蔣木培，李影彤，張舒寧，趙晨惠，鐘先鋒，2，3，4，5，王阿利，2，3，4，5

1.佛山科學技術(shù)學院食品科學與工程學院，廣東佛山 528225；2.廣東省傳統(tǒng)發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528225；3.廣東省食品流通安全控制工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528225；4.佛山市釀造工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528225；5.佛山市農(nóng)業(yè)生物制造工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528225）

黑曲霉在適宜溫度、濕度等環(huán)境條件下易大量生長繁殖，引起果蔬［1］、糧食［2-3］、飼料［4］等腐敗變質(zhì)。尋找抑制黑曲霉生長的有效拮抗物質(zhì)或微生物已成為食品、飼料等行業(yè)保藏防腐研究的重要方向。乳酸菌普遍被認為是安全的功能性益生菌，其產(chǎn)生的有機酸［5］、脂肪酸［6］、酚類抗生素［4］、蛋白質(zhì)［7］等物質(zhì)對真菌具有較好的抑制作用，是一類重要的真菌拮抗劑。VALERIO 等［8］從意大利小麥粗面粉中分離的Leuconostoc citreumC 2-27、Lactobacillus rossiaeC 21-11、Weissella cibariaC 21-4 對黑曲霉的抑制率高達98%。QUATTRINI 等［9］研究的谷物源Lactobacillus plantarumITEM 17215 及其產(chǎn)生的苯甲酸、對羥基苯乳酸、3-苯乳酸、乳酸和乙酸等對黑曲霉生長具有協(xié)同抑制作用。乳酸菌是抑制黑曲霉生長潛在的優(yōu)良菌種資源，但作為生物拮抗劑應用時普遍存在不易保存、活性不穩(wěn)定等問題，挖掘高效且穩(wěn)定的抗黑曲霉乳酸菌拮抗劑，將在食品保藏防腐中具有重要意義。

本文以前期從醬油渣中分離鑒定的14 株乳酸菌為出發(fā)菌株［10-12］，擬篩選具有抑制黑曲霉生長作用的乳酸菌，并進一步研究菌株及其上清液在不同條件下抗菌活性的穩(wěn)定性，以期為抑制黑曲霉生長乳酸菌拮抗劑的研究及應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗菌株：本實驗室前期從醬油渣中篩選鑒定的14 株乳酸菌，分別是：副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）HT 51、HT 90、HT 111、HT 155、HT 158、HT 159、HT 160、HT 197、HT 253、HT 256；乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）HT 102、HT 127、HT 223、HT 227［10-12］。黑曲霉（Aspergillus nigerATCC 16404）購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

MRS 肉湯培養(yǎng)基、MRS 固體培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸，天津市大茂化學試劑廠；甘油，廣州化學試劑廠；胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EPOCH2 酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；SW-CJ-1FD 超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ME104 電子分析天平，梅特勒-托利多精密儀器（上海）有限公司廣州分公司；MS-01H 磁力攪拌器，美國精騏有限公司；LRH-150 生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器；Allegra 64R 冷凍高速離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；GR60DA 全自動滅菌鍋，致微（廈門）儀器；BCD-189WDPV 防凍霜冰箱，青島海爾股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌發(fā)酵上清液的制備

根據(jù)文獻［13］方法，將培養(yǎng)48 h 的乳酸菌發(fā)酵液離心，取上清液，0.45 μm 濾膜過濾收集，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 黑曲霉孢子懸液的制備

根據(jù)文獻［14］方法，將黑曲霉孢子懸液離心，取上清液，滅菌紗布過濾，制成單孢子懸液，4 °C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 乳酸菌抑制黑曲霉生長活性測定

乳酸菌菌體抑制黑曲霉生長活性測定：根據(jù)文獻［15］方法，取5 mL 混有黑曲霉孢子懸液的PDA培養(yǎng)基傾倒至MRS 培養(yǎng)基上，待凝固后，28 ℃培養(yǎng)48 h。觀察乳酸菌周圍是否有黑曲霉生長。

乳酸菌發(fā)酵上清液抑制黑曲霉生長活性測定：根據(jù)文獻［16］方法，取黑曲霉孢子懸液添加到含乳酸菌發(fā)酵上清液的96 孔無菌培養(yǎng)板中，28 ℃培養(yǎng)48 h，測定OD600nm值，計算抑菌率。抑菌率為

式中，ODLAB表示孢子懸液在乳酸菌發(fā)酵上清液中培養(yǎng)48 h 后的OD600nm；ODLAB*表示孢子懸液在乳酸菌發(fā)酵上清液中起始的OD600nm；ODcontrol表示孢子懸液在MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h 后的ODcontrol；ODcontrol*表示孢子懸液在MRS 培養(yǎng)基中起始的OD600nm。

1.3.4 pH 對乳酸菌發(fā)酵上清液抑制黑曲霉生長活性的影響

將乳酸菌發(fā)酵上清液pH 值，分別調(diào)至3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.0 和7.5，比較不同pH 處理后乳酸菌發(fā)酵上清液對黑曲霉生長的抑制作用。

1.3.5 溫度對乳酸菌發(fā)酵上清液抑制黑曲霉生長活性的影響

將乳酸菌發(fā)酵上清液分別經(jīng)50 ℃、80 ℃、100 ℃、121 ℃處理30 min，比較不同溫度處理后乳酸菌發(fā)酵上清液對黑曲霉生長的抑制作用。

1.3.6 蛋白酶對乳酸菌發(fā)酵上清液抑制黑曲霉生長活性的影響

將乳酸菌發(fā)酵上清液調(diào)至最適pH，并分別加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶室溫處理4 h，比較經(jīng)不同蛋白酶處理后樣品對黑曲霉生長的抑制作用。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 25.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行一般線性模型的單變量分析，采用origin 2021 軟件進行繪圖。本研究所有實驗重復3 次及以上，數(shù)據(jù)表現(xiàn)形式為：平均值±標準偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑制黑曲霉生長的乳酸菌篩選

2.1.1 乳酸菌菌體對黑曲霉生長活性的影響

采用雙層平板拮抗法，篩選對黑曲霉生長抑制效果較好的菌株，結(jié)果如表1 所示。抑菌活性較強的菌株為乳酸乳球菌HT 223 和HT227，平板上無黑曲霉生長；抑菌活性中等的菌株為：副干酪乳桿菌HT 155、HT 158、HT 159、HT 253，黑曲霉生長較少；抑菌活性弱的菌株為：乳酸乳球菌HT 102 和副干酪乳桿菌HT 51、HT 160、HT 256，黑曲霉生長明顯，且與乳酸菌分界模糊；無抑菌活性的菌株為：乳酸乳球菌HT 127 和副干酪乳桿菌HT 90、HT 111、HT 197，黑曲霉生長旺盛，無法看出乳酸菌生長區(qū)域。結(jié)果表明醬油渣源乳酸乳球菌和副干酪乳桿菌具有一定的抗黑曲霉活性。賈俊偉［17］采用雙層平板拮抗法和牛津杯法從自制奶豆腐中篩選出2 株抗黑曲霉的副干酪乳桿菌N 17 和N 29，與本研究結(jié)果相近。

表1 乳酸菌對黑曲霉的抑菌效果

2.1.2 乳酸菌發(fā)酵上清液對黑曲霉生長活性的影響

采用96 孔板法測定14 株乳酸菌發(fā)酵上清液對黑曲霉的抑菌效果，結(jié)果如表2 所示。14 株乳酸菌發(fā)酵上清液對黑曲霉的抑制率為74%～88%。其中乳酸乳球菌HT 223 對黑曲霉生長的抑制作用最強，副干酪乳桿菌HT 51 和159 次之。結(jié)合乳酸菌菌體對黑曲霉生長的抑制結(jié)果，篩選出乳酸乳球菌HT 223 的菌體和發(fā)酵上清液對黑曲霉抑制作用最好，可進一步研究該菌株發(fā)酵上清液的抑菌穩(wěn)定性。

表2 乳酸菌發(fā)酵上清液對黑曲霉的抑菌率

2.2 乳酸乳球菌HT 223 發(fā)酵上清液抑制黑曲霉生長的穩(wěn)定性

2.2.1 pH 對乳酸乳球菌HT 223 發(fā)酵上清液抑菌效果的影響

研究證實乳酸菌代謝形成的酸性環(huán)境有助于抑菌活性物質(zhì)發(fā)揮抑制作用［18］。乳酸乳球菌HT 223發(fā)酵上清液抑菌活性對pH 的敏感性如圖1 所示。菌株HT 223 對黑曲霉的抑菌率隨pH 升高而降低，且發(fā)酵上清液抑菌活性在pH 3.5～5.5 環(huán)境下耐受性較強，抑菌率均大于70 %，但在pH 6.0～7.5 環(huán)境下的抑制作用顯著下降（P＜0.05）。結(jié)果表明，乳酸乳球菌HT 223 發(fā)酵上清液在酸性條件下（pH 3.5～5.5），對黑曲霉的抑菌活性穩(wěn)定。OLASUPO 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，從乳制品中分離出的乳酸乳球菌BFE 1500 的抑菌活性物質(zhì)在低pH（2～4）環(huán)境下具有最高活性，且穩(wěn)定性較好，與本研究結(jié)果相近。

圖1 pH 對乳酸乳球菌HT 223 發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

2.2.2 溫度對乳酸乳球菌HT 223 發(fā)酵上清液抑菌效果的影響

溫度是影響乳酸菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的重要因素［20］。菌株HT 223 發(fā)酵上清液經(jīng)不同溫度處理后，對黑曲霉抑菌效果的變化情況如圖2 所示。當發(fā)酵上清液經(jīng)50 °C、80 °C、100 °C 處理后，菌株HT 223 的抑菌率仍保持在88 %左右，經(jīng)121 °C 處理后，抑菌率僅降低了2.96 %。不同溫度處理與對照組相比，發(fā)酵上清液對黑曲霉的抑制活性無顯著變化（P＞0.05），表明乳酸乳球菌HT 223 中抑菌物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性。這一結(jié)果與BARMAN 等［21］研究自制酪乳源乳酸乳球菌霍氏亞種LABW1、LABW3和乳酸乳球菌乳酸亞種LABW4 發(fā)酵上清液，經(jīng)121 ℃處理15 min 后抑菌物質(zhì)保持穩(wěn)定的結(jié)果一致。

圖2 溫度對乳酸乳球菌HT 223 發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

2.2.3 蛋白酶對乳酸乳球菌HT 223 發(fā)酵上清液抑菌效果的影響

乳酸菌可產(chǎn)生蛋白質(zhì)類物質(zhì)來抑制真菌的生長［22］，本文研究了不同蛋白酶（胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶）處理對乳酸乳球菌HT 223 發(fā)酵上清液中抑菌活性物質(zhì)的影響，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)胃蛋白酶處理后，菌株HT 223 發(fā)酵上清液的抑菌活性無顯著變化（P＞0.05）；經(jīng)胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶處理后，抑菌率顯著下降（P＜0.05）。結(jié)果表明，乳酸乳球菌HT 223 發(fā)酵上清液抑菌活性對胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶敏感。推測菌株中的抑菌物質(zhì)易被這些蛋白酶降解，通過改變蛋白質(zhì)功能特性而導致抑菌活性喪失［23］。GOYAL 等［24］研究了乳制品源乳酸乳球菌乳酸亞種63 發(fā)酵上清液中的抑菌活性物質(zhì)經(jīng)木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶處理后，抑菌活性顯著下降，甚至喪失全部活性。本研究結(jié)果與其相似，但經(jīng)胃蛋白酶處理后抑菌活性差異較大，推測與胃蛋白酶的來源有關(guān)，胃蛋白酶生產(chǎn)工藝不同，所生產(chǎn)胃蛋白酶的活力存在較大差異［25］。

圖3 蛋白酶對乳酸乳球菌HT 223 發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

3 結(jié)論

本研究以實驗室前期從醬油渣中分離得到的14 株乳酸菌為試驗菌株，采用雙層平板拮抗法和96孔板法篩選對黑曲霉具有良好抑制作用的乳酸菌，并從pH、溫度、蛋白酶處理條件下研究篩選菌株抑菌活性的穩(wěn)定性。結(jié)果表明：乳酸乳球菌HT 223 抑制效果最強，其發(fā)酵上清液抑菌率達到了88%；菌株HT 223 發(fā)酵上清液在pH 3.5～5.5 環(huán)境下抑菌活性穩(wěn)定；溫度對菌株發(fā)酵上清液抑菌效果無顯著影響；菌株發(fā)酵上清液對胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶敏感。綜上，乳酸乳球菌HT 223 對黑曲霉具有較好的抑制能力，發(fā)酵上清液的抑菌活性對酸和高溫具有較強的耐受性。菌株HT 223 可作為控制黑曲霉生物防霉劑的候選菌株，后續(xù)可研究菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)及其抑菌作用機理，為菌株應用于果蔬、糧食、飼料等生物防腐保藏提供科學依據(jù)。