魏 晴， 陳代鳳， 覃亞雪， 梁珊珊， 孫慶文

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)大果木姜子研究中心，貴州貴陽 550025；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)植物多糖研究中心，貴州貴陽 550025）

米槁（Cinnamomum migaoH.W.Li）為 樟 科 樟屬植物，多生長于我國西南地區(qū)，以貴州為主。 其干燥成熟果實(shí)為大果木姜子， 是貴州十大苗藥之一（貴州省藥品監(jiān)督管理局，2003）。大果木姜子具有溫中散寒，理氣止痛的作用。通常人們把它當(dāng)作治療胸腹疼痛等疾病的藥物（王軍才等，2015）。近年來對大果木姜子的化學(xué)成分和藥理學(xué)方面研究比較深入（劉杰和郭江濤，2019；李建銀等，2003）。研究發(fā)現(xiàn)， 大果木姜子中主要成分為黃酮類。 黃酮類化合物具有抗氧化活性， 對自由基的產(chǎn)生有抑制作用， 并且對ROS、RNS 和其他活性物質(zhì)具有清除活性 （Bartekova 等，2018；Xue 等，2017）。由于黃酮類化合物的特定化學(xué)結(jié)構(gòu)、 結(jié)構(gòu)內(nèi)的特定取代模式以及擁有能夠充當(dāng)供氫分子的酚氫，因此， 具有抗氧化活性 （Hana 等，2021；Vladimir等，2020；Monika 等，2020）。 基于此推測大果木姜子發(fā)揮抗氧化作用的部位可能為黃酮組分。

超聲法具有提取速度快、溶劑用量少、提取率高、不影響物質(zhì)活性與化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，也是目前實(shí)驗(yàn)室階段使用非常廣泛的一種提取技術(shù)（王曉宏和宋燕，2019）。 響應(yīng)面法是一種基于三水平二階試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法， 比正交設(shè)計(jì)更簡化，比均勻設(shè)計(jì)更全面，可有效減少試驗(yàn)的次數(shù)，精密度高，預(yù)測性能好（徐仕娟等，2021）。 目前， 鮮見有關(guān)大果木姜子黃酮提取工藝及抗氧化活性的研究報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以大果木姜子黃酮為研究對象，以提取時間、液料比、超聲功率、乙醇濃度、 超聲溫度為考察因素， 以黃酮含量和對DPPH 清除率為考查指標(biāo)， 優(yōu)化大果木姜子黃酮最佳提取工藝， 為大果木姜子黃酮類成分的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 藥材產(chǎn)地為貴州省黔南州羅甸縣壩碰村， 經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鑒定為米槁（Cinnamomum migaoH.W.Li）的果實(shí)，大果木姜子。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%），北京萬佳標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)中心；95%乙醇，分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司；DPPH，美國Sigma-Aldrich 公司；其他化學(xué)試劑均為分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備 UV7 紫外可見分光光度計(jì)（梅特勒-托利多國際貿(mào)易上海有限公司）；HH-600型恒溫水?。ㄉ虾Ｒ豢苾x器有限公司）；FB224 電子分析天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500DE 超聲波清洗儀 （昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理 將新鮮的大果木姜子置于陰涼處晾干，除去枝梗和雜質(zhì)，粉碎，然后過40 目篩，即得大果木姜子粉末，備用。

1.3.2 黃酮提取的單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 提取時間對各指標(biāo)的影響 分別稱取大果木姜子粉末5 g，按照液料比20：1（mL/g），超聲功率80 W，乙醇濃度70%，超聲溫度60 ℃，提取時間分別為25、30、35、40、45 min 進(jìn)行提取，考察不同提取時間對各指標(biāo)的影響。

1.3.2.2 超聲功率對各指標(biāo)的影響 分別稱取大果木姜子粉末5 g，按照液料比20：1（mL/g），提取時間30 min，乙醇濃度70%，超聲溫度60 ℃，超聲功率分別為20、40、60、80、100 W 進(jìn)行提取，考察不同超聲功率對各指標(biāo)的影響。

1.3.2.3 液料比對各指標(biāo)的影響 分別稱取大果木姜子粉末5 g，按照提取時間30 min，超聲功率80 W，乙醇濃度70%，超聲溫度60 ℃，液料比分別 為10：1、20：1、30：1、40：1、50：1（mL/g）進(jìn) 行 提取，考察不同液料比對各指標(biāo)的影響。

1.3.2.4 乙醇濃度對各指標(biāo)的影響 分別稱取大果木姜子粉末5 g，按照液料比20：1（mL/g），提取時間30 min，超聲功率80 W，超聲溫度60 ℃，乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%進(jìn)行提取，考察不同乙醇濃度對各指標(biāo)的影響。

1.3.2.5 超聲溫度對各指標(biāo)的影響 分別稱取大果木姜子粉末5 g，按照液料比20：1（mL/g），提取時間30 min，超聲功率80 W，乙醇濃度70%，超聲溫度分別為40、50、60、70、80 ℃進(jìn)行提取，考察不同超聲溫度對各指標(biāo)的影響。

1.3.3 多評價指標(biāo)檢測方法

1.3.3.1 黃酮含量測定 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：參考徐仕娟等（2021）的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為：y=2.2766x-0.0057，R2=0.9997。樣品中黃酮含量的測定： 樣品中黃酮含量的測定也參考徐仕娟等（2021）的方法，黃酮含量計(jì)算公式如下：

式中：C 為樣品中黃酮濃度，mg/mL；D 為樣品溶液稀釋倍數(shù)；V表示供試品溶液體積，mL；m為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.3.2 抗氧化活性的測定 分別精密吸取各設(shè)定條件下提取的大果木姜子黃酮提取液0.2 mL置于10 mL 容量瓶中， 用95%乙醇定容搖勻搖勻。 再分別吸取各樣品2 mL 并加入2 mL DPPH，暗室放置30 min 后在517 nm 下測定吸光度（Ai）， 再分別吸取各樣品2 mL 加入2 mL 95%乙醇，搖勻后測定吸光度（Aj）。此外，吸取2 mL 95%乙醇和2 mL DPPH 于試管中， 快速測定吸光度（A0）。每個樣品測定3 次，取平均值計(jì)算各設(shè)定條件下提取的大果木姜子黃酮對DPPH 的清除率（ 張 鵬 等，2021；Hana 等，2021；Bartekova 等，2018）。

DPPH 自由基清除率%=［1-（Ai-Aj）/A0］×100。

1.3.4 總評歸一-響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取工藝參數(shù) 對提取效果進(jìn)行評價僅僅使用黃酮含量作為評價的指標(biāo)不足以代表效果的優(yōu)劣，故選用Hassan 的方法對黃酮含量和清除率2 個指標(biāo)進(jìn)行歸一化處理（呂明月等，2021；牛曉靜等，2019），2 個指標(biāo)都是取值越大越好， 計(jì)算公式為di=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin），Ymin 為 指 標(biāo) 中 最 小 值，Ymax 為指標(biāo)中最大值。 總評歸一值OD=（d1+d2+d3+…dk）/k（k 為指標(biāo)數(shù)）。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果， 選取對試驗(yàn)影響較大的因素即提取時間、液料比、超聲功率，以黃酮含量和清除率為評價指標(biāo)， 并選用OD 值作為響應(yīng)值進(jìn)行綜合評分， 采用三因素三水平響應(yīng)面法對試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同提取時間對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響 由表2 可知， 在固定其他條件下，提取時間在25 ～35 min，隨著提取時間增長，黃酮含量增高， 清除率也越高。 提取時間為35 min 時各指標(biāo)達(dá)到最高值。 40 min 及以后各指標(biāo)含量略有下降。 這可能是因?yàn)殡S著提取時間的延長，使得組織細(xì)胞破碎程度增加，細(xì)胞中其他可溶性雜質(zhì)溶出，導(dǎo)致黃酮含量降低，故抗氧化活性也降低。

表2 不同提取時間對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響

2.1.2 不同超聲功率對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響 由表3 可知， 在固定其他條件下，超聲功率在20 ～60 W，隨著超聲功率增加，黃酮含量增高，清除率也越高。 超聲功率為60 W時各指標(biāo)達(dá)到最高值。 當(dāng)超聲功率大于60 W 后各指標(biāo)含量略有下降。 可能是由于超聲功率過大導(dǎo)致黃酮結(jié)構(gòu)被破壞， 同時隨著功率增加體系溫度也會升高， 使得部分熱不穩(wěn)定的黃酮類化合物被分解，導(dǎo)致黃酮含量降低，抗氧化活性降低。

表3 不同超聲功率對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響

2.1.3 不同液料比對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響 由表4 可知，在固定其他條件下，液料比在10：1 ～40：1（mL/g），隨著液料比增長，黃酮含量增高， 清除率也越高。 液料比為40：1（mL/g）時各指標(biāo)達(dá)到最高值。 超過40：1（mL/g）后各指標(biāo)含量略有下降。 這可能是因?yàn)楫?dāng)液料比為40：1 時，溶液中黃酮類物質(zhì)已基本溶出，繼續(xù)增大溶劑量會造成其他可溶性雜質(zhì)成分的溶出，干擾黃酮含量的測定。

表4 不同液料比對大果木姜子黃酮含量和清除率的影響

2.1.4 不同乙醇濃度對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響 由表5 可知，固定其他條件下，乙醇濃度在50% ～70%， 隨著乙醇濃度增加，黃酮含量增高，清除率也越高。 乙醇濃度為70%時各指標(biāo)達(dá)到最高值。當(dāng)乙醇濃度增多，各指標(biāo)含量顯著下降。 這是由于高濃度的乙醇會增加溶液的溶解度，使其他可溶性雜質(zhì)被提取出來，故黃酮含量降低，抗氧化活性降低。

表5 不同乙醇濃度對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響

2.1.5 不同提取溫度對大果木姜子黃酮含量和抗氧化活性的影響 由表6 可知， 在固定其他條件下，溫度在40 ～60 ℃，隨著提取溫度升高，黃酮含量增加，DPPH 清除率也越高。 提取溫度為60 ℃時各指標(biāo)達(dá)到最高值，超過60 ℃后各指標(biāo)含量顯著下降。原因可能隨著提取溫度的升高，使得部分黃酮類化合物結(jié)構(gòu)改變，苯環(huán)被破壞，最終導(dǎo)致黃酮含量降低，抗氧化活性降低。

表6 不同提取溫度對大果木姜子黃酮含量和清除率的影響

2.2 總評歸一-響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取工藝參數(shù)結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對試驗(yàn)影響較大的因素即提取時間、液料比、超聲功率三個因素，以抗氧化活性、黃酮含量為評價指標(biāo)，并選用OD 值作為響應(yīng)值進(jìn)行綜合評分，采用三因素三水平Box-Behnken 響應(yīng)面法對試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表7。

表7 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2 建立響應(yīng)面模型擬合及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6.1 軟件，以提取時間、液料比、超聲功率為考察因素， 以黃酮含量和抗氧化活性為評價指標(biāo)，OD 值評分為響應(yīng)值對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸方程擬合得到回歸方程為：OD 值=0.98+0.046A-0.014B-0.30C +0.044AB-5.984E-003AC+0.019BC-0.28A2-0.33B2-0.34C2（A、B、C 分別代表提取時間、超聲功率、液料比），并對響應(yīng)面模型進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)，其結(jié)果見表8。

由表8 可知，該模型P＜0.0001，說明此模型差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 矯正系數(shù)R2Adj=0.9948，預(yù)測復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9977，預(yù)測相關(guān)系數(shù)R2（Pred）=0.9714，與預(yù)測復(fù)相關(guān)系數(shù)接近，說明偏差在合理范圍內(nèi)，實(shí)際值和預(yù)測值擬合度比較好。失擬項(xiàng)F=3.752E-003，P=0.0904＞0.05 不顯著， 說明選擇的模型對該試驗(yàn)的擬合度較好。 變異系數(shù)CV 為4.88%，說明該模型相關(guān)性好，可用該擬合回歸方程對不同條件下大果木姜子黃酮的OD 值進(jìn)行分析。液料比對大果木姜子黃酮OD 值影響較大，其次為提取時間。由表8 可知，A、C、AB、A2、B2、C2的P＜0.05，以上因素對黃酮OD 值影響顯著，其他因素對黃酮OD 值影響不顯著。 由F 值可知，3 個因素對大果木姜子OD 值影響程度的大小順序?yàn)椋阂毫媳龋咎崛r間＞超聲功率。

表8 基于多指標(biāo)總評歸一評分的回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析 采用Design-Expert 8.0.6.1 軟件做超聲提取工藝參數(shù)的Box-Behnken響應(yīng)面3D 圖及等高線分析圖，見圖1，通過其擬合圖形分析提取時間、超聲功率、液料比對OD 值的影響。 由圖可知，等高線越密集，中間形狀呈橢圓形或圓形， 響應(yīng)曲面越陡峭說明該因素變化對響應(yīng)值影響大，且兩因素之間的交互作用大，反之表明兩因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響較小。 結(jié)合表8 的P值和圖1 可知A、C、AB、A2、B2、C2因素對OD 值均具有顯著性（P＜0.05），A 和C對響應(yīng)面弧面影響較大。 通過求解回歸模型方程得到最佳超聲提取工藝參數(shù)為： 提取時間34.93 min，超聲功率59.37 W，液料比39.67:1（mL/g），此條件下OD 值為0.9847。

圖1 超聲提取工藝參數(shù)的Box-Behnken 響應(yīng)面3D 圖及等高線分析圖

2.2.4 工藝驗(yàn)證 為檢驗(yàn)試驗(yàn)方法的可靠性，將對優(yōu)化后的工藝參數(shù)進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)， 同時考慮到優(yōu)化實(shí)際操作的可行性， 最終將試驗(yàn)參數(shù)定為：提取時間35 min，超聲功率60 W，液料比40:1（mL/g）， 得到的OD 均值為0.9910， 與預(yù)測值0.9847 相比偏差為0.09%， 說明本試驗(yàn)所建模型預(yù)測性較好且穩(wěn)定。 故基于總評歸一-響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取工藝參數(shù)的方法可行且穩(wěn)定。

3 結(jié)論

為了更好提取出大果木姜子中黃酮， 僅通過黃酮含量來評價，不足以代表提取工藝的優(yōu)劣，因此采用多指標(biāo)來評價能夠更加客觀綜合的反映藥材的最優(yōu)提取工藝。 本試驗(yàn)以黃酮含量、 黃酮對DPPH 清除率為評價指標(biāo)，超聲功率、提取時間和液料比為考察因素， 采用總評歸一-響應(yīng)面法對超聲提取工藝的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化， 得到最佳提取工藝參數(shù)為：提取時間35 min，超聲功率60 W，液料比40：1（mL/g），得到的OD 值為0.9910，黃酮含量為2.48%， 該條件下對DPPH 自由基清除活性為93.18%。本研究為大果木姜子黃酮進(jìn)一步研究開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。