張顏 張文 張燕芳 周靜

(云南省第三人民醫(yī)院1.腎病科；2.消化內(nèi)科，云南 昆明 650118)

終末期腎病(End stage renal disease，ESRD)是各種原發(fā)性或繼發(fā)性腎臟疾病的終末階段[1]。在我國，該病患病率增長迅速[2]，ESRD已成為令人矚目的公共衛(wèi)生問題。微炎癥狀態(tài)是ESRD患者腎功能持續(xù)惡化的主力軍，當(dāng)前ESRD的治療主要依靠腎臟代替療法，雖然透析能一定程度上減輕患者微炎癥狀態(tài)，延長壽命，但不能從根本上治療腎臟病、完全代替腎臟的多種功能[3-4]，ESRD患者并不理想的預(yù)后迫使研究人員的眼光不斷向新的方向展望。人體腸道中生存著龐大的菌群，影響著機(jī)體多種生理活動(dòng)和許多疾病的發(fā)生發(fā)展[5]，其中許多機(jī)制并未完全明晰。近年來，不少研究表明益生菌制劑可降低慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)患者炎性因子水平和尿毒癥因子，延緩了疾病進(jìn)程[6-7]。但亦有學(xué)者認(rèn)為益生菌治療既不能改善包括ESRD的CKD患者腎功能，也不能降低尿酸、尿素、血肌酐及炎癥因子水平[8]，益生菌對ESRD患者的作用還需更多研究證實(shí)。雙歧桿菌制劑是臨床中最常用的益生菌之一，本研究旨在探索雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片對ESRD患者微炎癥狀態(tài)和腸道菌群的作用影響，為開辟治療新突破口提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年2月～2021年2月我院收治的180例ESRD患者作研究對象。根據(jù)就診順序奇偶數(shù)將奇數(shù)者納入觀察組，偶數(shù)者納入對照組，每組90例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者符合ESRD診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。②年齡>18歲。③自愿參與試驗(yàn)。④接受血液透析治療，透析時(shí)間>3個(gè)月，預(yù)計(jì)生存期>1年。⑤患者及家屬知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①酗酒、免疫性疾病、胃腸道手術(shù)史、慢性感染、炎癥性腸病、惡性腫瘤等影響腸道菌群者。②近期應(yīng)用抑酸劑、益生菌、抗生素、免疫抑制劑等藥物。③不規(guī)律治療者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 治療方案 兩組均積極治療原發(fā)病，控制血壓、蛋白尿、血糖，糾正水電解質(zhì)紊亂，限制蛋白攝入等。觀察組在此基礎(chǔ)上，口服雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片(國藥準(zhǔn)字S19980004，內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司，0.5 g/片)，3片/次，3次/d。

1.3 方法

1.3.1 觀察指標(biāo) 比較兩組治療前和治療后3個(gè)月的血漿生化指標(biāo)[血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、β2微球蛋白(β2-MG)、尿酸、甲狀旁腺激素(PTH)、血胱抑素C(Cys-C)]和炎癥因子[超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)]水平，以及糞便菌群豐富度、多樣性和組成。

1.3.2 糞便樣本采集 采集患者新鮮糞便5 g置于無菌冷凍試管中，1 h內(nèi)送檢，保存于-80℃冰箱中。

1.3.3 腸道菌群基因組DNA提取 應(yīng)用德國產(chǎn)Qiagen DNA提取試劑盒對糞便樣本進(jìn)行總DNA提取，操作遵說明書，經(jīng)過微生物細(xì)胞破碎、DNA抽提、純化提取出微生物DNA。

1.3.4 文庫構(gòu)建 提取糞便微生物總DNA后，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，引物末端添加測序接頭，行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行純化、定量、均一化建立測序文庫。應(yīng)用Qubit和Agilent 2100行文庫質(zhì)檢，對合格的文庫用Illumina Hiseq 2500平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。

1.3.5 16S rDNA高通量測序 在Hiseq上進(jìn)行簇生成和測序，對DNA樣本行16S rDNA V3V4區(qū)基因擴(kuò)增與測序，擴(kuò)增引物序列為5′-GTGTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′和5′-CCGGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 測序所得原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量控制測序接頭序列、低質(zhì)量序列、低復(fù)雜度序列，應(yīng)用重疊關(guān)系進(jìn)行序列拼接。去除嵌合體序列，應(yīng)用Usearch 10.0軟件在97%相似度下進(jìn)行聚類分析，得到操作分類單元(OTU)。在Greengene數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上對OTU代表序列行比對和物種注釋，獲取物種分類信息。根據(jù)OTU結(jié)果，對樣品微生物行α多樣性分析，得到樣品菌群豐富度和多樣性，前者通過Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)反映，后者通過Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)：可估計(jì)微生物物種OTU數(shù)目，二者數(shù)值越大，說明該物種OTU越多；Simpson指數(shù)：可定量描述一個(gè)區(qū)域的生物多樣性，指數(shù)越大，說明群落多樣性越高；Shannon指數(shù)：可估算樣本中微生物多樣性，指數(shù)越大說明群落多樣性越高。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 隨訪至2021年5月31號(hào)，觀察組和對照組分別有3例和5例失訪，最終分別納入87例和85例，兩組年齡、性別、原發(fā)病及合并癥及透析齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組治療前后血漿生化指標(biāo)比較 治療后，觀察組血漿BUN、SCr、β2-MG、尿酸、PTH、Cys-C水平與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后，兩組血漿上述指標(biāo)與治療前比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組治療前后血漿生化指標(biāo)比較

2.3 兩組治療前后微炎癥狀態(tài)比較 治療后，觀察組IL-6和TNF-α水平低于對照組，IL-10水平高于對照組(均P<0.05)，兩組其余指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后，觀察組IL-6和TNF-α水平低于治療前，IL-10水平高于治療前(均P<0.05)，兩組治療后其余指標(biāo)與治療前比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 兩組治療前后微炎癥狀態(tài)比較

2.4 兩組治療前后腸道菌群豐富度和多樣性比較 治療前，兩組Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后，觀察組Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數(shù)均高于治療前，且高于對照組治療后(均P<0.05)；對照組治療前后Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表4。

表4 兩組治療前后腸道菌群豐富度和多樣性比較

2.5 觀察組治療前后腸道菌群組成比較 16S rDNA測序結(jié)果顯示，觀察組治療前腸道菌群中擬桿菌屬(Bacteroides)、鏈球菌屬(Streptococcus)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、厭氧菌屬(Anaerotruncus)、梭桿菌門(Fusobacteria)為主要優(yōu)勢，而治療后觀察組以雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、普氏菌科(Prevotellaceae)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、糞桿菌屬(Feacalibacterium)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)為主要優(yōu)勢，見圖1。

圖1 兩組糞便菌群LDA值分布柱狀圖

3 討論

人體腸道中遍布著百億個(gè)微生物，它們的豐富度、組成和多樣性都影響著機(jī)體的代謝、免疫和消化吸收功能[10-11]，在機(jī)體罹患急慢性疾病時(shí)可發(fā)生不同程度的變化[12]。相關(guān)研究報(bào)道ESRD患者不論是否接受透析治療，都存在腸道菌群失調(diào)，導(dǎo)致致病菌增多、有害代謝產(chǎn)物蓄積，加速了腎臟疾病病程[13]。Briskey等[14]觀察到補(bǔ)充益生菌不僅能減少尿毒癥毒素，還能減輕全身微炎癥狀態(tài)，為ESRD患者健康助力。本研究基于此點(diǎn)，探討雙歧桿菌制劑對ESRD患者腸道菌群和炎癥因子水平的影響，為ESRD患者行益生菌治療的有效性增添佐證。

韓文貝等[15]報(bào)道雙歧桿菌可從多種途徑改善CKD患者腎功能。本研究中，治療后觀察組血漿BUN、SCr、β2-MG、尿酸、PTH、Cys-C水平與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明雙歧桿菌制劑對ESRD患者腎功能等生化指標(biāo)水平無明顯影響效果，這可能與ESRD患者病情較重以及不同研究納入標(biāo)準(zhǔn)不一有關(guān)，類似的結(jié)論在Shariaty等[16]學(xué)者研究中亦有報(bào)道。

ESRD患者普遍存在腸道菌群紊亂[17]。本研究結(jié)果顯示，治療后，觀察組Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數(shù)均高于對照組，觀察組以雙歧桿菌屬、普氏菌科、乳酸桿菌屬為主要優(yōu)勢。Alpha多樣性分析是評估微生物多樣性的常用方法，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)常用于描述菌群豐度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)常用于評價(jià)菌群多樣性。ESRD患者由于消化道功能減退和抗生素頻繁使用等原因造成菌群多樣性降低、益生菌菌群占比減少。而在本研究中，應(yīng)用雙歧桿菌制劑的ESRD患者腸道菌群組成發(fā)生改變，菌群豐富度和多樣性提高，這可能是由于益生菌菌群的增多所致。益生菌的增多能改變腸道微生態(tài)環(huán)境，限制致病菌繁殖，繼而減少致病菌產(chǎn)生的能激活腸黏膜免疫系統(tǒng)的腸源性尿毒素[18]。同時(shí)，雙歧桿菌制劑中的雙歧桿菌參與組成抑制致病菌易位的腸黏膜生物屏障[19]，乳酸桿菌能降低血清中胺類、硫酸吲哚酚、甲酚等尿毒癥毒素水平，進(jìn)而減輕微炎癥狀態(tài)[20]，這些功能一定程度上能助力患者健康。

微炎癥狀態(tài)與ESRD患者發(fā)生心血管事件、認(rèn)知功能障礙、腦血管并發(fā)癥等不良臨床結(jié)局相關(guān)，是患者病死率升高的重要原因之一[21]。IL-6和TNF-α水平能有效反映微炎癥狀態(tài)[22-23]，而IL-10是反向調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，可抑制前兩者的作用。本研究中，治療后觀察組IL-6和TNF-α水平低于對照組，IL-10水平高于對照組。雙歧桿菌制劑能調(diào)節(jié)ESRD患者炎性因子水平，減輕微炎癥狀態(tài)，這可能是由于益生菌的細(xì)胞功能和產(chǎn)物影響著機(jī)體多條代謝通路[14]，間接影響了免疫系統(tǒng)的功能。ESRD患者腸道中有益細(xì)菌減少，有害菌群的增多改變了腸道黏膜功能、促進(jìn)致病菌易位，同時(shí)還導(dǎo)致腸源性尿毒素增多，進(jìn)一步加劇微炎癥狀態(tài)、損傷殘余腎功能[24-26]。而雙歧桿菌制劑能提升腸道有益菌含量，緩解微炎癥，阻礙了腎功能減退和腸道菌群紊亂之間的惡性循環(huán)。金曉倩[27]報(bào)道在接受血液透析治療的ESRD患者中，雙歧桿菌、糞桿菌、乳桿菌與血清IL-6和TNF-α水平呈負(fù)相關(guān)。該結(jié)果支持了本文結(jié)論，但該試驗(yàn)研究方法與本文不同，本研究未探索不同菌種與炎性因子的相關(guān)性，這也是后續(xù)進(jìn)一步的研究方向。

4 結(jié)論

雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片能改善ESRD患者的腸道微生態(tài)環(huán)境，減輕微炎癥狀態(tài)，未來可能成為延緩CKD進(jìn)展的新興著手方向。但本研究存在不足之處，未探討雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片對ESRD患者微炎癥狀態(tài)作用的具體機(jī)制，后期有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本并豐富研究內(nèi)容。