越鞠丸對慢性不可預見性應激導致抑郁樣行為模型大鼠學習記憶的影響

張芯悅，梁 坤，沈國晴，馮清源，李光建，傅丹敏，胡安冉，汪萌芽，黃宏平

(皖南醫(yī)學院 1.啟明星小組；2.生理學與神經(jīng)生物學教研室，安徽 蕪湖 241002)

抑郁癥又稱抑郁障礙,以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征[1]，是一種嚴重危害公眾健康的疾病。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者常伴有認知功能損害,主要表現(xiàn)為注意力、學習記憶及執(zhí)行功能等障礙[2]，其中學習記憶功能是認知活動中的重要方面。近年來，許多臨床工作者對中醫(yī)藥治療抑郁癥引發(fā)的學習記憶障礙的療效及可能的作用機制的研究指出，抗抑郁的中藥制劑在某些認知功能的改善上優(yōu)于西藥[3],這可能為中醫(yī)藥治療抑郁癥開辟了一條新途徑。抑郁癥在我國中醫(yī)學中屬于“郁證”范疇，越鞠丸作為治療郁證的代表方劑，在臨床上還具有支持快速持久抗抑郁的作用[4]。有研究者基于新穎物體識別范式實驗，發(fā)現(xiàn)越鞠丸醇提物可以調(diào)節(jié)強迫游泳模型小鼠應激誘導的記憶障礙[5]，提示越鞠丸可能成為新的治療應激誘導學習記憶障礙的潛在藥物。本研究進一步探究越鞠丸對慢性不可預見性應激(chronic unpredictable stress，CUS)導致抑郁樣行為模型大鼠學習記憶功能的影響，為抗抑郁中藥治療應激導致的學習記憶障礙提供實驗參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠28只，體質量160～190 g，由南京青龍山動物繁殖場提供，許可證號SCXK(蘇)2017-0001。

1.2 儀器和藥品 44 cm×44 cm×47 cm大鼠曠場實驗箱(Panlab，USA)，Y型迷宮(MG-2型迷宮刺激器)由張家港市教學實驗器械廠提供，Morris水迷宮水池由實驗室參照文獻自制[6]，越鞠丸購自安徽省亳州市譙城區(qū)華佗鎮(zhèn)華佗拾遺中醫(yī)館。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及給藥 將28只雄性SD大鼠(160～190 g)分為正常組(n=9)、抑郁組(n=10)和越鞠丸組(n=9)。根據(jù)動物給藥劑量換算公式與越鞠丸使用說明書，大鼠每日劑量為3 g/kg。將越鞠丸放入超純水中，使用磁力攪拌器進行溶解，配置越鞠丸溶液。越鞠丸組與抑郁組造模完成后，對越鞠丸組持續(xù)21 d灌胃給藥越鞠丸溶液(1 mL/100 g)，正常組和抑郁組灌胃給予相同劑量的超純水(1 mL/100 g)。

1.3.2 CUS導致抑郁樣行為模型大鼠制備 根據(jù)曠場實驗評分將大鼠分組[7]，選擇得分高的9只大鼠作為正常組，其余隨機分為抑郁組和越鞠丸組，并對其進行抑郁樣行為模型制備，即孤籠飼養(yǎng)的同時連續(xù)3周進行CUS，包括24 h禁食、24 h禁水、24 h潮濕墊料、5 min水平搖晃、4℃冰水浴5 min、夾尾1 min、電擊30 min，每種刺激不連續(xù)出現(xiàn)2次。

1.3.3 CUS導致抑郁樣行為模型大鼠鑒定

1.3.3.1 糖水偏愛實驗 在文獻[8]方法上稍加變動，正式測試前訓練大鼠飲用濃度為2%的糖水。訓練結束后斷水24 h開始測試，給予每只大鼠兩瓶容量為100 mL的水壺，分別為糖水和純凈水，2 h后對水壺余量進行稱量，計算每只大鼠的糖水偏愛率。

1.3.3.2 曠場實驗 依次將每只大鼠放入曠場箱，測試時長為5 min，實驗人員在旁記錄，當大鼠4只爪同時爬入一格中計為水平得分1分，當大鼠2只前爪同時騰空遠離地面計為垂直得分1分，分別統(tǒng)計水平和垂直分數(shù)[9]，最后計算總得分。

1.3.4 空間學習記憶檢測

1.3.4.1 Morris水迷宮實驗 將水池等分成4個象限，實驗前一天依次將每只大鼠放至可視平臺適應15 s，結束后換成透明不可視平臺，實驗時將大鼠背向平臺、面向池壁自4個象限的標記點隨機放入，記錄大鼠找到平臺的時間為逃避潛伏期，連續(xù)5 d重復上述步驟。在最后一天的定位航行結束1 h后撤掉平臺，將大鼠隨機從任一象限標記點背向水池置入池中1次，記錄大鼠1 min內(nèi)到達目標象限所需的時間、在目標象限停留的時間和穿越虛擬平臺的次數(shù)[10]。

1.3.4.2 Y迷宮實驗 由3條臂[42 cm×15 cm×13 cm(長×寬×高)]組成。隨機將3條臂分成起始臂、其他臂與新異臂，實驗前3 d關閉新異臂，訓練大鼠適應環(huán)境。正式測試時，將新異臂打開，依次將大鼠自起始臂放入，記錄5 min內(nèi)每只大鼠進入3條臂的次數(shù)、順序與停留時間[11]。

2 結果

2.1 抑郁樣行為模型大鼠的行為學表現(xiàn)及空間學習記憶能力的變化

2.1.1 大鼠經(jīng)CUS刺激后的行為學表現(xiàn) 與正常組相比，抑郁組與越鞠丸組的體質量[抑郁組與越鞠丸組(243.09±16.99)g，正常組(385.14±20.63)g，t=19.298，P=0.000]、糖水偏愛率[抑郁組與越鞠丸組(0.70±0.24)%，正常組(0.87±0.05)%，t=2.077，P=0.048]、曠場實驗總得分(抑郁組與越鞠丸組43.32±23.07，正常組76.89±13.22，t=4.037，P=0.000)均有下降，顯示造模成功。

2.1.2 大鼠經(jīng)CUS刺激后空間學習記憶能力的變化 在Y迷宮實驗中，抑郁組、越鞠丸組與正常組相比，自主交替率降低[抑郁組與越鞠丸組(0.10±0.11)%，正常組(0.26±0.14)%，t=3.433，P=0.002]、新異臂停留時間縮短[抑郁組與越鞠丸組(93.58±48.21)s，正常組(189.78±68.36)s，t=3.798，P=0.003]，新異臂潛伏期延長[抑郁組與越鞠丸組(13.68±7.33)s，正常組(7.00±4.72)s，t=2.903，P=0.008]，說明慢性應激刺激對大鼠的空間學習記憶能力造成損傷。

2.2 越鞠丸對抑郁樣行為模型大鼠的行為學指標及空間學習記憶能力的影響

2.2.1 抑郁樣行為模型大鼠給予越鞠丸21 d后行為學指標的變化 在曠場實驗中，越鞠丸組(42.67±11.12)與正常組總得分(50.78±13.56)均高于抑郁組(30.20±10.42)(P<0.05)。抑郁組的體質量[(397.29±21.57)g]較正常組[(450.93±37.86)g]降低(P<0.05)，而3組在糖水偏愛率上差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明越鞠丸有一定的抗抑郁作用(圖1)。

2.2.2 給藥后越鞠丸組大鼠空間學習記憶能力的變化

2.2.2.1 Y迷宮實驗 越鞠丸組較抑郁組自主交替率[越鞠丸組(0.26±0.17)%，抑郁組(0.08±0.14)%、起始臂進入次數(shù)(越鞠丸組2.00±0.71，抑郁組1.00±0.82)和總進臂次數(shù)(越鞠丸組8.11±1.54，抑郁組5.80±2.66)均增加(P<0.05)。抑郁組較正常組自主交替率(0.29±0.14)%、起始臂進入次數(shù)(2.67±1.00)和總進臂次數(shù)(9.00±2.35)均降低(P<0.01)(圖2)。

A.F=5.533，P=0.010；B.F=9.325，P=0.001；C.F=5.175，P=0.013。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.2.2.2 Morris水迷宮實驗 在水迷宮空間探索階段中，越鞠丸組較抑郁組目標象限停留時間延長[越鞠丸組(29.22±4.49)s，抑郁組(24.50±4.20)s，P<0.05]，穿越虛擬平臺次數(shù)增加(越鞠丸組6.56±1.33，抑郁組4.30±0.95)(P<0.01)，顯示越鞠丸對抑郁模型大鼠的記憶能力具有改善作用(圖3)。

A.F=5.220，P=0.013；B.F=9.124，P=0.001。*P<0.05.**P<0.01。

3 討論

CUS可較好地復制抑郁癥的發(fā)病誘因[12]，尤其是環(huán)境因素，該模型動物的行為表現(xiàn)符合抑郁癥患者的核心癥狀[13]，同時模型可維持3個月，是一種理想可靠的造模方法[14]，因此本研究采用該方法制備抑郁模型，并使用曠場實驗和糖水偏愛實驗兩項行為學測試鑒定造模是否成功。本研究結果顯示，和正常組大鼠相比，抑郁組與越鞠丸組在曠場中總活動次數(shù)減少，與抑郁癥患者動作遲緩的癥狀相似，攝入糖水量的降低體現(xiàn)了興趣減退的特征[13]，同時伴有體質量明顯下降，顯示造模成功。越鞠丸在臨床上具有明顯的抗抑郁療效[4]，實驗中灌胃給藥21 d后的越鞠丸組曠場總得分高于抑郁組，表明越鞠丸能改善CUS所致抑郁大鼠的抑郁樣行為癥狀[5]，這可能依賴于越鞠丸能夠激活PKA-CREB信號通路使新生神經(jīng)元數(shù)量增加以達到抗抑郁的效果[15]。

抑郁癥的發(fā)生常伴隨著認知功能障礙的出現(xiàn)，其中學習記憶的損傷更為明顯[16]。慢性應激會導致大鼠產(chǎn)生學習記憶方面的損傷[17]，包括空間學習記憶、工作記憶等。Y迷宮是用于觀察大鼠空間記憶能力的常見手段[18]。本研究結果顯示，造模后抑郁組與越鞠丸組自主交替率、新異臂停留時間較正常組均減少，新異臂潛伏期延長，說明CUS刺激對大鼠的空間學習記憶功能造成了損傷。給藥后越鞠丸組大鼠在Y迷宮測試中的自主交替率、起始臂進入次數(shù)與總進臂次數(shù)均增加，說明越鞠丸可以緩解應激導致的空間學習記憶障礙，與其他研究[5,19]中發(fā)現(xiàn)越鞠丸可以改善學習記憶損傷的作用結果一致。

Morris水迷宮實驗是一種經(jīng)典的評價動物空間學習記憶功能的方法[18]。本研究結果顯示，越鞠丸使抑郁樣行為模型大鼠在空間探索階段中穿越虛擬平臺次數(shù)增加、目標象限停留時間延長，說明越鞠丸增強了抑郁樣行為模型大鼠的空間記憶能力。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)越鞠丸在改善CUS大鼠抑郁樣行為的同時也改善了應激導致的抑郁模型大鼠學習記憶的損傷，提示處理抑郁情緒與學習記憶能力的神經(jīng)環(huán)路有交叉共享的可能，為未來研究治療學習記憶障礙的抗抑郁中藥提供了實驗依據(jù)。