牛初乳與牛常乳乳脂肪球膜中豐度差異蛋白的表征與分析

李墨翰，張秀敏，王亦寧，陳佳麗，熱罕古麗，于海坤，張 娟，宋婉瑩，劉愛成，岳喜慶,*，鄭 艷,*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.北京食品科學(xué)研究院，北京 100068；3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076）

乳脂肪球膜的形成與乳脂的分泌過程密切相關(guān)，在乳脂肪球從乳腺細(xì)胞釋放到乳汁的過程中，乳脂肪球會(huì)穿過細(xì)胞膜并被三層磷脂包裹，而這三層磷脂層則被稱為乳脂肪球膜。乳脂肪球膜特殊的分泌過程可以收集哺乳動(dòng)物母體細(xì)胞表面的膜結(jié)合蛋白、碳水化合物和脂質(zhì)并將其轉(zhuǎn)移到乳汁中，為哺乳動(dòng)物新生兒提供營(yíng)養(yǎng)。同時(shí)，乳脂肪球膜還是一種異質(zhì)膜，其作為乳化劑可以防止乳脂肪球之間的相互融合與降解。乳脂肪球膜蛋白僅占乳中總蛋白質(zhì)的5%左右，但卻包含多種具有生理功能的蛋白質(zhì)，在哺乳動(dòng)物新生兒生長(zhǎng)發(fā)育過程中起到重要的作用。

此前鑒定到的牛乳乳脂肪球膜中的蛋白主要有乳黏附素、黏蛋白-1、黃嘌呤脫氫酶/氧化酶、脂肪酸合酶、脂肪酸結(jié)合蛋白等，這些蛋白在乳脂肪球膜蛋白中占有很大比例，同時(shí)還有大量的乳脂肪球膜蛋白有待表征。研究表明，泌乳期對(duì)乳中的蛋白質(zhì)、氨基酸、脂質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分存在顯著影響。然而，針對(duì)不同泌乳期牛乳乳脂肪球膜中豐度差異蛋白的表征與分析十分有限。

因此，本研究選定牛初乳和牛常乳中的乳脂肪球膜蛋白作為研究對(duì)象，利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)其中的蛋白質(zhì)進(jìn)行表征，并對(duì)兩組間的乳脂肪球膜豐度差異蛋白進(jìn)行篩選及生物信息學(xué)分析。研究結(jié)果將有助于了解泌乳期間乳蛋白成分的差異及其功能性，為牛乳制品的精深加工奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品均采集于遼寧省沈陽市沈北新區(qū)某牧場(chǎng)（123.59°E，41.93°N），牛初乳與牛常乳樣品分別采自45 頭中國(guó)荷斯坦奶牛（），所選取的奶牛標(biāo)準(zhǔn)為：年齡1～2 歲、首次分娩、體質(zhì)量500～600 kg、飲食與飼養(yǎng)條件一致。牛初乳選自分娩后0～1 d的奶牛，牛常乳選自分娩后30～40 d的奶牛。采集后的牛初乳與牛常乳樣品置于干冰中運(yùn)輸并保存于超低溫冰箱（-80 ℃）。實(shí)驗(yàn)前為排除個(gè)體差異，將45 份牛初乳樣品隨機(jī)分成3組，每組15 份樣品進(jìn)行充分混合，牛常乳樣品同處理。

三羥甲基氨基甲烷（CAS登錄號(hào)：77-86-1）、十二烷基硫酸鈉（CAS登錄號(hào)：151-21-3）、尿素（CAS登錄號(hào)：57-13-6）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT，CAS登錄號(hào)：3483-12-3）、胰蛋白酶（CAS登錄號(hào)：9002-07-7）、碘乙酰胺（CAS登錄號(hào)：144-48-9）、甲酸（CAS登錄號(hào)：64-18-6）、乙腈（CAS登錄號(hào)：75-05-8）、丙酮（CAS登錄號(hào)：67-64-1）、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS） 德國(guó)默克公司；超濾離心管（10 kDa）、超濾膜（10 kDa）、C過濾柱 美國(guó)密理博公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HX-20TL型恒溫混勻器 上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；YTLG-12A型真空冷凍干燥機(jī) 上海葉拓科技有限公司；HH-4型恒溫水浴鍋、JC-GGC6000型振蕩器 青島聚創(chuàng)設(shè)備有限公司；EK-5000 EDI型超純水系統(tǒng) 深圳伊科賽爾環(huán)保科技有限公司；Easy nLC型色譜系統(tǒng)、Q-Exactive型質(zhì)譜儀、F3型微量移液器、Nano Viper型C預(yù)柱（2 cm×100 μm，5 μm）、Easy A2型C分離柱（10 cm×75 μm，3 μm） 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；1-16型高速離心機(jī) 美國(guó)希格瑪公司；Centrivap型真空離心濃縮儀 美國(guó)拉康科公司；M60X型紫外-可見分光光度計(jì) 德國(guó)菲索公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪球膜蛋白的提取

取5 mL乳樣離心（10 000 r/min、15 min、4 ℃）以提取乳脂肪球，吸取上層乳脂肪球并加入5 倍體積的PBS，超聲（100 W、3 min，重復(fù)3 次）以洗去可溶性蛋白，小心吸取并去除上清液。隨后向其中加入10 倍體積的丙酮，并在暗房?jī)?nèi)靜置12 h以沉淀蛋白。收集靜置12 h后的混合物，在離心后（10 000 r/min、30 min、4 ℃）棄除上層液體并超聲（100 W、3 min，重復(fù)3 次），即得到乳脂肪球膜蛋白。

1.3.2 胰蛋白酶解

胰蛋白酶是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的蛋白酶，可以高效、特異地切割蛋白質(zhì)/多肽鏈中賴氨酸和精氨酸的羧基端。由于賴氨酸和精氨酸在蛋白質(zhì)序列中分布較廣，蛋白質(zhì)樣品經(jīng)胰蛋白酶消化后可產(chǎn)生平均長(zhǎng)度為14個(gè)氨基酸殘基并以堿性氨基酸結(jié)尾的肽段。這些肽段的羧基端賴氨酸或精氨酸殘基上以及氨基端分別帶一個(gè)正電荷，使得它們?cè)陔x子阱中碰撞誘導(dǎo)解離（collision-induced dissociation，CID）時(shí)產(chǎn)生b、y類型（y離子為主）的離子碎片，便于被質(zhì)譜有效檢測(cè)。因此，本實(shí)驗(yàn)選取胰蛋白酶進(jìn)行酶解，具體方法如下：取500 μg乳脂肪球膜蛋白，向其中加入150 mmol/L的DTT并孵育（90 ℃、100 min），待冷卻至25 ℃時(shí)，加入U(xiǎn)T緩沖液（150 mmol/L三羥甲基氨基甲烷和10 mmol/L尿素），在暗房中靜置30 min后使用超濾離心管進(jìn)行過濾，向其中加入U(xiǎn)T緩沖液與碘乙酰胺，并在暗房中靜置60 min。隨后將混合物離心（10 000 r/min、30 min、4 ℃），按照1∶40比向其中加入胰蛋白酶緩沖液（胰蛋白酶與PBS體積比為1∶8）并置于暗房中消化（37 ℃，12 h）。消化后使用超濾膜對(duì)混合物過濾并離心（10 000 r/min、15 min、4 ℃），并使用C過濾柱對(duì)其脫鹽。最后將樣品凍干并重新溶解于甲酸中（50 μL、0.1%）。

1.3.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析

液相色譜參數(shù)設(shè)置參照本實(shí)驗(yàn)室此前條件。液相色譜條件：0～110 min，100.0%～45.0% I、0.0%～55.0% II；110～115 min，45.0%～0.0% I、55.0%～100.0% II。流動(dòng)相I為99.80%去離子水-0.20%甲酸，流動(dòng)相II為15.80%去離子水-0.20%甲酸-84.00%乙腈。乳脂肪球膜蛋白樣品經(jīng)預(yù)柱后由C分離柱進(jìn)行分離（200 nL/min）。

質(zhì)譜條件：電壓2 kV，測(cè)量掃描分辨率70 000，范圍為/350～1 800。離子自動(dòng)增益控制設(shè)置為1×10，最長(zhǎng)隔離時(shí)間為50 ms，動(dòng)態(tài)排除操作為60 s，MS活化類型設(shè)置為HCD模式，所選擇/2，/200處分辨率為175 000，標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量30 eV，最小填充率0.1%。隨后使用MaxQuant對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行無標(biāo)記定量分析。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)與生物信息學(xué)分析

使用檢驗(yàn)和差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）值篩選兩組之間的乳脂肪球膜豐度差異蛋白，F(xiàn)C定義為某種蛋白在牛初乳中的豐度平均值與其在牛常乳中的豐度平均值的比值，牛初乳與常乳乳脂肪球膜中豐度差異蛋白的篩選閾值為：＜0.05且|FC|＞2.00。使用基因本體論（Gene Ontology，GO）功能注釋，京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG），注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫（The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery，DAVID）對(duì)牛初乳與常乳乳脂肪球膜中豐度差異蛋白的潛在功能及其參與的代謝通路進(jìn)行生物信息學(xué)分析。使用STRING分析牛初乳與常乳乳脂肪球膜中豐度差異蛋白間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛初乳與常乳乳脂肪球膜蛋白的表征

在牛初乳和常乳的乳脂肪球膜中共鑒定到763種蛋白質(zhì)，其中197種蛋白在6組中均被檢測(cè)到（圖1A）。圖1B顯示了上述197種蛋白的分子質(zhì)量，可以看到77種（占比39%）乳脂肪球膜蛋白的分子質(zhì)量為10～30 kDa，49種（占比25%）乳脂肪球膜蛋白的分子質(zhì)量在30～50 kDa。非標(biāo)記定量（label-free）蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)酶解肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析，該技術(shù)不需要使用昂貴的穩(wěn)定同位素標(biāo)簽作內(nèi)標(biāo)，只需分析大規(guī)模鑒定蛋白質(zhì)時(shí)所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，比較不同樣品中相應(yīng)肽段的信號(hào)強(qiáng)度，從而對(duì)肽段對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，也廣泛應(yīng)用與乳脂肪球膜蛋白的表征和鑒定。此前，Liao Yalin等利用label-free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)表征了不同泌乳期母乳的乳脂肪球膜蛋白并最終鑒定到191種蛋白；Lu Jing等使用label-free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)母乳、牛乳、山羊乳和牦牛乳中的乳脂肪球膜蛋白進(jìn)行表征，并分別鑒定到312、554、175種和143種蛋白；Ma Ying等采用label-free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在牛乳和山羊乳中分別發(fā)現(xiàn)了632種和137種乳脂肪球膜蛋白；本實(shí)驗(yàn)室此前采用label-free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)驢初乳及常乳中的乳脂肪球膜蛋白進(jìn)行了鑒定，并分別鑒定到216種和215種蛋白。本研究鑒定到的乳脂肪球膜蛋白將豐富對(duì)于不同泌乳期牛乳脂肪球膜蛋白成分的了解與認(rèn)識(shí)，為牛乳脂肪球膜蛋白的加工與利用提供基礎(chǔ)。

圖1 牛初乳與常乳乳脂肪球膜蛋白的表征Fig. 1 Characterization of milk fat globular membrane proteins in bovine colostrum and mature milk

2.2 牛初乳與牛常乳乳脂肪球膜中豐度差異蛋白的篩選

圖2 牛初乳與常乳乳脂肪球膜中豐度差異蛋白的篩選Fig. 2 Screening of differentially abundant proteins in fat globule membranes of bovine colostrum and regular milk

牛初乳與常乳的乳脂肪球膜中存在大量相同的蛋白，但其豐度卻不盡相同（圖2A），而這些蛋白含量變化的差異有可能是營(yíng)養(yǎng)需求的關(guān)鍵。因此，本研究錨定在牛初乳與常乳的乳脂肪球膜中均鑒定到的共有蛋白，并設(shè)置閾值以從其中篩選乳脂肪球膜豐度差異蛋白。如圖2B所示，本研究設(shè)置的閾值標(biāo)準(zhǔn)為＜0.05且|FC|＞2.00。最終篩選到80種乳脂肪球膜豐度差異蛋白，包括41種上調(diào)蛋白和39種下調(diào)蛋白（圖2C和表1）。其中，乳過氧化物酶（Uniprot編號(hào)P80025）、糖蛋白2（Uniprot編號(hào)F1N726）、黃嘌呤脫氫酶/氧化酶（Uniprot編號(hào)F1MUT3和P80457）、5’-核苷酸酶（Uniprot編號(hào)Q05927）、硒蛋白F（Uniprot編號(hào)A8YXY3）等蛋白已在此前文獻(xiàn)中報(bào)道，為乳脂肪球膜中的主要蛋白。

表1 牛初乳與常乳乳脂肪球膜中的豐度差異蛋白Table 1 Differentially abundant proteins in fat globule membranes between bovine colostrum and mature milk

續(xù)表1

2.3 牛初乳與牛常乳乳脂肪球膜中豐度差異蛋白的GO富集分析

圖3 牛初乳與常乳乳脂肪球膜中豐度差異蛋白的GO富集分析Fig. 3 GO enrichment analysis of the differentially abundant proteins in milk fat globule membranes of bovine colostrum and mature milk

GO功能注釋可分為分子功能、生物過程和細(xì)胞組成三大類，蛋白質(zhì)或者基因可以通過對(duì)應(yīng)序列號(hào)或者序列注釋進(jìn)行GO分析，從而了解其潛在的生理功能或細(xì)胞定位。如圖3所示，上述80種牛初乳與牛常乳乳脂肪球膜中的豐度差異蛋白可能參與的條目包括細(xì)胞外泌體、細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞質(zhì)、血液微粒、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、頂端質(zhì)膜、氧化還原過程、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。研究表明，羊乳初的乳脂肪球膜中表達(dá)的急性炎癥反應(yīng)、先天性免疫應(yīng)答等在GO功能注釋中的富集數(shù)量要多于羊常乳。與該結(jié)果相似，本實(shí)驗(yàn)在急性炎癥反應(yīng)、先天性免疫應(yīng)答GO功能注釋中富集到的蛋白也存在顯著差異，包括巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（Uniprot編號(hào)A0A0F7RPX0）、膜輔因子蛋白（Uniprot編號(hào)G3MWX4）、免疫球蛋白J鏈（Uniprot編號(hào)Q3SYR8）、結(jié)合珠蛋白（Uniprot編號(hào)G3X6K8）等。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)合GO功能注釋分析，本實(shí)驗(yàn)找到了一些與急性炎癥反應(yīng)、先天性免疫應(yīng)答等重要過程相關(guān)的乳脂肪球膜豐度差異蛋白，這些蛋白的在泌乳期間的豐度變化為哺乳動(dòng)物不同生長(zhǎng)發(fā)育階段提供了特定的保護(hù)。此外，細(xì)胞外泌體、細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域是大部分豐度差異蛋白所參與的細(xì)胞組分，同時(shí)也在此前關(guān)于乳蛋白在泌乳期間的變化研究中鑒定到。細(xì)胞外囊泡是蛋白質(zhì)、信使RNA、MicroRNA和脂質(zhì)運(yùn)輸完成細(xì)胞間通訊通路的重要媒介，根據(jù)它們的大小和發(fā)生分為3 類，包括外泌體、微泡和凋亡小體。其中，外泌體是直徑大約為30～120 nm的微型囊泡，它們包含其起源細(xì)胞的某些成分，包括蛋白質(zhì)和核酸等，并廣泛存在于血液、唾液、尿液和母乳等體液中。外泌體可通過萌芽進(jìn)入多囊泡體（multivesicular bodies，MVB）的內(nèi)腔而形成，并通過MVB與頂端質(zhì)膜融合從而釋放到細(xì)胞外液中，并參與行使某些關(guān)鍵生理功能。研究表明，牛乳中含有大量的異質(zhì)細(xì)胞群，包括乳汁分泌細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞、前體祖細(xì)胞和干細(xì)胞等。因此，這些豐度差異的乳脂肪球膜蛋白很可能由乳腺肌上皮細(xì)胞等分泌，并參與細(xì)胞外囊泡的形成，然后進(jìn)入乳汁。然而，上述乳脂肪球膜豐度差異蛋白以何種方式參與細(xì)胞外囊泡的形成，以及其所具有的生理功能仍有待進(jìn)一步研究。

2.4 牛初乳與牛常乳乳脂肪球膜中豐度差異蛋白的KEGG富集分析

圖4 牛初乳與常乳乳脂肪球膜中豐度差異蛋白的KEGG富集分析Fig. 4 KEGG enrichment analysis of the differentially abundant proteins in milk fat globule membranes of bovine colostrum and mature milk

如圖4所示，對(duì)上述乳脂肪球膜豐度差異蛋白進(jìn)行KEGG富集分析后，可以看到參與的代謝通路主要有代謝途徑（KEGG編號(hào)bta01100）、嘌呤代謝（KEGG編號(hào)bta00230）、苯丙氨酸代謝（KEGG編號(hào)bta00360）、酪氨酸代謝（KEGG編號(hào)bta00350）、丙酮酸代謝（KEGG編號(hào)bta00620）、糖酵解/糖異生（KEGG編號(hào)bta00010）、癌癥的中心碳代謝（KEGG編號(hào)bta05230）、氨基酸的生物合成（KEGG編號(hào)bta01230）、過氧化物酶體（KEGG編號(hào)bta04146）、阿米巴?。↘EGG編號(hào)bta05146）、胰高血糖素信號(hào)通路（KEGG編號(hào)bta04922）、碳代謝（KEGG編號(hào)bta01200）、蛋白聚糖在癌癥中（KEGG編號(hào)bta05205）、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)（KEGG編號(hào)bta04810）、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用（KEGG編號(hào)bta04060）。丙酮酸代謝是能量代謝途徑中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)之一，在三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝聯(lián)系中起著重要的樞紐作用。丙酮酸是糖酵解的終產(chǎn)物，也是糖異生的起點(diǎn)，且可以由轉(zhuǎn)氨作用生成。丙酮酸脫氫酶復(fù)合物可將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A并進(jìn)入三羧酸循環(huán)，或作為長(zhǎng)鏈脂肪酸、類固醇和酮體合成的起點(diǎn)。研究表明丙酮酸還在平衡生物體內(nèi)能量需求方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用：在限制氧氣供應(yīng)或在線粒體缺乏的情況下，由糖酵解產(chǎn)生的還原型輔酶I的再氧化不能與ATP的產(chǎn)生相耦合。相反，再氧化與丙酮酸還原為乳酸相結(jié)合，乳酸被釋放到血液中后主要被肝臟吸收，并被氧化成丙酮酸用于糖異生作用。此外，泌乳期間丙酮酸代謝的差異也在其他研究中得到印證，進(jìn)一步說明了其在哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育階段的重要作用。

2.5 牛初乳與牛常乳乳脂肪球膜中豐度差異蛋白的PPI分析

圖5 牛初乳與常乳乳脂肪球膜中豐度差異蛋白的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig. 5 Protein-protein interaction network of the differentially abundant proteins in milk fat globule membranes of bovine colostrum and mature milk

對(duì)上述乳脂肪球膜豐度差異蛋白進(jìn)行PPI分析，可以看到31個(gè)豐度差異蛋白間存在相互作用，并由此形成42 條相互作用（圖5）。其中結(jié)合珠蛋白（Uniprot編號(hào)G3X6K8）與2-磷酸--甘油酸水解酶（Uniprot編號(hào)F1MB08）與其他蛋白存在最多的相互作用條數(shù)（均為8 條）。結(jié)合珠蛋白能夠在血漿中與游離血紅蛋白結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而避免游離血紅蛋白對(duì)腎小管的損害，隨后結(jié)合珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物被脾臟中單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面的血紅蛋白清除受體（CD163）識(shí)別并結(jié)合，最后被吞噬降解。研究表明乳中的結(jié)合蛋白含量與母體的炎癥及免疫反應(yīng)密切相關(guān)，而其與乳中其他蛋白質(zhì)的相互作用，以及其對(duì)哺乳動(dòng)物新生兒的免疫調(diào)節(jié)作用仍有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)牛初乳及常乳乳脂肪球膜蛋白進(jìn)行表征，共鑒定到763種蛋白質(zhì)，其中197種蛋白為共有蛋白。隨后對(duì)牛初乳與常乳中的乳脂肪球膜中的豐度差異蛋白進(jìn)行篩選，共篩選到80種乳脂肪球膜豐度差異蛋白，包括41種上調(diào)蛋白和39種下調(diào)蛋白。生物信息學(xué)分析表明這些乳脂肪球膜豐度差異蛋白主要參與了細(xì)胞外泌體、細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域等細(xì)胞組成，并參與了代謝途徑、嘌呤代謝、苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝、丙酮酸代謝等代謝通路。隨后利用蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，為深入了解牛乳乳脂肪球膜蛋白組成及其功能奠定基礎(chǔ)。