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      臭鱖魚源清酒乳桿菌的分離鑒定及其在臭鱖魚發(fā)酵中的應(yīng)用

      2022-07-07 03:05:02周迎芹孫子怡黃晶晶鄭海波謝寧寧
      食品科學(xué) 2022年12期
      關(guān)鍵詞:清酒鱖魚乳酸菌

      周迎芹,孫子怡,黃晶晶,鄢 嫣,鄭海波,謝寧寧,*

      (1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,安徽 合肥 230031;2.安徽省食品微生物發(fā)酵與功能應(yīng)用工程實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230031;3.安徽科技學(xué)院食品工程學(xué)院, 安徽 滁州 239000)

      臭鱖魚又稱腌鮮鱖,是利用新鮮鱖魚為原料,配以食鹽、花椒等輔料,由乳酸菌等多種微生物共同發(fā)酵制得的發(fā)酵魚制品。傳統(tǒng)自然發(fā)酵使臭鱖魚在加熱熟化后,具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和細(xì)膩嫩滑的蒜瓣?duì)钊赓|(zhì)以及聞臭吃香的獨(dú)特風(fēng)味,市場(chǎng)接受度高,產(chǎn)業(yè)需求大。但在傳統(tǒng)自然發(fā)酵條件下,臭鱖魚發(fā)酵周期相對(duì)較長(zhǎng),生產(chǎn)效率低;人工操作過程較為模糊,加工環(huán)境控制不嚴(yán),產(chǎn)品質(zhì)量變化大,風(fēng)味品質(zhì)參差不齊,食用安全性存在潛在風(fēng)險(xiǎn),使其標(biāo)準(zhǔn)化、工業(yè)化生產(chǎn)受到嚴(yán)重阻礙。

      微生物接種發(fā)酵技術(shù)是縮短發(fā)酵時(shí)間和改善產(chǎn)品品質(zhì)的有效途徑之一。微生物發(fā)酵菌種主要來源于傳統(tǒng)自然發(fā)酵制品,包括乳酸菌、葡萄球菌、微球菌、酵母菌和霉菌等。在傳統(tǒng)自然發(fā)酵臭鱖魚中,乳酸菌是其發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)微生物菌群。Dai Zhiyuan等和李燕通過傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)技術(shù),系統(tǒng)研究了臭鱖魚在發(fā)酵過程中的微生物菌群組成,分離得到的乳酸菌主要為清酒乳桿菌()、乳酸乳球菌()、格氏乳球菌()等,在發(fā)酵中后期,清酒乳桿菌成為臭鱖魚中特定的優(yōu)勢(shì)乳酸菌。本實(shí)驗(yàn)室前期在對(duì)臭鱖魚不同發(fā)酵工藝微生物菌群組成解析時(shí)發(fā)現(xiàn),清酒乳桿菌也是臭鱖魚在傳統(tǒng)干腌、濕腌工藝中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌菌群。但目前,在對(duì)臭鱖魚乳酸菌資源的開發(fā)利用研究中,鮮見有關(guān)清酒乳桿菌在臭鱖魚中的應(yīng)用研究報(bào)道?;诖?,本研究以自然發(fā)酵臭鱖魚為分離基質(zhì),對(duì)其中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌——清酒乳桿菌進(jìn)行分離、鑒定,研究其生物學(xué)特性,并結(jié)合黃山臭鱖魚制作工藝,采用清酒乳桿菌接種發(fā)酵臭鱖魚,研究菌株對(duì)臭鱖魚發(fā)酵過程中特征蒜瓣的變化以及對(duì)質(zhì)構(gòu)、色澤和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響,以期為臭鱖魚發(fā)酵基礎(chǔ)研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      1.1.1 樣品

      臭鱖魚:采集于黃山臭鱖魚加工企業(yè),為傳統(tǒng)低溫濕法腌制發(fā)酵16 d的成品。

      鱖魚():購(gòu)于東至縣大聯(lián)圩有限公司,品種為秋浦花鱖,規(guī)格為0.5~0.6 kg/尾。

      1.1.2 培養(yǎng)基

      MRS液體培養(yǎng)基(1 L):胰蛋白胨10 g、牛肉膏8 g、酵母粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸氫二銨2 g、乙酸鈉5 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.04 g、吐溫-80 1 mL,pH 6.5±0.2。

      MRS-溴甲酚綠鑒別培養(yǎng)基(1 L):胰蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母粉10 g、番茄汁200 g、葡萄糖10 g、碳酸鈣20 g、溴甲酚綠0.1 g、吐溫-80 0.5 mL、瓊脂18 g,pH 6.0±0.2。

      水瓊脂培養(yǎng)基(1 L):瓊脂粉15 g。

      營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(1 L):胰蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉3 g、瓊脂18 g,pH 7.0±0.2。

      培養(yǎng)基均用蒸餾水配制和定容,并經(jīng)高壓滅菌(1.0×10Pa,20 min)后備用。

      1.1.3 試劑

      食用鈉鹽、花椒等調(diào)料 市購(gòu);氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乳酸菌生化鑒定試劑盒 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌DNA提取試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)聚合酶 北京天根生物有限公司。所有化學(xué)藥品均為分析純。

      1.2 儀器與設(shè)備

      ZWY-240恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司;T100 PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司;JY600C電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;H1750R高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;CR-400色差分析儀 柯尼卡美能達(dá)控股公司;TA. XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro System公司;FlavourSpec氣相色譜-離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)聯(lián)用儀 德國(guó)G.A.S.公司;臭鱖魚腌制發(fā)酵專用裝置由本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)。

      1.3 方法

      1.3.1 清酒乳桿菌的分離鑒定

      在無菌條件下,取臭鱖魚魚肉打成魚糜,用無菌生理鹽水將魚糜樣品稀釋至適當(dāng)濃度,劃線于MRS-溴甲酚綠平板上,進(jìn)行厭氧培養(yǎng)(30 ℃,48 h)。挑取平板上呈黃色、有溶鈣圈的菌落進(jìn)行重復(fù)劃線培養(yǎng),至菌株純化。通過革蘭氏染色、生理生化實(shí)驗(yàn),完成對(duì)疑似乳酸菌菌株的初步篩選。

      根據(jù)純化菌株在MRS-溴甲酚綠平板上的菌落特征,挑選符合清酒乳桿菌獨(dú)特菌落特征的菌株,即中心深綠色而周圍為淺綠色的菌落,進(jìn)一步進(jìn)行掃描電鏡觀察。通過細(xì)菌基因組提取試劑盒提取該菌基因組DNA,以通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)、1492R(5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系(50 μL):20 ng/μL模板1.0 μL,含2.5 mmol/L Mg的10×Buffer 5.0 μL,10 μmol/L上/下引物各1.5 μL,10 mmol/L dNTP 1.0 μL,5 U/μL聚合酶1.0 μL,ddHO 39.0 μL。擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸7 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海派森諾基因科技有限公司測(cè)序。通過MEGA 6.0軟件對(duì)菌株16S rDNA序列與NCBI乳桿菌屬菌株16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)分析,并采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

      1.3.2 清酒乳桿菌的生物學(xué)特性

      1.3.2.1 生長(zhǎng)條件優(yōu)化

      以厭氧培養(yǎng)至24 h的菌液OD為評(píng)價(jià)指標(biāo),先通過單因素試驗(yàn),對(duì)菌株在MRS液體培養(yǎng)基中的初始pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0),培養(yǎng)溫度(4、8、15、20、25、30、37、42 ℃),接種量(0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%)進(jìn)行優(yōu)化,然后利用Design-Expert 11軟件的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)組,以初始pH值、培養(yǎng)溫度和接種量3個(gè)因素為自變量,菌液OD為響應(yīng)值,通過響應(yīng)面分析對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)一步優(yōu)化,響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平如表1所示。

      表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 evels and codes of variables used for response surface analysis

      1.3.2.2 生長(zhǎng)、產(chǎn)酸能力測(cè)定

      將活菌數(shù)為1.0×10CFU/mL的SMF-L5種子液,按2%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基,30 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,間隔2 h取樣,分別以平板瓊脂計(jì)數(shù)法和光電比濁法測(cè)定活菌數(shù)和培養(yǎng)液OD,繪制生長(zhǎng)曲線,用pH計(jì)測(cè)定pH值和用NaOH溶液滴定法測(cè)定菌株產(chǎn)酸量,各指標(biāo)平行測(cè)定3 次。

      1.3.2.3 耐鹽、抑菌能力測(cè)定

      將活菌數(shù)為1.0×10CFU/mL的SMF-L5種子液,以2%的接種量接種于含0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 g/mL NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中,以培養(yǎng)24 h后的OD為評(píng)價(jià)指標(biāo),測(cè)定菌株耐鹽能力。

      將大腸桿菌()、金黃色葡萄球菌()以及從臭鱖魚中分離的腐生葡萄球菌()、丁香假單胞菌()分別劃線于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,以30 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h的培養(yǎng)液作為指示菌菌懸液。

      以2%接種量將清酒乳桿菌種子液接種于MRS液體培養(yǎng)基中,30 ℃靜置培養(yǎng)18 h,離心(6 000 r/min,10 min)后取上清液,采用牛津杯雙層瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)乳酸菌上清液抑菌特性。即取10 mL滅菌的水瓊脂傾注于培養(yǎng)皿底層,待其干后在其上放置牛津杯,每個(gè)培養(yǎng)皿放置4個(gè)。按100 μL指示菌懸液/20 mL保溫至46 ℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂比例進(jìn)行混合,傾注于放置好牛津杯的培養(yǎng)皿內(nèi),待其干后拔下牛津杯,以1 孔作為對(duì)照,向其中加入100 μL未接菌的MRS液體培養(yǎng)基,另外3 孔作為平行樣品,即向其中加入100 μL清酒乳桿菌上清液,4 ℃擴(kuò)散2 h,30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。取出觀察并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑,根據(jù)抑菌圈直徑大小判斷菌株抑菌性能。耐鹽及抑菌能力測(cè)試均設(shè)置3個(gè)平行樣。

      1.3.3 清酒乳桿菌對(duì)臭鱖魚食用品質(zhì)及揮發(fā)性物質(zhì)形成的影響

      1.3.3.1 發(fā)酵工藝流程

      發(fā)酵工藝流程:新鮮鱖魚→宰殺→清洗→碼放→腌制→發(fā)酵→包裝。

      傳統(tǒng)自然發(fā)酵操作步驟如下:a.取新鮮鱖魚,用魚鱗刷刷去魚體表面魚鱗,再經(jīng)剖腹宰殺,去除內(nèi)臟和魚鰓,用自來水和10%鹽水先后清洗一次,瀝水待用;b.將魚平整碼放于鱖魚發(fā)酵專用裝置內(nèi),一桶約碼放30 kg,每碼一層,撒上若干粒干炒過的花椒(花椒總量為魚質(zhì)量的0.1%),碼放結(jié)束后在上層魚體上放置按壓板;c.向桶內(nèi)加入提前配制好的腌制液,即0.08 g/mL食鹽溶液,以剛好浸沒按壓板為宜,按壓板上放置扁圓狀砝碼(按壓質(zhì)量為魚質(zhì)量的40%),用以將魚體全部浸壓于腌制液液面以下;d.合上發(fā)酵裝置頂蓋,以厭氧發(fā)酵方式,8 ℃發(fā)酵16 d。

      接種發(fā)酵則是將步驟c調(diào)整為:按1 kg魚添加1.25 g清酒乳桿菌濕菌體的量,將清酒乳桿菌充分溶于0.08 g/mL食鹽溶液中,作為腌制液。其他步驟同自然發(fā)酵操作步驟。

      發(fā)酵結(jié)束后,將臭鱖魚取出,用清水清洗干凈,備用。

      1.3.3.2 特征蒜瓣觀察

      用解剖刀沿臭鱖魚的脊背和鰓蓋后沿,將兩側(cè)魚皮劃裂,并輕輕剝離至尾部,分別切取同側(cè)、沿背鰭下方至側(cè)線之間的肌肉塊,并置于蒸鍋中隔水蒸煮10 min,取出室溫下冷卻后剝離蒜瓣肉,肉眼觀察并拍照。

      1.3.3.3 色澤、質(zhì)構(gòu)測(cè)定

      參照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法測(cè)定魚肉的色澤、質(zhì)構(gòu),每個(gè)樣品平行測(cè)定6 次。

      1.3.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

      參照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法,采用GC-IMS測(cè)定和分析樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),每個(gè)樣品進(jìn)行3 次平行測(cè)定。

      1.4 數(shù)據(jù)處理

      2 結(jié)果與分析

      2.1 清酒乳桿菌的分離與鑒定

      利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)手段,從自然發(fā)酵臭鱖魚中分離到1 株符合清酒乳桿菌形態(tài)學(xué)特征的菌株,命名為SMF-L5。SMF-L5菌株在含溴甲酚綠的MRS固體平板上的菌落特征為綠色(中心綠色,周圍淺綠色),中央凸起,邊緣整齊,表面光滑(圖1A);革蘭氏染色呈陽性,短桿狀排列,菌體大小約為1.0 μm×0.5 μm,無芽孢,無鞭毛,單個(gè)或成對(duì),成鏈狀排列(圖1B、C);可發(fā)酵纖維二糖、麥芽糖、水楊苷、蔗糖、菊糖和乳糖(表2)。對(duì)菌株SMF-L5的16S rRNA基因進(jìn)行測(cè)序,在GenBank中獲得序列登錄號(hào)為MZ208836。通過NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析,證實(shí)菌株SMF-L5與6668、JBAR-SPR、subsp.JUL0153等菌株聚類在同一分枝上(圖2),因此確定為清酒乳桿菌。

      圖1 清酒乳桿菌SMF-L5的形態(tài)特征Fig. 1 Morphological characteristics of L. sakei SMF-L5

      表2 清酒乳桿菌SMF-L5的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of L. sakei SMF-L5

      圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

      2.2 清酒乳桿菌的生物學(xué)特性

      2.2.1 清酒乳桿菌最適生長(zhǎng)條件

      通過單因素試驗(yàn)對(duì)菌株SMF-L5在MRS液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件(初始pH值、培養(yǎng)溫度、接種量)進(jìn)行初步優(yōu)化。結(jié)果顯示,當(dāng)初始pH值為4.0~6.0時(shí),菌液OD隨著初始pH值的升高先逐漸升高,至pH 6.0~8.0時(shí),菌液OD稍有下降;在培養(yǎng)溫度4~30 ℃時(shí),菌液OD隨著溫度升高而升高,在30~42 ℃范圍內(nèi)則隨著溫度升高而下降;菌株初始接種量在0.5%~2%時(shí),菌液OD隨接種量增加而升高,至2%~5%時(shí)又逐漸降低(圖3)。因此,將最適培養(yǎng)條件定為培養(yǎng)溫度30 ℃、初始pH 6.0、接種量2%。

      圖3 不同培養(yǎng)條件對(duì)清酒乳桿菌SMF-L5生長(zhǎng)的影響Fig. 3 Effects of different culture conditions on the growth of L. sakei SMF-L5

      2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

      表3 模型回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic polynomial model

      圖4 初始pH值、培養(yǎng)溫度與接種量交互作用對(duì)清酒乳桿菌SMF-L5 OD600 nm影響的響應(yīng)面圖Fig. 4 Response surface plots for individual and interactive effects of initial pH, growth temperature and inoculum on the growth of L. sakei SMF-L5

      通過Design-Expert 11軟件對(duì)回歸方程求解得到模型最大值,即培養(yǎng)溫度30.9 ℃、初始pH 6.15、接種量1.94%,此時(shí)菌體最大生物量達(dá)2.31。在最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),所得菌體生物量實(shí)際值為2.39±0.03,與理論值接近,表明該模型合理。

      2.2.3 清酒乳桿菌生長(zhǎng)、產(chǎn)酸能力

      圖5 清酒乳桿菌SMF-L5生長(zhǎng)(A)、產(chǎn)酸(B)能力Fig. 5 Growth (A) and acid production ability (B) of L. sakei SMF-L5

      菌株SMF-L5在培養(yǎng)最初,活菌數(shù)約為1.0×10CFU/mL,在4 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,14~24 h進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期,活菌數(shù)約達(dá)到7.0×10CFU/mL(圖5A),結(jié)果表明清酒乳桿菌在接種至培養(yǎng)基后具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力和較快的生長(zhǎng)速率。菌株在4~14 h對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi),培養(yǎng)基pH值下降速率較快,進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后pH值降至4.2,這與它具有良好的適應(yīng)性有關(guān),符合菌株的生長(zhǎng)曲線規(guī)律。在pH值不斷下降過程中,菌株也在持續(xù)產(chǎn)酸,最大產(chǎn)酸量達(dá)到10 g/L(圖5B)。表明菌株具有較強(qiáng)產(chǎn)酸能力,能夠有效降低發(fā)酵體系中的pH值。

      2.2.4 清酒乳桿菌耐鹽、抑菌能力

      2.2.4.1 清酒乳桿菌耐鹽能力

      在研究菌株SMF-L5耐鹽能力時(shí),發(fā)現(xiàn)當(dāng)NaCl添加量在0~0.1 g/mL范圍內(nèi),菌株生物量下降不明顯,至0.04~0.08 g/mL時(shí),生物量有所下降,但OD仍可維持在1.5以上,高于0.08 g/mL后,生物量則下降比較明顯,OD低于1.0(圖6),表明菌株具有一定的耐鹽能力,在較高鹽濃度環(huán)境中仍可較好地生長(zhǎng)和繁殖。

      圖6 清酒乳桿菌SMF-L5對(duì)NaCl的耐受結(jié)果Fig. 6 Tolerance of L. sakei SMF-L5 to NaCl

      2.2.4.2 清酒乳桿菌抑菌能力

      圖7 清酒乳桿菌SMF-L5對(duì)病原菌的抑制效果Fig. 7 Inhibitory effects of L. sakei SMF-L5 on pathogens

      以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及本實(shí)驗(yàn)室在臭鱖魚中常分離到的丁香假單胞菌、腐生葡萄球菌作為指示菌,研究清酒乳桿菌SMF-L5的抑菌能力,結(jié)果如圖7所示。SMF-L5菌株培養(yǎng)上清液對(duì)所有指示菌均有不同程度的抑制作用。對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別達(dá)到(14.42±0.21)mm和(18.40±0.46)mm,對(duì)臭鱖魚源丁香假單胞菌和腐生葡萄球菌抑菌圈直徑分別為(19.24±0.11)mm和(24.66±1.58)mm。

      2.3 清酒乳桿菌對(duì)臭鱖魚食用品質(zhì)及揮發(fā)性物質(zhì)形成的影響

      2.3.1 清酒乳桿菌對(duì)魚肉特征蒜瓣的影響

      腌制發(fā)酵而成的臭鱖魚,其典型的品質(zhì)特征為魚肉呈蒜瓣?duì)?。沿背鰭下方至?cè)線之間的肌肉,其蒜瓣?duì)钣葹槊黠@。蒸煮后通過剝離可以發(fā)現(xiàn),通過清酒乳桿菌接種發(fā)酵的臭鱖魚,其肉質(zhì)的蒜瓣?duì)畋茸匀话l(fā)酵臭鱖魚的肉質(zhì)蒜瓣?duì)罡?guī)則、更白亮(圖8)。

      圖8 清酒乳桿菌SMF-L5對(duì)臭鱖魚特征蒜瓣的影響Fig. 8 Influence of L. sakei SMF-L5 on the characteristic garlic clove-like appearance of fermented mandarin fish

      2.3.2 清酒乳桿菌對(duì)魚肉色澤、質(zhì)構(gòu)的影響

      通過清酒乳桿菌接種發(fā)酵后,臭鱖魚的色澤和白度均得到提升(圖9A),魚肉質(zhì)構(gòu)也產(chǎn)生了變化,硬度在接種發(fā)酵后有所降低,黏附性、彈性、膠黏性和咀嚼性則均有所增加(圖9B),表明清酒乳桿菌接種發(fā)酵可改善臭鱖魚的色澤和質(zhì)構(gòu),使臭鱖魚魚肉更為白亮、更有彈性。

      圖9 清酒乳桿菌SMF-L5對(duì)臭鱖魚色澤(A)、質(zhì)構(gòu)(B)的影響Fig. 9 Influence of L. sakei SMF-L5 on the color (A) and texture (B) of fermented mandarin fish

      2.3.3 清酒乳桿菌對(duì)魚肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成的影響

      通過GC-IMS的GC保留時(shí)間和IMS遷移時(shí)間對(duì)接種發(fā)酵、自然發(fā)酵臭鱖魚中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定,共鑒定出36種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),其中醇類11種、酮類8種、醛類5種、酯類5種、酸類2種、醚類3種、烯烴類2種(表4)。為進(jìn)一步比較接種發(fā)酵、自然發(fā)酵臭鱖魚中揮發(fā)性物質(zhì)組分的差異,利用LAV軟件將三維譜圖中的特征峰生成指紋圖譜(圖10),在指紋圖譜中,每縱列特征峰對(duì)應(yīng)一種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。接種發(fā)酵的臭鱖魚,丁酸乙酯、乙酸己酯、羥基丙酮、2,3-丁二醇、玫瑰醚、甲硫醇、2,3-戊二酮、甲硫基丙醛、2-辛醇、丙醇和4-甲基-2-戊酮等的含量明顯低于自然發(fā)酵臭鱖魚,而芳樟醇、-松油醇、-蒎烯、檸檬烯等揮發(fā)性香氣成分的含量比自然發(fā)酵臭鱖魚明顯增加,表明清酒乳桿菌接種發(fā)酵臭鱖魚,能夠降低魚肉中惡臭氣味的產(chǎn)生和促進(jìn)香氣物質(zhì)的生成。

      表4 接種、自然發(fā)酵臭鱖魚中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 4 Volatile substances of fermented mandarin fish using inoculated and spontaneous fermentations

      續(xù)表4

      圖10 清酒乳桿菌SMF-L5對(duì)臭鱖魚揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成的影響Fig. 10 Influence of L. sakei SMF-L5 on volatile flavor substances of fermented mandarin fish

      3 討 論

      乳酸菌是世界公認(rèn)的食品級(jí)安全微生物,被廣泛用于食品發(fā)酵以及天然食品防腐劑等食品工業(yè)上。在發(fā)酵魚制品中,乳酸菌是主導(dǎo)發(fā)酵過程的優(yōu)勢(shì)菌群之一,在改善發(fā)酵制品風(fēng)味、延長(zhǎng)保質(zhì)期、加速色澤形成和提高產(chǎn)品安全等方面發(fā)揮著不可替代的作用。傳統(tǒng)臭鱖魚發(fā)酵工藝屬于多菌種參與的、開放式的自然發(fā)酵,發(fā)酵體系中含有大量病原微生物,產(chǎn)品安全性不能得到有效保證,產(chǎn)品質(zhì)量和風(fēng)味品質(zhì)穩(wěn)定性差,通過乳酸菌發(fā)酵臭鱖魚,有望能夠解決這些問題。

      清酒乳桿菌最早是從發(fā)酵米酒中分離獲得,現(xiàn)已知泡菜、發(fā)酵乳制品、發(fā)酵香腸和發(fā)酵魚等自然發(fā)酵制品也是獲得清酒乳桿菌的良好來源。傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)是獲取純菌株必不可少的步驟,也是進(jìn)一步篩選優(yōu)良菌株的基礎(chǔ)。含溴酚藍(lán)或溴甲酚綠的MRS培養(yǎng)基適用于產(chǎn)酸類乳酸菌的篩選。嗜酸乳桿菌()、植物乳桿菌()、羅伊氏乳桿菌()、雙歧桿菌()等乳酸菌在含溴酚藍(lán)的MRS培養(yǎng)基上較易區(qū)分,植物乳桿菌、清酒乳桿菌和格氏乳球菌等乳酸菌在含溴甲酚綠的MRS培養(yǎng)基上形態(tài)差異較為明顯。清酒乳桿菌在含溴甲酚綠的MRS培養(yǎng)基上,其典型形態(tài)特征為菌落中心綠色、周圍淺綠色或中心綠色、周圍白色。努爾古麗?熱合曼等為跟蹤清酒乳桿菌在酸駝乳發(fā)酵過程中的作用,基于含溴甲酚綠的MRS鑒別培養(yǎng)基,實(shí)現(xiàn)了自然發(fā)酵酸駝乳中清酒乳桿菌的快速識(shí)別和分離。本實(shí)驗(yàn)在明確清酒乳桿菌為傳統(tǒng)發(fā)酵臭鱖魚中優(yōu)勢(shì)乳酸菌的前提下,借助含溴甲酚綠的MRS鑒別培養(yǎng)基從臭鱖魚中也成功分離到清酒乳桿菌,進(jìn)一步說明基于含溴甲酚綠的MRS鑒別培養(yǎng)基分類鑒定清酒乳桿菌的方法,簡(jiǎn)單、快速可行。

      良好的生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)速率及生物量積累至關(guān)重要。乳酸菌的生長(zhǎng)受環(huán)境中溫度影響較大,pH值對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)也具有較大影響。在本實(shí)驗(yàn)中,清酒乳桿菌SMF-L5對(duì)溫度、pH值等生長(zhǎng)條件具有較寬的適應(yīng)范圍,這很可能是清酒乳桿菌能夠成為臭鱖魚在自然發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)菌的主要原因。乳酸菌生長(zhǎng)代謝形成的低pH值發(fā)酵環(huán)境能夠有效抑制腐敗菌、致病菌的生長(zhǎng)和減少有害物質(zhì)的產(chǎn)生,從而提高產(chǎn)品的安全性。林城杏以傳統(tǒng)發(fā)酵酸魚中篩選出的植物乳桿菌接種發(fā)酵酸魚,發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌可明顯抑制產(chǎn)胺腸桿菌等腐敗菌和病原菌的生長(zhǎng),同時(shí)也使魚肉中的生物胺含量有所減少。以產(chǎn)酸能力強(qiáng)的乳酸菌應(yīng)用于臭鱖魚發(fā)酵生產(chǎn),將是主導(dǎo)臭鱖魚發(fā)酵過程、提升產(chǎn)品安全品質(zhì)的一種有效途徑。

      在發(fā)酵食品制作過程中,加入食鹽可一定程度抑制腐敗菌等雜菌的生長(zhǎng),在鹽腌發(fā)酵技術(shù)基礎(chǔ)上,通過添加耐鹽性微生物主導(dǎo)發(fā)酵過程,有利于縮短發(fā)酵時(shí)間和提升產(chǎn)品品質(zhì)。當(dāng)前臭鱖魚規(guī)模化生產(chǎn)主要以濕法腌制發(fā)酵工藝為主,鹽水質(zhì)量濃度控制在0.06~0.08 g/mL。清酒乳桿菌SMF-L5對(duì)高達(dá)0.08 g/mL鹽質(zhì)量濃度的培養(yǎng)條件仍具有較高的耐受能力,因此適于在臭鱖魚發(fā)酵體系中生長(zhǎng)。

      清酒乳桿菌SMF-L5對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等食品中常見病原菌的抑制作用,與肉及肉制品中被普遍分離到的清酒乳桿菌,具有相似的結(jié)果。在發(fā)酵香腸中,清酒乳桿菌能夠快速成為其中的優(yōu)勢(shì)菌,并能夠明顯抑制大腸桿菌和腸桿菌的生長(zhǎng)。如果將臭鱖魚源清酒乳桿菌接種至臭鱖魚發(fā)酵體系中,可使其成為主導(dǎo)發(fā)酵過程的優(yōu)勢(shì)菌群并抑制其他雜菌的生長(zhǎng)。

      清酒乳桿菌SMF-L5在接種發(fā)酵臭鱖魚時(shí),可能是通過改變發(fā)酵體系中的菌群結(jié)構(gòu),抑制產(chǎn)臭微生物生長(zhǎng)和減少細(xì)菌種類、數(shù)量,形成優(yōu)于自然發(fā)酵臭鱖魚的風(fēng)味。在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中,芳樟醇、-松油醇、-蒎烯和檸檬烯可賦予臭鱖魚具有植物花香的風(fēng)味特征,是在發(fā)酵過程中由添加的花椒所帶入。這些成分也是植物花椒本身主要的揮發(fā)性物質(zhì),隨著腌制發(fā)酵過程的進(jìn)行,花椒中的風(fēng)味物質(zhì)逐漸滲透進(jìn)入魚體,構(gòu)成魚肉重要的風(fēng)味物質(zhì)。在臭鱖魚風(fēng)味研究中,芳樟醇是常見的揮發(fā)性物質(zhì),且被認(rèn)為對(duì)臭鱖魚整體風(fēng)味品質(zhì)具有重要貢獻(xiàn)的風(fēng)味活性物質(zhì)。

      4 結(jié) 論

      通過含溴甲酚綠的MRS鑒別培養(yǎng)基,結(jié)合革蘭氏染色、生理生化實(shí)驗(yàn)以及16S rDNA分子生物學(xué)鑒定方法從傳統(tǒng)自然發(fā)酵臭鱖魚中分離到一株清酒乳桿菌,命名為SMF-L5。清酒乳桿菌SMF-L5在MRS液體培養(yǎng)基中的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度30.9 ℃、初始pH 6.15、接種量1.94%;該菌可耐受0.08 g/mL NaCl,對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌和丁香假單胞菌具有明顯的抑制作用;在應(yīng)用于臭鱖魚發(fā)酵時(shí),能夠使臭鱖魚具有更規(guī)則、更白亮的蒜瓣?duì)钊赓|(zhì)和更具彈性的質(zhì)構(gòu),同時(shí)還能使臭鱖魚產(chǎn)品的風(fēng)味得到提升。因此,表明臭鱖魚源清酒乳桿菌SMF-L5可作為良好的乳酸菌發(fā)酵劑,在臭鱖魚工業(yè)化生產(chǎn)上具有應(yīng)用潛力。

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