王美嬌 徐軍全 宋維芳 劉曉玲

[摘要]目的探討Toll-樣受體4（TLR4）信號通路阻斷劑多粘菌素B（PMB）對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細胞系（HSC-T6）自噬的影響并探討自噬在肝纖維化（HF）中的意義。方法將常規(guī)培養(yǎng)的HSC-T6分為對照組、LPS組、PMB組、LPS+PMB組，各組細胞經(jīng)相應(yīng)處理后，以Westernblot法檢測各組微管相關(guān)蛋白輕鏈II（LC3II）及TLR4表達水平;免疫熒光法檢測各組LC3在細胞內(nèi)的分布情況;ELISA法檢測各組細胞培養(yǎng)上清中層黏蛋白（LN）、透明質(zhì)酸（HA）、III型前膠原蛋白（PCIII）及IV型膠原蛋白（CIV）含量。結(jié)果LPS組HSC-T6中LC3含量、LC3II蛋白表達水平及細胞培養(yǎng)上清中LN、HA、PCIII及CIV含量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;LPS+PMB組HSC-T6細胞中LC3含量、LC3II蛋白表達水平及細胞培養(yǎng)上清中LN、HA、PCIII及CIV含量均低于LPS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論LPS可能通過活化TLR4信號通路進而促進HSC-T6細胞自噬及纖維化。

[關(guān)鍵詞]肝星狀細胞;TLR4;自噬;內(nèi)毒素

[中圖分類號]R363

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-0616（2022）11-0035-04

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是由各種致肝損傷因素作用引起慢性肝損傷并最終發(fā)展形成肝硬化的必經(jīng)階段[1-2]，以細胞外基質(zhì)（exrta cellular matrix，ECM）合成降解失衡導(dǎo)致其過度在肝臟中沉積為顯著病理變化，其中肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）的活化并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞仍被認為是HF形成過程中ECM的主要來源[3-4]。自噬（autophagy）是在真核生物中普遍存在的一種高度保守的物質(zhì)循環(huán)利用的過程，對于維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有十分重要的意義[5-6]。近年來，已有越來越多的研究表明細胞自噬在HF的發(fā)生及發(fā)展中具有十分重要的作用[7]。本實驗室先前已有研究表明[8]LPS可以誘導(dǎo)HSC-T6自噬，但其可能并非通過NF-κB通路。Toll樣受體4（Toll-like receptors4，TLR4）作為LPS引起肝臟炎癥反應(yīng)以及最終引起HF等過程中的關(guān)鍵信號通路之一，是否會影響HSC-T6自噬也有待進一步研究。本實驗旨在探討多粘菌素B（polymyxinB，PMB）預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)的HSC-T6自噬的影響并探討其可能機制。

1材料與方法

1.1實驗材料

HSC-T6細胞（齊氏生物科技有限公司）;高糖DMEM培養(yǎng)基細（武漢博士德生物工程有限公司）;胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）;LPS、兔抗微管相關(guān)蛋白輕鏈（microtubule-associated protein light chain，LC3）抗體（SIGAM公司）;小鼠抗TLR4抗體（Abcam公司）;大鼠層黏蛋白ELISA試劑盒、大鼠透明質(zhì)酸ELISA試劑盒（上海西塘生物科技有限公司）;III型前膠原蛋白（PCIII）及IV型膠原蛋白（CIV）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）;PMB（Solarbio 生物科技有限公司）。EonTM型微孔板分光光度計（美國BioTek公司）;DM4000BLED型熒光顯微鏡（德國Leica公司）;超凈工作臺（上海智誠公司）;HF90型細胞培養(yǎng)箱（Heal Force公司）;DYY-7C型電泳儀（北京六一機器廠）;化學(xué)發(fā)光成像儀（美國Alpha Innotech公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與傳代HSC-T6接種于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37°C含5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每1～2天更換新鮮培養(yǎng)基，待細胞匯合度大于80%時，用含EDTA胰酶消化并傳代。

1.2.2實驗分組接種于6孔板的HSC-T6分為對照組（不做特殊處理）、LPS組（0.1mg/LLPS處理12h）、PMB組（10mg/LPMB處理12h）及LPS+PMB組（10mg/LPMB預(yù)處理1h后立即給予終濃度為0.1mg/L的LPS處理12h）。各組細胞經(jīng)相應(yīng)處理后提取蛋白、固定或收集培養(yǎng)上清備用。

1.2.3Westernblot法各組細胞經(jīng)EDTA溶液處理后收集離心并裂解，經(jīng)BCA法測定后調(diào)整蛋白濃度，加入5×loadingbuffer煮沸變性后收集蛋白樣品。每孔30μg總蛋白上樣后經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后分別加入抗LC3（1∶4000）和抗TLR4（1∶500）抗體4°C過夜，TBST洗滌后分別加入HRP標記的羊抗兔（1∶20000）和羊抗小鼠（1∶1000）二抗于37°C恒溫氣浴70min，TBST洗滌后通過加入ECL化學(xué)發(fā)光液，X膠片曝光后通過顯影定影并根據(jù)目的條帶與內(nèi)參β-actin積分光密度比值行半定量分析，重復(fù)三次平行實驗，結(jié)果取平均值。

1.2.4免疫熒光法HSC-T6接種于無菌載玻片，經(jīng)相應(yīng)處理12h后棄培養(yǎng)基，用4°CPBS洗滌后再用預(yù)冷后的丙酮固定30min，PBS洗滌后經(jīng)免疫熒光封閉液孵育30min，加入抗LC3抗體（1∶100），于4°C孵育冰箱過夜，經(jīng)PBS洗滌后再加入熒光二抗（1∶100）37°C避光孵育1h，經(jīng)PBS洗滌后對細胞核進行DAPI染色，封片處理后于熒光顯微鏡下觀察，重復(fù)三次平行實驗并通過Image-ProPlus分析各組綠通道平均灰度值。

1.2.5細胞培養(yǎng)上清非膠原蛋白如層黏蛋白（Laminin，LN）、蛋白多糖如透明質(zhì)酸（hyaluronicacid，HA）、PCIII及CIV含量的檢測接種于6孔板的各組HSC-T6經(jīng)相應(yīng)處理12h后收集培養(yǎng)上清，每孔需分別加入標準品或各組待測樣品各100μl，輕輕搖晃使其充分混勻后37°C孵育20min，充分洗滌3～5次并用潔凈濾紙充分印干多余液體;加入一抗工作液和ddH2O各50μl后37°C孵育20min，經(jīng)洗滌后每孔各加酶標抗體工作液100μl，37°C孵育10min;繼續(xù)洗滌后加底物工作液各100μl，37°C孵育10min。洗滌后各加入100μl終止液并輕輕搖晃使其充分混勻，通過酶標儀在波長450nm處測OD值，重復(fù)三次平行實驗，結(jié)果取平均值。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS25.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間差異采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組HSC-T6中LC3、LC3II及TLR4含量比較

免疫熒光結(jié)果顯示LPS組LC3熒光灰度值高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;LPS+PMB組LC3熒光灰度值低于LPS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

Westernblot結(jié)果顯示LPS組LC3II蛋白表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;LPS+PMB組LC3II蛋白表達水平低于LPS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

PMB組TLR4表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;LPS+PMB組TLR4表達水平低于LPS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

2.2各組HSC-T6培養(yǎng)上清LN、HA、PCIII及CIV含量比較

LPS組培養(yǎng)上清LN、HA、PCIII及CIV含量高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;LPS+PMB組LN、HA、PCIII及CIV含量低于LPS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

3討論

我國是各種肝病的高發(fā)地區(qū)，在“肝炎-肝纖維化-肝硬化及肝癌”三部曲中，對肝纖維化的防治顯得極為關(guān)鍵。各種急、慢性肝臟疾病多數(shù)伴有內(nèi)毒素血癥，目前已經(jīng)公認腸源性內(nèi)毒素血癥可促進HF的發(fā)生與發(fā)展[9]，LPS可通過LPS-LBP-CD14三元復(fù)合物作用于TLR4，由此將胞外的各種信號傳遞到胞內(nèi)[10-11]。TLR4是識別LPS的關(guān)鍵受體之一，TLR4是自噬相關(guān)的先天性免疫的傳感器，且自噬和TLR4介導(dǎo)的免疫反應(yīng)具有共同的信號通路[12-13]。近年來已有大量研究提示TLR4信號通路可促進自噬，Xu等[14]通過研究發(fā)現(xiàn)LPS可誘導(dǎo)巨噬細胞自噬，而抑制TLR4信號通路可引起自噬體數(shù)量顯著減少;Wang等[15]也發(fā)現(xiàn)用LPS刺激人腹膜間皮細胞系后自噬體數(shù)量增加，采用siRNA或用PMB阻斷TLR4信號通路，LPS誘導(dǎo)的自噬被顯著抑制。上述研究均提示TLR4信號通路與自噬密切相關(guān)且TLR4信號通路可促進自噬，但也不乏相反的報道，有研究顯示，TLR信號通路中的Myd88死亡結(jié)構(gòu)域與Beclin1相互作用中具有重要意義，MyD88過表達會抑制自噬[16]，TLR反過來也可通過PI3K-AKT軸直接激活mTOR，從而對自噬產(chǎn)生影響。本研究基于HF的發(fā)生發(fā)展機制推測，LPS可能通過TLR4信號通路促進HSC-T6自噬并促進HF。

本實驗中所用的HSC-T6細胞是由SV40轉(zhuǎn)染SD大鼠HSC而成，具有活化HSC的表型。PMB為多肽類抗生素，具有抗菌和滅活LPS的作用，因此常作為TLR4信號通路阻斷劑[17]。ECM主要由膠原（如PCIII和CIV）、LN、HA三類成分組成，因此常作為臨床上監(jiān)測HF程度的有效指標[18-20]。LC3是自噬的特異性標志物，當自噬發(fā)生時，LC3I被激活，轉(zhuǎn)變成LC3II并附著于自噬體膜上，因此LC3II被作為反應(yīng)自噬水平的有效指標[7]，本研究采用LC3II/β-actin的積分光密度比值來衡量自噬水平。本實驗采用PMB預(yù)處理HSC-T6細胞，Westernblot結(jié)果提示PMB可有效阻斷TLR4信號通路，自噬相關(guān)蛋白LC3含量顯著下降，提示阻斷TLR4抑制了LPS誘導(dǎo)的HSC-T6自噬。為進一步探討HSC-T6自噬在肝纖維化中的意義。本研究檢測了HSC-T6培養(yǎng)上清中LN、HA、PCIII及CIV含量，結(jié)果顯示LPS組上述指標含量顯著增加，阻斷TLR4信號通路后其含量下降（P<0.05），提示HSC-T6自噬在肝纖維化中起到改善或保護作用。自噬是一種高度保守的物質(zhì)循環(huán)利用的過程，對于維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有十分重要的意義，在靜止的HSCs中自噬可能通過激活HSCs并通過降解脂滴為其提供能量，進而促進HF的形成，而對于HSC-T6來說，自噬反而可以作為一種存活機制，通過提高細胞自噬水平維持細胞內(nèi)外穩(wěn)態(tài)平衡，從而達到逆轉(zhuǎn)肝纖維化的目的[21-22]。

綜上所述，本實驗提示LPS可能通過活化TLR4信號通路進而促進HSC-T6自噬及肝纖維化。但本實驗也存在不足之處，TLR活化后信號通路與自噬關(guān)鍵分子之間的相互作用錯綜復(fù)雜，具體機制仍需進一步研究，更為重要的是本實驗為體外研究，無法準確反映在體內(nèi)的情況，有待于接下來進一步的動物實驗或原代HSC等研究。

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（收稿日期：2021-12-20）