò)大，同時(shí)操作的單元數(shù)增多，以及質(zhì)粒和病毒載體生產(chǎn)單元的滿負(fù)荷運(yùn)轉(zhuǎn)等，CAR-T治療產(chǎn)品生產(chǎn)過程中發(fā)生混淆和差錯(cuò)的風(fēng)險(xiǎn)會增加。應(yīng)采取措施確保質(zhì)粒、病毒載體，以及CAR-T治療產(chǎn)品在生產(chǎn)、儲存和運(yùn)輸全過程中不發(fā)生混淆、污染和交叉污染等，包括建立電子追溯系統(tǒng)，建立唯一標(biāo)識，確保自初始物料接收到終產(chǎn)品回輸?shù)娜^程可追溯。

2.5 生產(chǎn)工藝控制和時(shí)限要求

生產(chǎn)過程中的監(jiān)測可用來指導(dǎo)關(guān)鍵操作的生產(chǎn)決策，如培養(yǎng)條件的微調(diào)、CAR-T的收獲節(jié)點(diǎn)、生產(chǎn)的繼續(xù)或中止等。對于中控節(jié)點(diǎn)管理，應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品驗(yàn)證和研究數(shù)據(jù)，確認(rèn)和記錄從初始物料采集到產(chǎn)品收獲的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)時(shí)間和儲運(yùn)條件，并開展恰當(dāng)?shù)倪^程監(jiān)測。應(yīng)持續(xù)確認(rèn)每一生產(chǎn)步驟所用時(shí)間和儲運(yùn)條件，以改進(jìn)和決定生產(chǎn)過程監(jiān)測的必要性，最關(guān)鍵的是要認(rèn)識到每一生產(chǎn)步驟時(shí)限要求的重要性。

3 醫(yī)療機(jī)構(gòu)的質(zhì)量管理

CAR-T治療產(chǎn)品不同于傳統(tǒng)藥品，醫(yī)療機(jī)構(gòu)作為端到端的兩個(gè)重要端口，既是產(chǎn)品初始物料的來源端，也是產(chǎn)品的最終使用端，故在一定程度上，醫(yī)療機(jī)構(gòu)質(zhì)量管理是產(chǎn)品質(zhì)量管理很重要的一部分。制造商應(yīng)選擇具有合法資質(zhì)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)，并開展定期質(zhì)量審計(jì)和評估，以確保醫(yī)療機(jī)構(gòu)在患者篩選、初始物料采集和產(chǎn)品使用的過程中符合既定的要求。

4 儲存和運(yùn)輸?shù)闹匾?/p>

對于CAR-T治療產(chǎn)品，采用液氮等超低溫冷凍的保存時(shí)限較冷藏（2 ～ 8 ℃）長，同時(shí)可擁有更充足的批放行檢測時(shí)限和更大的臨床使用靈活度。因此，目前大多數(shù)CAR-T治療產(chǎn)品都采用超低溫冷凍的儲存方式。須關(guān)注CAR-T治療產(chǎn)品凍存前后的轉(zhuǎn)運(yùn)方式及溫度控制、儲存條件及效期管理，以及產(chǎn)品由生產(chǎn)基地轉(zhuǎn)運(yùn)至醫(yī)療機(jī)構(gòu)的運(yùn)輸方式、儲存條件、溫度控制、突發(fā)應(yīng)急措施的制定。AC7C6331-A454-4D16-B030-FE54F1A966FF

5 結(jié)語

CAR-T治療產(chǎn)品已被證實(shí)對血液系統(tǒng)腫瘤的療效明顯，并正在進(jìn)行用于實(shí)體瘤治療的研究[14]。我國的CAR-T治療產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程在不斷加快，且越來越多的公司著重于開發(fā)相對簡單的生產(chǎn)工藝流程（如封閉系統(tǒng)、自動化生產(chǎn)），同時(shí)也帶動了質(zhì)粒及病毒載體、細(xì)胞因子、單克隆抗體等相關(guān)試劑行業(yè)的發(fā)展，市場前景良好。

藥品監(jiān)管部門始終關(guān)注著CAR-T治療產(chǎn)品相關(guān)的監(jiān)管問題。由于該類產(chǎn)品不同于化學(xué)藥品或一般的生物制品，工藝技術(shù)相對復(fù)雜，生產(chǎn)操作要求更高，且它們往往是通過加速審評途徑獲得附條件批準(zhǔn)而上市的，故不能完全照搬一般藥品的監(jiān)管方法來開展監(jiān)督檢查[15]。應(yīng)該是監(jiān)管部門與業(yè)界共同研討，結(jié)合CAR-T治療產(chǎn)品的質(zhì)量和生產(chǎn)特點(diǎn)，探尋更加科學(xué)、靈活和具有產(chǎn)品針對性的監(jiān)管策略及措施，以保證患者能夠獲得更好的產(chǎn)品和得到更有效的治療。

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