王詩(shī)，李杰，劉垠杏，張書萌，陳子君，陳伶利，2

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合病原生物學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208

冠心病的主要病因是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化致血管腔狹窄，繼而心肌缺血，是多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家的主要致死原因之一，在發(fā)展中國(guó)家也呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。血瘀證是冠心病臨床上最常見(jiàn)的證型。自2017年“心-腸軸”概念提出后，腸道菌群成為研究心血管疾病與腸道關(guān)聯(lián)性的新靶點(diǎn)。研究表明，冠心病與腸道菌群密切相關(guān)，冠心病的危險(xiǎn)因素如高血壓、高血脂等與也腸道菌群關(guān)系密切。

腸道菌群定植于腸道黏膜內(nèi)，構(gòu)成腸黏膜屏障，與機(jī)體多種代謝產(chǎn)物發(fā)生生化作用。目前許多研究直接收集新鮮糞便或腸道內(nèi)容物進(jìn)行腸道菌群檢測(cè)，然而兩者并不能直接反映腸道菌群結(jié)構(gòu)，且有研究表明，糞便菌群結(jié)構(gòu)與胃腸道菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異，且糞便菌群極易受飲食影響，相較糞便菌群，腸道黏膜菌群能夠更真實(shí)地反映機(jī)體腸道微生物特征。

養(yǎng)心通脈方由國(guó)家級(jí)中醫(yī)藥名師袁肇凱教授在中醫(yī)學(xué)家秦伯未先生臨證經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上化裁而成。臨床研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)心通脈方可顯著改善冠心病心絞痛患者心功能和血流動(dòng)力學(xué)，降低血脂、血糖。本研究采用16S rRNA測(cè)序技術(shù)分析冠心病血瘀證大鼠小腸黏膜菌群特點(diǎn)，采用透射電鏡及Western blot觀察大鼠回腸組織緊密連接變化，探討?zhàn)B心通脈方對(duì)冠心病血瘀證大鼠腸道菌群的影響及其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

6～8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠95只，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)430727201101154332。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)動(dòng)物房，溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（50±5）%，明暗周期12 h，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（湘）2019-0009。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（XMBH-201907230005）。大鼠高脂飼料（81.3%基礎(chǔ)飼料、3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%白糖、10%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶），購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 藥物

養(yǎng)心通脈方（人參10 g，丹參10 g，桂枝10 g，枳實(shí)10 g，澤瀉10 g），飲片購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，加水煎煮2次，第一次加8倍量水煎煮45 min，第二次加4倍量水煎煮30 min，合并2次煎液，濃縮至原藥材濃度為2 g/mL 溶液。阿托伐他汀鈣片，批號(hào)210823，北京嘉林藥業(yè)股份有限公司，用蒸餾水配制成濃度為0.4 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

維生素D3（批號(hào)J14O10R99577，上海源葉生物科技有限公司），鹽酸異丙腎上腺素（批號(hào)Z21N10X10 3254，上海源葉生物科技有限公司），Occludin、GAPDH兔多克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（貨號(hào)分別為13409-1-AP、10494-1-AP、SA00001-2，美國(guó)Proteintech公司），糞便基因組DNA提取試劑盒（貨號(hào)DP328，北京天根生化科技有限公司）。HS-3345全自動(dòng)組織切片機(jī)（金華市華速科技有限公司），EM UC7超薄切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司），HT7700透射電鏡（日本日立高新技術(shù)公司），電泳儀（美國(guó)伯樂(lè)公司），ChemiDoC XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模

95只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組12只和造模組83只。采用病證結(jié)合造模法，參照課題組前期方法，造模組于造模第1、3日灌胃0.5 g/mL維生素D3溶液3 g/kg，造模第5日再灌胃維生素D3溶液2 g/kg。高脂飼料喂養(yǎng)12周后，連續(xù)2 d（間隔24 h）皮下注射異丙腎上腺素30 mg/kg。繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)2周后進(jìn)行心電圖檢測(cè)，隨機(jī)從正常組抽取4只、造模組抽取8只進(jìn)行血液流變學(xué)檢測(cè)，異常則提示血瘀證造模成功，心電圖出現(xiàn)ST段抬高提示冠心病造模成功。

2.2 分組與給藥

從造模組大鼠中篩選出48只具有顯著冠心病心電圖特征的大鼠，將其中24只隨機(jī)分為模型組、養(yǎng)心通脈方組和阿托伐他汀組，每組8只。養(yǎng)心通脈方組予養(yǎng)心通脈方溶液18 g/kg灌胃，阿托伐他汀組予阿托伐他汀溶液1.8 mg/kg灌胃，正常組和模型組予蒸餾水4 mL/kg灌胃，連續(xù)2周，并繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。剩余24只大鼠用于糞菌移植實(shí)驗(yàn)。

2.3 糞菌移植實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[13]方法，自藥物干預(yù)第6日起，每日收集各組大鼠新鮮糞便5 g，置于-80 ℃冰箱保存。使用時(shí)加入25 mL無(wú)菌生理鹽水，攪拌均勻后，濾網(wǎng)（270目）過(guò)濾，3 000 r/min離心15 min，棄去上清液，沉淀用25 mL生理鹽水重懸，即得糞菌液（0.2 g/mL）。將剩余24只造模大鼠隨機(jī)分為正常大鼠糞菌移植組、模型大鼠糞菌移植組和養(yǎng)心通脈方大鼠糞菌移植組，每組8只，分別予正常組大鼠糞菌液、模型組大鼠糞菌液、養(yǎng)心通脈方組大鼠糞菌液1 g/kg灌胃，連續(xù)2周，并繼續(xù)予高脂飼料喂養(yǎng)。

2.4 取材

干預(yù)結(jié)束后，大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/kg）麻醉大鼠，無(wú)菌條件下打開(kāi)大鼠腹腔，自回盲瓣向上取回腸組織約8 cm，無(wú)菌PBS緩沖液清洗，迅速置于干冰中速凍，轉(zhuǎn)至-80 ℃超低溫冰箱中保存。每組隨機(jī)選取3只大鼠，剪開(kāi)大鼠胸腔，剪取完整心臟，生理鹽水沖洗后，置于4%多聚甲醛中固定。

2.5 冠狀動(dòng)脈組織病理觀察

4%多聚甲醛固定心臟組織48 h，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色后顯微鏡下觀察冠狀動(dòng)脈病理變化。采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，依據(jù)美國(guó)心臟協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊百分比（斑塊總面積÷血管總截面積×100%，斑塊總面積為血管內(nèi)膜到中膜彈力層的范圍）。

2.6 回腸黏膜菌群16S rRNA測(cè)序及生物信息分析

從冰箱中取出回腸組織，解凍后用無(wú)菌蓋玻片刮取附著在回腸黏膜表面的細(xì)菌，按照糞便基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書操作，提取DNA，液氮速凍后轉(zhuǎn)至-80 ℃超低溫冰箱保存，用于16S rRNA測(cè)序。采用Illumina NovaSeq平臺(tái)對(duì)測(cè)序樣本進(jìn)行雙端測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)分析使用QIIME2 軟件，使用QIIME2 推薦的DADA2 方法去噪去嵌合，選取OTU 的代表性序列，與微生物物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)Greengenes Database 13_8比對(duì)獲得物種注釋信息。

2.7 回腸組織電鏡觀察

低溫下將回腸組織切成1～2 m小塊，置于2.5%戊二醛溶液中固定4 h，梯度乙醇脫水，丙酮-812包埋劑（2∶1）滲透過(guò)夜，純812包埋劑包埋8 h，超薄切片機(jī)切片（厚度60～80 nm），2%醋酸鈾和枸櫞酸鉛各染色15 min，置于透射電鏡下觀察。

2.8 Western blot檢測(cè)

取適量回腸組織，加入裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min。蛋白上樣量100 μg，電泳，200 mA轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入Occludin（1∶1 000）、GAPDH（1∶8 000）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，滴加二抗（1∶8 000），37 ℃孵育1.5 h，TBST洗膜，凝膠成像儀中顯影，采用Image J軟件計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 養(yǎng)心通脈方對(duì)模型大鼠冠狀動(dòng)脈組織病理形態(tài)的影響

正常組大鼠冠狀動(dòng)脈組織形態(tài)完整，細(xì)胞排列規(guī)則，未見(jiàn)明顯病理改變；模型組大鼠冠狀動(dòng)脈組織內(nèi)膜增生，有纖維帽沉積并向管腔突起，管腔呈新月形狹窄，內(nèi)膜下有大量空泡狀噬脂細(xì)胞，病變累及中膜肌層組織；養(yǎng)心通脈方組大鼠冠狀動(dòng)脈組織內(nèi)膜結(jié)構(gòu)較完整，內(nèi)膜下沉積少量噬脂細(xì)胞，病變顯著改善；阿托伐他汀組大鼠冠狀動(dòng)脈組織管腔較狹窄，內(nèi)膜下可見(jiàn)明顯噬脂細(xì)胞沉積。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠冠狀動(dòng)脈組織形態(tài)（HE染色，×200）

與正常組比較，模型組大鼠冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊百分比顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，養(yǎng)心通脈方組大鼠冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊百分比顯著降低（＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊百分比比較（，%）

4.2 養(yǎng)心通脈方對(duì)模型大鼠腸道菌群的影響

4.2.1 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性包括豐富度指數(shù)Chao1和均勻度指數(shù)Shannon。與正常組比較，模型組大鼠腸道菌群Shannon顯著降低（＜0.05），Chao1有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；與模型組比較，養(yǎng)心通脈方組大鼠腸道菌群Chao1、Shannon顯著升高（＜0.05，＜0.01），阿托伐他汀組大鼠腸道菌群Shannon顯著升高（＜0.01），其余各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠腸道菌群Alpha多樣性比較（，每組8只）

4.2.2 Beta多樣性分析

Beta多樣性能反映各組之間菌群結(jié)構(gòu)的相似性和差異性，Unweighted Unifrac距離基于物種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，Bray Curtis距離僅考慮物種存在與否及其豐度，兩者是估算微生物群落樣本間距離的方法，樣本間相似性越高，距離數(shù)值越小。Unweighted Unifrac 和Bray Curtis距離可以用非度量多維尺度法（NMDS）和主坐標(biāo)分析（PCoA）在二維或三維空間進(jìn)行排序展示，體現(xiàn)菌群群落的空間分布。各組Unweighted Unifrac距離和Bray Curtis距離差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q＜0.05），提示各組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)有顯著差異，正常組和模型組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)差異較大，養(yǎng)心通脈方組與正常組腸道菌群結(jié)構(gòu)相似，與阿托伐他汀組菌群結(jié)構(gòu)也具有一定相似性。糞菌移植實(shí)驗(yàn)中，模型大鼠糞菌移植組與正常大鼠糞菌移植組腸道菌群結(jié)構(gòu)差異較大，養(yǎng)心通脈方糞菌移植組和正常大鼠糞菌移植組腸道菌群結(jié)構(gòu)相似。見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 各組大鼠腸道菌群NMDS分析

圖4 各組大鼠腸道菌群PCoA分析

4.2.3 菌群結(jié)構(gòu)分析

16S rRNA測(cè)序共獲得2 096 791條原始序列，去除原始序列中的非特異性擴(kuò)增片段和嵌合體后，每組獲得平均有效序列69 889～116 057 條，與Greengenes Database 13_8 數(shù)據(jù)庫(kù)比較，各組測(cè)序覆蓋率＞98%，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果可反映樣本的真實(shí)情況。門分類水平上豐度排名前3位是變形菌門Proteobacteria、厚壁菌門Firmicutes、酸桿菌門Acidobacteria。與正常組比較，模型組大鼠腸道菌群厚壁菌門Firmicutes豐度顯著降低（＜0.01），變形菌門Proteobacteria豐度顯著升高（＜0.01）。與模型組比較，阿托伐他汀組大鼠腸道菌群厚壁菌門豐度顯著升高（＜0.05），變形菌門豐度顯著降低（＜0.05）；養(yǎng)心通脈方組大鼠腸道菌群厚壁菌門豐度有升高趨勢(shì)，變形菌門豐度有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；正常大鼠糞菌移植組大鼠腸道菌群厚壁菌門豐度顯著升高（＜0.05），變形菌門豐度顯著降低（＜0.01），提示糞菌移植可以重塑冠心病血瘀證大鼠腸道菌群。屬水平上豐度排名前3位是羅爾斯通菌屬，未鑒別的消化鏈球菌科菌屬，未鑒別的梭菌目菌屬。見(jiàn)圖5、表2。

表2 各組大鼠腸道菌群相對(duì)豐度比較（，%）

圖5 各組大鼠腸道菌群物種分布

厚壁菌門/擬桿菌門（F/B）比值與腸道菌群穩(wěn)態(tài)有關(guān)，比值升高或降低表明腸道菌群失衡。與正常組比較，模型組大鼠腸道菌群F/B 比值顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，養(yǎng)心通脈方組和阿托伐他汀組大鼠腸道菌群F/B 比值升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；與模型大鼠糞菌移植組比較，養(yǎng)心通脈方糞菌移植組大鼠腸道菌群F/B比值升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。

4.2.4 差異物種篩選

LefSe分析可直接對(duì)不同組間樣品所有分類水平同時(shí)進(jìn)行差異分析，找出差異物種。LDA score越大，表示差異物種的影響越大。由圖6可見(jiàn)，LDA score＞2的差異物種共31種，致病菌變形菌門Proteobacteria對(duì)模型組有顯著影響（LDA score＞5.5），有益菌厚壁菌門Firmicutes對(duì)正常組有顯著影響（LDA score＞5.5），有益菌泉古菌門Crenarchaeota對(duì)養(yǎng)心通脈方組有顯著影響（LDA score＞4），有益菌乳桿菌科Lactobacillaceae對(duì)阿托伐他汀組有顯著影響（LDA score＞4.5）。各組特征菌群的分類水平所屬關(guān)系見(jiàn)圖7，可以推斷菌群的進(jìn)化關(guān)系。模型組目水平有嗜甲基菌目Methylophilales和甲基球菌目Methylococcales 2個(gè)物種，科水平有嗜甲基菌科Methylophilaceae等3個(gè)物種；養(yǎng)心通脈方組目水平有亞硝基球菌目Nitrososphaerales 1個(gè)物種，科水平有亞硝基球菌科Nitrososphaeraceae 1個(gè)物種。

圖6 各組大鼠腸道菌群LDA score分布

圖7 各組大鼠腸道菌群環(huán)形進(jìn)化圖

4.3 養(yǎng)心通脈方對(duì)模型大鼠回腸組織超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡觀察顯示，正常組大鼠回腸組織緊密連接，橋粒結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)完整，微絨毛排列密集整齊；模型組大鼠回腸組織緊密連接減少，結(jié)構(gòu)模糊不清，橋粒數(shù)量減少，微絨毛排列稀疏；養(yǎng)心通脈方組和阿托伐他汀組大鼠回腸組織緊密連接有所改善，結(jié)構(gòu)較清晰，橋粒數(shù)量增多。見(jiàn)圖8。

圖8 各組大鼠回腸組織超微結(jié)構(gòu)

4.4 養(yǎng)心通脈方對(duì)模型大鼠回腸組織Occludin 蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠回腸組織Occludin蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，養(yǎng)心通脈方組和阿托伐他汀組大鼠回腸組織Occludin蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.05，＜0.01），提示養(yǎng)心通脈方可以重建回腸屏障功能。見(jiàn)圖9、表3。

圖9 各組大鼠回腸組織Occludin蛋白免疫印跡

表3 各組大鼠回腸組織Occludin蛋白表達(dá)比較（）

5 討論

冠心病屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”“真心痛”范疇目前西醫(yī)治療冠心病主要采用鈣通道拮抗劑、硝酸酯類、β-腎上腺素受體阻滯劑、抗血小板藥物、降脂類藥物（阿托伐他汀），但長(zhǎng)期服用會(huì)導(dǎo)致不良反應(yīng)。老年冠心病患者經(jīng)介入治療，術(shù)后5年內(nèi)生存率僅70%。養(yǎng)心通脈方以“扶養(yǎng)心氣，疏通血脈”為基本治法，方中人參補(bǔ)益心氣，丹參行氣活血、化瘀通脈，桂枝助陽(yáng)化氣、溫通血脈、理氣活血，枳實(shí)理氣消痰，澤瀉利水補(bǔ)陰。全方標(biāo)本兼治、通補(bǔ)兼施，共奏補(bǔ)氣益氣、養(yǎng)陰生津、養(yǎng)心通脈、活血化瘀功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，人參主要活性成分人參皂苷類具有抗氧化、抑制血栓形成、抑制炎癥反應(yīng)等作用；丹參主要活性成分丹參酮類和丹酚酸類具有抗血小板聚集、抗氧化應(yīng)激、抗炎、降糖功效；枳實(shí)活性成分黃酮和揮發(fā)油類抗氧化能力極佳；澤瀉主要活性成分三萜類具有降脂、降糖功能。

本研究從冠心病血瘀證模型大鼠回腸黏膜菌群狀態(tài)出發(fā)，進(jìn)行藥物干預(yù)和糞菌移植實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，模型組大鼠腸道菌群有益菌厚壁菌門豐度減少，致病菌變形菌門豐度增加；養(yǎng)心通脈方組大鼠腸道菌群厚壁菌門豐度增加，變形菌門豐度減少，菌群結(jié)構(gòu)趨于正常，提示養(yǎng)心通脈方可能通過(guò)調(diào)節(jié)模型大鼠腸道菌群，恢復(fù)紊亂的腸道微生態(tài)，進(jìn)而治療冠心病血瘀證。

Occludin 蛋白通過(guò)招募閉鎖小帶蛋白-1（ZO-1）調(diào)節(jié)細(xì)胞之間連接，維持腸道屏障功能。研究表明，腸道菌群失調(diào)會(huì)導(dǎo)致Occludin蛋白表達(dá)下調(diào)。本研究中，養(yǎng)心通脈方能上調(diào)模型大鼠回腸組織Occludin蛋白表達(dá)。透射電鏡觀察顯示，養(yǎng)心通脈方組回腸組織緊密連接較完整，橋粒數(shù)量增多，提示養(yǎng)心通脈方能夠改善腸道黏膜細(xì)胞間連接，修復(fù)腸道機(jī)械屏障功能。

本研究篩選出30余種差異腸道菌群，這些腸道菌群可能與疾病和中藥作用機(jī)制有緊密聯(lián)系，具有深入研究的意義和價(jià)值。本研究腸道菌群LDA score分布顯示，泉古菌門是養(yǎng)心通脈方組的優(yōu)勢(shì)菌群，目前泉古菌門與疾病之間的關(guān)聯(lián)還不明確，中藥、腸道菌群和冠心病三者之間相互聯(lián)系的靶點(diǎn)也尚不清楚，有待今后進(jìn)一步研究。