姚蕓霞 王中華

（1.西藏大學醫(yī)學院；2.西藏自治區(qū)人民醫(yī)院，西藏 拉薩 850000）

腸道菌群與人體的健康和疾病息息相關(guān)，腸道菌群紊亂會對人體免疫調(diào)節(jié)、消化吸收、能量代謝產(chǎn)生不利影響，如腸炎、肥胖癥、糖尿病、慢性腎功能不全、癌癥、動脈粥樣硬化、高血壓、血脂異常、心力衰竭及一些精神疾病等與腸道菌群及代謝產(chǎn)物的失調(diào)密切相關(guān)［1-7］。

我國是Hp 感染的高發(fā)國家，高原地區(qū)人群Hp 感染率比我國自然人群Hp 平均感染率(58.07%)略高［8］。高原地區(qū)Hp 高感染率可能有四個方面原因：一是與該地區(qū)人群長期居住在青藏高原高寒低氧環(huán)境中的高原習服有關(guān)；二是與高原地區(qū)藏族人群遺傳背景有關(guān)；三是高原地區(qū)生活條件、經(jīng)濟水平和衛(wèi)生條件相對較低；四是與高原地區(qū)人群飲食結(jié)構(gòu)有關(guān)，如飲食單一，主要以糌粑為主，且人們喜食風干生牛羊肉、好飲酒、酥油茶、酸奶等食物［9-10］。郭春亮等對拉薩市Hp 感染人群調(diào)查表明，就診人群Hp 感染率達到了59.4%，結(jié)果與自治區(qū)以往Hp感染流行病學調(diào)查結(jié)果相似，且藏族人群Hp 感染率(62.9%)高于漢族人群Hp感染率(57.9%)［12］。吳夢華等對長期在西藏居住的4332例Hp感染進行研究發(fā)現(xiàn)，Hp總感染率為61.9%，男性Hp感染率(63.7%)高于女性Hp感染率(59.9%)，同時發(fā)現(xiàn)西藏地區(qū)消化道相關(guān)疾病患者中，復合型潰瘍Hp檢測陽性率最高，高達89.4%［11］。

相關(guān)研究表明，在遺傳背景確定的前提下農(nóng)牧區(qū)的藏族人群腸道菌群與飲食結(jié)構(gòu)相關(guān)，漢族人群進入高原后，飲食結(jié)構(gòu)趨于藏族人群時，其腸道菌群結(jié)構(gòu)會趨于藏族人群腸道菌群結(jié)構(gòu)變化［13］。Pallav等研究發(fā)現(xiàn)人體腸道菌群的穩(wěn)定會受到抗生素阿莫西林影響［14］。Kleessen等人的研究中，長期生活在高原地區(qū)人群，腸道菌群會因缺氧等因素的影響下顯著改變，如大腸桿菌（Escherichia coli）等潛在致病菌增加，而阿托波氏菌屬（Atopobium）、遲緩埃格特菌屬（Escherichia）、紅蝽桿菌屬（Rhodobacterium）及雙歧桿菌屬（Bifidobacteriu）等益生菌減少［15］。Eun 等對慢性胃炎及腸上皮化生患者的腸道菌群研究發(fā)現(xiàn)，未感染Hp 人群與感染Hp人群腸道菌群之間有顯著差異［16］。國內(nèi)相關(guān)學者也對Hp 感染對腸道菌群多樣性結(jié)構(gòu)的影響進行了研究。董紅霞等研究發(fā)現(xiàn)，Hp 感染會導致患者腸道菌群中乳酸桿菌、雙歧桿菌等益生菌數(shù)量顯著下降，使得腸道內(nèi)益生菌的定植能力下降，同時大腸桿菌數(shù)量上升，大腸桿菌的感染風險也增加，PCR-DGGE 結(jié)果也顯示，Hp 感染人群腸道菌群多樣性和豐富度均低于Hp 陰性人群［17］。翁雅萍等研究發(fā)現(xiàn)，Hp 感染患者消化性潰瘍時，腸道菌群多樣性降低，抗Hp 治療會進一步導致腸道菌群多樣性下降，停藥4 周后腸道菌群有恢復趨勢［18］。高原地區(qū)人群感染Hp 后，人體腸道菌群是否會產(chǎn)生相應(yīng)的改變還未知。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

Hp 感染組：納 入2020 年8 月至2021 年8 月在西藏自治區(qū)人民醫(yī)院住院部進行檢查，經(jīng)13C 呼氣實驗確診為Hp 感染的患者，且近三個月未使用抗生素及PPI，對Hp感染進行糞便樣本采集。

健康組：納入2020 年8 月至2021 年8 月在西藏自治區(qū)人民醫(yī)院體檢中心進行13C 呼氣實驗，結(jié)果為陰性，近三個月未使用抗生素及PPI，無急、慢性心臟病，且肝腎功能正常，無其他消化系統(tǒng)等疾病，對Hp 陰性人群進行糞便樣本采集。

納入標準：年齡為≥18 歲且＜60 歲；性別：隨機抽樣，男女比例合適；民族：藏族；檢查：初次13C 呼氣實驗確診Hp感染、肝腎功能正常。

1.2 測序及分析

腸道細菌總DNA 采用SDS加酶法提取，細菌PCR擴增引物設(shè)計為：16SrDNA V3-V4 區(qū)338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)-806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。檢測合格的PCR 擴增產(chǎn)物利用Illumina HiSeq 平臺進行高通量測序（美吉）。數(shù)據(jù)利用R 軟件和SPSS 軟件進行分析，圖片用AI進行處理。

2 研究結(jié)果

2.1 測序結(jié)果

通過高容量測序共得到280629條序列，其中健康組共149703 條，Hp 感染組共130926 條，進過抽平后每個樣本的序列有142526 條，測序的平均覆蓋率(Coverage)為99.91%，說明測序基本覆蓋了樣本中的細菌菌群，測序比較完全。通過測序得到的細菌樣本序列，相比健康組，Hp 感染后，腸道細菌的數(shù)量會有所下降。Shannon多樣性分析表明(如圖1)，Hp感染明顯低于健康組，說明Hp 感染后，腸道細菌多樣性下降，腸道細菌菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了紊亂。

2.2 腸道細菌Bata多樣性統(tǒng)計分析

基于ANOSIM 組間差異檢驗的Bray-Curtis 距離算法，對健康組合Hp 感染組菌群組成進行NMDS 非度量多維尺度分析(non-metric multidimensional scaling)，結(jié)果表明，在門水平顯示(如圖2A)，NMDS 分析結(jié)果的優(yōu)劣(Stress＜0.05)，分析結(jié)果具有很好的代表性，門水平健康組置信區(qū)間較廣，菌門代表性最高，Hp感染組置信區(qū)間較窄，說明感染Hp 后，相比健康人群，腸道細菌菌門出現(xiàn)了下降；在屬水平顯示(如圖2B)，NMDS 分析結(jié)果的優(yōu)劣(Stress＜0.05)，分析結(jié)果是一個好的排序，屬水平Hp 感染組置信區(qū)間較大，菌屬種類最高，健康組置信區(qū)間較窄，說明Hp 感染之后，腸道菌群菌屬發(fā)生了紊亂，細菌菌屬增加。

2.3 腸道細菌結(jié)構(gòu)組成

在門水平的分析結(jié)果顯示(如圖3)，健康組注釋到的菌門包括Bacteroidota(65.86%)、Firmicutes(26.97%)、Actinobacteriota(5.45%)、Proteobacteria(1.34%)、Cyanobacteria(0.27%)、Verrucomicrobiota(0.08%)、Desulfobacterota(0.02%)，其中Bacteroidota、Firmicutes、Actinobacteriota和Proteobacteria是健康組的優(yōu)勢菌門。Hp 感染組注釋到的菌門包括：Bacteroidota(60.79%)、Firmicutes(33.95%)、Proteobacteria(3.31%)、Cyanobacteria(1.31%)、Actinobacteriota(0.51%)、Verrucomicrobiota(0.08%)、Desulfobacterota(0.03%)、Fusobacteriota(0.01%)、Campilobacterota(0.01%)，其中Bacteroidota和Firmicutes是Hp感染組的優(yōu)勢菌門。在菌門水平對比顯示，Hp 感染組Actinobacteriota 出現(xiàn)明顯下降，未注釋到的未知菌群有明顯上升。

在菌屬水平的分析結(jié)果顯示(如圖4)，健康組注釋到的菌門包括：Prevotella(47.73%)、Bacteroides(7.67%)、Bifidobacterium(5.30%)、Prevotellaceae(5.15%)、Faecalibacterium(2.81%)、Agathobacter(3.10%)、Alloprevotella(2.48%)、Megamonas(3.88%)、Roseburia(2.76%)、Sutterella(1.09%)、Ruminococcus(1.65%)、Parabacteroides(1.13%)、Muribaculaceae(1.01%)等，健康組的主要優(yōu)勢菌屬是Prevotella。Hp 感染組注釋到的菌門包括：Prevotella(33.52%)、Faecalibacterium(11.28%)、Bacteroides(9.22%)、Rikenellaceae_RC9_gut_group(6.48%)、f_Muribaculaceae(5.33%)、Agathobacter(2.74%)、Alloprevotella(2.04%)、Roseburia(0.96%)、Sutterella(1.67%)、Streptococcus(2.34%)、Alistipes(2.07%)、f_Eubacterium_coprostanoligenes_group(2.00%)、UCG -002(1.54%)、Blautia(1.28%)、o_Gastranaerophilales(1.29%)、o_Rhodospirillales(1.43%)、UCG-003(1.20%)等，Hp感染組主要優(yōu)勢菌屬是Prevotella和Faecalibacterium。在菌屬水平，Hp感染組各個菌屬平均相對豐度有不同程度降低，腸道菌群發(fā)生了紊亂。

2.4 腸道細菌差異菌群

在菌門和屬水平上通過單因素方差分析(Oneway ANOVA)，對腸道菌群樣本進行組間差異顯著性檢驗分析，同時對差異菌群進行post-hoc 檢驗分析發(fā)現(xiàn)，門水平上，健康組和Hp 感染組在Campilobacterota門存在顯著差異(圖5A)；屬水平上，健康組和Hp 感染組在Lachnoclostridium 和Senegalimassilia 存在顯著差異(P＜0.05)(圖5B)。

3 結(jié)論

在腸道菌群Shannon多樣性指數(shù)上，Hp 感染明顯低于健康組，Hp 感染后腸道細菌多樣性下降，菌門水平健康組置信區(qū)間較廣，Hp 感染組置信區(qū)間較窄，而在屬層面結(jié)果相反，說明Hp 感染后腸道細菌菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了紊亂；健康組優(yōu)勢菌門為Bacteroidota、Firmicutes、Actinobacteriota和Proteobacteria，優(yōu)勢菌屬為Prevotella，Hp感染組的優(yōu)勢菌門為Bacteroidota和Firmicutes，優(yōu)勢菌屬是Prevotella和Faecalibacterium，在菌門水平對比顯示，Hp感染組Actinobacteriota出現(xiàn)明顯下降，未注釋到的未知菌群有明顯上升，在菌屬水平，Hp感染組各個菌屬平均相對豐度有不同程度降低，腸道菌群發(fā)生了紊亂；健康組和Hp感染組在Campilobacterota菌門存在顯著差異(P＜0.05)，在Lachnoclostridium屬和Senegalimassi屬存在顯著差異(P＜0.05)。