黃彥臻 王何欣 吳超男 包立軍 蘇 超 錢永華

(西北農(nóng)林科技大學蠶桑絲綢研究所，陜西楊凌 712100)

桑椹在成熟的過程中易患菌核病，導致其品質(zhì)與產(chǎn)量下降。桑椹菌核病是一種土壤傳播的真菌病，在全國果桑種植基地均有不同程度發(fā)生，是影響桑果產(chǎn)量的第一大病害，其連年爆發(fā)，發(fā)病病勢猛、感染速度快且擴散范圍大，對果桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成非常大的危害[1]。目前，桑椹菌核病的防治主要以化學藥劑防治為主，使用最多的殺菌劑有多菌靈、甲基托布津等[2]。由于化學農(nóng)藥的長期使用，病原菌抗性逐漸增強，藥效降低，桑椹農(nóng)藥殘留增加[3]，環(huán)境污染加重。因此，利用生物防治桑椹菌核病越來越受到人們的重視[4]。

植物精油作為從植物中提取的天然有效物質(zhì)，許多種植物精油的優(yōu)異的抗菌能力已被證實。因其高效、低毒、環(huán)境友好等特點，將其作為植物源殺菌劑已成為當下的研究熱點[5]。植物精油作為一種新型的植物源殺菌劑，相較于傳統(tǒng)化學殺菌劑，其對人類和環(huán)境的風險更小，符合人們對綠色防控的需求，具有潛在的應用價值和廣闊的市場。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，八角茴香提取物和丁香酚能夠有效抑制桑椹菌核病病原生長[6-7]，本文擬對八角茴香精油和丁香精油的抑菌效果進行研究，考察其聯(lián)合抗菌作用，并進一步對其制劑進行田間防效試驗，以期為桑椹菌核病生物防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

桑實杯盤菌(Ciboriashiraiana)，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌株保藏編號CCTCC AF 2014019。

1.1.2 供試藥劑

八角茴香油、丁香油(上海源葉生物有限公司)；8%八角微乳、8%丁香微乳、6%丁香八角混合微乳(即8%八角ME、8%丁香ME、6%丁·八ME，西北農(nóng)林科技大學蠶桑絲綢研究所提供)；Tween-80(成都市科隆化學品有限公司)；PDA培養(yǎng)基(北京陸橋技術股份有限公司)；70%可濕性甲基托布津粉劑(山西上格之路生物科學有限公司)；50%多菌靈可濕性粉劑(四川潤爾科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 精油抑菌活性測定

供試樣品溶液的配置：丁香油、八角茴香油分別用1% Tween-80蒸餾水溶液溶解，采用二倍連續(xù)稀釋法配成不同質(zhì)量濃度的藥液。

試驗方法：吸取2 mL藥液，加入經(jīng)滅菌處理并冷卻至50 °C左右的18 mL培養(yǎng)基中，立即混勻并倒入無菌培養(yǎng)皿中。用6 mm打孔器在菌落邊緣菌絲生長茂盛處打孔，接種至加藥的PDA平板中央,于28 °C培養(yǎng)72～96 h。觀察抑菌情況,并采取十字交叉法測量抑菌圈直徑。以1% Tween-80蒸餾水溶液作為空白對照，重復3次，結(jié)果取平均值。

最小抑菌濃度(MIC)定義為完全沒有菌體生長的植物精油濃度。

1.2.2 精油復配的抑菌性能測定

以兩種抑菌劑的MIC值為基礎，配制一系列濃度的抑菌劑，即1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC，并將藥液進行兩兩聯(lián)合。采用菌絲生長速率法測得復配液的MIC值。以分級濃度抑制指數(shù)(fractional inhibitory concentration, FIC)作為判斷依據(jù)。

FIC=MICA(聯(lián)合)/MICA(單用)+MICB(聯(lián)合)/MICB(單用)

FIC的判斷標準為：當FIC ≤ 0.5時，兩種藥物之間起協(xié)同作用；當0.5< FIC ≤ 1.0，兩種藥物之間起相加作用；當1.0< FIC < 4.0，兩種藥物之間無相關作用；FIC ≥4.0時，兩種藥物起拮抗作用。通過FIC的判定標準，采用相加后FIC值最小的試驗藥物組合來計算藥物的最佳復配比。

1.2.3 不同藥物防治桑椹菌核病的田間試驗分析

試驗地：西北農(nóng)林科技大學楊凌農(nóng)業(yè)綜合試驗示范站，無核大十果桑品種，樹齡7 a，每667 m2栽植270株。

藥物設置：8%八角ME、8%丁香油ME、6%丁·八ME共3個植物源殺菌劑處理區(qū)，以實驗室實驗結(jié)果為參考分設3種濃度，設70%甲基托布津WP(粉劑)+50%多菌靈WP(粉劑)1 000倍液1個常規(guī)農(nóng)藥處理區(qū)，共10個處理區(qū)和1個清水對照(CK)區(qū)；每個小區(qū)5株桑樹，對桑樹常規(guī)噴藥，以葉面滴水為度，在桑椹收獲前30 d停止用藥。

噴藥時間與次數(shù)：于4月1日(萌芽期)、4月8日(初花期)、4月18日(盛花期)各噴藥1次，共用藥3次。

發(fā)病率調(diào)查：在桑植成熟期進行發(fā)病率調(diào)查，每處理桑樹按東、南、西、北、上五個方位取5枝桑條進行調(diào)查，共25個枝條。調(diào)查其病果數(shù)，計算發(fā)病率及防治效果。

發(fā)病率=病果粒數(shù)/總果粒數(shù)×100%

校正防效=[(對照區(qū)發(fā)病率-藥劑處理區(qū)發(fā)病率)/對照區(qū)發(fā)病率]×100%

采用最小顯著差異法(LSD)對各處理區(qū)的最終發(fā)病率進行方差分析。

1.2.4 農(nóng)藥殘留檢驗方法

在桑椹旺盛成熟期間，從常規(guī)農(nóng)藥處理區(qū)的每株桑樹上隨機選擇1個枝條，采摘成熟桑果收集保存。對其進行農(nóng)藥殘留量檢驗，50%多菌靈和70%甲基托布津成分按照 GB/T 20769- 2008《水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關化學品殘留量的測定：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》方法檢驗。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 23軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析與多重比較。所有結(jié)果均以“平均值±標準差”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 八角茴香油和丁香油對桑實杯盤菌的抑制效果

由表1可知，八角茴香油與丁香油均表現(xiàn)出良好的對核盤菌的抑制效果，并隨著濃度的增大抑制率逐漸增強。在同一試驗條件下，相同濃度的八角茴香油效果優(yōu)于丁香油。最小抑菌濃度(MIC)是指抗菌藥物能夠完全抑制菌體生長的最低濃度。當用質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的八角茴香油處理時，抑制率達到了100%，即八角茴香油的對核盤菌的MIC值為0.25 mg/mL。當丁香油質(zhì)量濃度增大到0.5 mg/mL時，其抑菌率為100%，即丁香油對核盤菌的MIC值為0.5 mg/mL。

表1 不同濃度八角茴香油和丁香油對桑實杯盤菌的抑菌率

2.2 精油復配的抑菌性能測定

將八角茴香油與丁香油的供試濃度兩兩組合復配，抑制效果見表2。MICA和MICB分別表示八角茴香油和丁香油對桑實杯盤菌的MIC值，結(jié)合兩者各自的最小抑菌濃度計算FIC值。由表可知，丁香油和八角茴香油復配后對核盤菌的最小抑菌濃度為1/2 MICB∶1/2 MICA，質(zhì)量比為2∶1，聯(lián)合使用后對核盤菌的抑菌效果為相加作用(FIC=1)。

表2 八角茴香油和丁香油復配物對桑實杯盤菌的抑制效果

2.3 田間藥效試驗

從表3可以看出，所有處理組均出現(xiàn)了發(fā)病現(xiàn)象，說明菌核病對桑椹危害十分普遍；同一生物制劑不同處理對桑椹菌核病的防效存在差異，濃度越大，防效越好。單一精油微乳處理組中，8%丁香微乳200倍液防治效果最差，矯正防效只有48.83%，八角微乳劑防治效果明顯優(yōu)于丁香微乳劑?；旌衔⑷閯┑男Ч驗闈舛鹊脑?，矯正防效最高，達85.38%，但在相同使用倍數(shù)下，與八角微乳無顯著性差異。

表3 不同藥劑組合對桑椹菌核病的防治效果

2.4 農(nóng)藥殘留檢驗

桑椹成熟期(藥后40 d)，采摘成熟桑果檢驗常規(guī)農(nóng)藥處理區(qū)內(nèi)農(nóng)藥成分的殘留量，并將檢驗結(jié)果與國家食品安全標準農(nóng)藥最大殘留限量[8]進行比對 (參照水果農(nóng)藥最大殘留限量標準)。結(jié)果顯示，50%多菌靈殘留量2.19 mg/kg，比國家標準0.5 mg/kg超標4.38倍。70%甲基托布津殘留量0.12 mg/kg，其殘留量應綜合考慮其降解產(chǎn)物多菌靈的殘留[9]，所以遠大于國家標準0.5 mg/kg。

3 小結(jié)與討論

本文探究了植物精油——八角茴香油和丁香油對桑椹菌核病病原菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)兩種精油均有很強的抑菌能力，其最小抑菌濃度八角茴香油為0.25 mg/mL，丁香油為0.5 mg/mL。當丁香油和八角茴香油以2∶1的質(zhì)量比復配時，對桑實杯盤菌的抑制表現(xiàn)出相加作用。

以實驗室試驗結(jié)果為參考，兩種植物精油為原料制成的植物源殺菌劑在田間防效試驗中也取得了良好的防治效果。試驗結(jié)果表明，8%八角ME 100倍液和6%丁·八ME 100倍液對菌核病的防治效果明顯高于70%甲基托布津WP+50%多菌靈WP 1 000倍液，對菌核病具有良好的防治效果。農(nóng)藥殘留檢驗結(jié)果表明，此區(qū)域常用農(nóng)藥50%多菌靈和70%甲基托布津的殘留量(參考水果農(nóng)藥最大殘留限量)高于國家標準。雖然目前還沒有桑椹相關的殘留限量標準且未見列入農(nóng)業(yè)監(jiān)管檢測對象，考慮到生產(chǎn)中存在的安全性風險，篩選新型的防治藥劑十分必要。